专利名称：解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法。
背景技术：
抗菌蛋白表现出很强的抑菌活性，加之抗菌蛋白能够在细菌质膜上形成离子通道，破坏膜势，引起胞内物质泄漏而杀死细菌，因此不易产生耐药性和交叉抗性，已成为新型生物农药的主要研究方向。虽然许多生防微生物都能分泌抗菌蛋白，而且蛋白质的分离纯化方法也已经发展得较为完善，但由于菌株不同，其抗菌蛋白的性质迥异，纯化方法也各有差异。解淀粉芽孢杆菌TM8 (Bacillus amyloliquefaciens TF28)属于芽孢杆菌属， 其保藏编号为CGMCC No.4038，保藏日期为2010年7月沈日。解淀粉芽孢杆菌TM8 已在中国发明专利申请“防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌及其应用”(专利公开号为 CN101948771A，
公开日为2011年01月19日)中公布。解淀粉芽孢杆菌TM8可同时产生抗菌蛋白和脂肽类抗生素两种抗菌物质，但采用现有蛋白质的分离纯化方法无法获得高纯度的解淀粉芽孢杆菌TM8抗菌蛋白，杂质蛋白多，而且抗菌蛋白收率低。
发明内容
本发明要解决现有蛋白质的分离纯化方法无法获得高纯度的解淀粉芽孢杆菌 TF28抗菌蛋白、杂质蛋白多和抗菌蛋白收率低的问题，而提供的一种解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法。本发明解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白按以下步骤进行分离纯化一、取解淀粉芽孢杆菌TM8发酵液的上清液，向上清液中加入固体硫酸铵，至硫酸铵浓度为20%饱和度，然后4°C条件下静置2h，再以6000r/min的速度离心30min，收集离心上清液，向离心上清液中加入固体硫酸铵，至硫酸铵浓度为40%饱和度，收集沉淀，将沉淀溶解在浓度为0. 02mol/L、pH值为6. 8的磷酸缓冲液中透析并浓缩，得到抗菌蛋白粗提物；二、室温下用AKTApurifier液相色谱系统进行Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，载样缓冲液流速为0. 5mL/min，基线走平后上样，待流出峰出现且UV-900紫外光检测值接近基线进行阶梯式梯度洗脱，收集第二个洗脱峰并超滤浓缩，获得浓缩蛋白；三、室温下用AKTApurifier液相色谱系统进行Superdex 75分子筛凝胶过滤层析， 上样缓冲液流速为0. 4mL/min,基线走平后上样，收集第一个吸收峰，得到解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白；步骤二中上样样品为抗菌蛋白粗提物；步骤二中的载样缓冲液是PH值为7. 6、 浓度为0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液；步骤二中阶梯式梯度洗脱选用pH值为7. 6的 Tris-NaCl缓冲液作为洗脱缓冲液，洗脱缓冲液中Tris浓度为0. 05mol/L，洗脱缓冲液中 NaCl浓度为2mol/L ；步骤二阶梯式梯度洗脱分三次进行，第一次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为8 2，第二次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为6 4，第三次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为46；步骤三中上样样品为浓缩蛋白；步骤三中的上样缓冲液是含有NaCl、且PH值为 7. 0、浓度为0. 05mol/L的磷酸缓冲液，上样缓冲液中NaCl的浓度为0. 15mol/L。采用本发明解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法可以得到高纯度的解淀粉芽孢杆菌TM8抗菌蛋白，无杂质蛋白，该抗菌蛋白分子量为36. SkDa,对水稻恶苗病菌、黄瓜枯萎病菌、大豆根腐病菌、大豆立枯丝核病菌、大豆菌核病菌和西红柿灰霉病菌均有高抑菌活性。采用本发明方法解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的最终收率为55% 58%。
图1是具体实施方式
一解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白SDS-PAGE电泳检测结果图。图 2是具体实施方式
五步骤二 Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析图。图3是具体实施方式
五步骤三Superdex 75分子筛凝胶过滤层析图。图4是具体实施方式
五解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白高效液相色谱检测图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白按以下步骤进行分离纯化一、取解淀粉芽孢杆菌TM8发酵液的上清液，向上清液中加入固体硫酸铵，至硫酸铵浓度为20%饱和度，然后4°C条件下静置2h，再以6000r/min的速度离心30min，收集离心上清液，向离心上清液中加入固体硫酸铵，至硫酸铵浓度为40%饱和度，收集沉淀，将沉淀溶解在浓度为0. 02mol/L、pH值为6. 8的磷酸缓冲液中透析并浓缩，得到抗菌蛋白粗提物；二、室温下用AKTApurifier液相色谱系统进行Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，载样缓冲液流速为0. 5mL/min，基线走平后上样，待流出峰出现且UV-900紫外光检测值接近基线进行阶梯式梯度洗脱，收集第二个洗脱峰并超滤浓缩，获得浓缩蛋白；三、室温下用AKTApurifier液相色谱系统进行Superdex 75分子筛凝胶过滤层析， 上样缓冲液流速为0. 4mL/min,基线走平后上样，收集第一个吸收峰，得到解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白；步骤二中上样样品为抗菌蛋白粗提物；步骤二中的载样缓冲液是pH值为7. 6、 浓度为0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液；步骤二中阶梯式梯度洗脱选用pH值为7. 6的 Tris-NaCl缓冲液作为洗脱缓冲液，洗脱缓冲液中Tris浓度为0. 05mol/L，洗脱缓冲液中 NaCl浓度为2mol/L ；步骤二阶梯式梯度洗脱分三次进行，第一次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为8 2，第二次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为6 4，第三次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为46；步骤三中上样样品为浓缩蛋白；步骤三中的上样缓冲液是含有NaCl、且pH值为
47. 0、浓度为0. 05mol/L的磷酸缓冲液，上样缓冲液中NaCl的浓度为0. 15mol/L。本实施方式用饱和度为20%和40%的硫酸铵进行盐析，在保留解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白活性的前提下，减少了抗菌蛋白粗提物中杂质蛋白的种类和数量。本实施方式步骤二阶梯式梯度洗脱分三次进行，每次洗脱只出现一个洗脱峰。采用阶梯式梯度洗脱能够避免叠峰的出现，使极性相差不大的蛋白也能彻底分离。解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白SDS-PAGE电泳检测结果如图1所示，解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白条带清晰，分子量为36. SkDa0将水稻恶苗病菌、黄瓜枯萎病菌、大豆根腐病菌、大豆立枯丝核病菌、大豆菌核病菌和西红柿灰霉病菌菌块分别接种到PDA固体培养基平板中央，然后25°C条件下培养2 3天，菌落半径达到1 1. 5cm，再在距离菌落边缘0. 5cm的位置放入无菌滤纸片，并在无菌滤纸片上加10 μ L本实施方式获得的解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白(解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白浓度为138. 32 μ g/mL) 25°C培养4 后能够清楚的观察到每个PDA固体培养基上明显的抑菌圈。本实施方式获得的解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白对水稻恶苗病菌、黄瓜枯萎病菌、大豆根腐病菌、大豆立枯丝核病菌、大豆菌核病菌和西红柿灰霉病菌的抑菌圈直径都大于8. 7mm, 说明本实施方式获得的解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白对水稻恶苗病菌、黄瓜枯萎病菌、大豆根腐病菌、大豆立枯丝核病菌、大豆菌核病菌和西红柿灰霉病菌这些常见植物病菌均有高抑菌活性。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤二中手动上样，上样体积为100yL。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二的不同点是步骤三中手动上样，上样体积为lOOyL。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一、二或三的不同点是步骤一中发酵解淀粉芽孢杆菌TM8的液体培养基按8. Og牛肉膏、5. Og酵母膏、10. Og葡萄糖和 IOOOmL水的比例组成，pH值为7. 2。其它步骤及参数与实施方式一、二或三相同。
具体实施方式
五本实施方式解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白按以下步骤进行分离纯化一、取解淀粉芽孢杆菌TM8发酵液的上清液，向上清液中加入固体硫酸铵，至硫酸铵浓度为20%饱和度，然后4°C条件下静置2h，再以6000r/min的速度离心30min，收集离心上清液，向离心上清液中加入固体硫酸铵，至硫酸铵浓度为40%饱和度，收集沉淀，将沉淀溶解在浓度为0. 02mol/L、pH值为6. 8的磷酸缓冲液中透析并浓缩，得到抗菌蛋白粗提物；二、室温下用AKTApurifier液相色谱系统进行Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，载样缓冲液流速为0. 5mL/min,基线走平后手动上样，上样体积为100 μ L，待流出峰出现且UV-900紫外光检测值接近基线进行阶梯式梯度洗脱，收集第二个洗脱峰并超滤浓缩，获得浓缩蛋白；三、室温下用AKTApurifier液相色谱系统进行Superdex 75分子筛凝胶过滤层析， 上样缓冲液流速为0. 4mL/min,基线走平后手动上样，上样体积为100 μ L，收集第一个吸收峰，得到解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白；步骤二中上样样品为抗菌蛋白粗提物；步骤二中的载样缓冲液是pH值为7. 6、浓度为0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液；步骤二中阶梯式梯度洗脱选用pH值为7. 6的 Tris-NaCl缓冲液作为洗脱缓冲液，洗脱缓冲液中Tris浓度为0. 05mol/L，洗脱缓冲液中 NaCl浓度为2mol/L ；步骤二阶梯式梯度洗脱分三次进行，第一次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为8 2，第二次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为6 4，第三次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为46；步骤三中上样样品为浓缩蛋白；步骤三中的上样缓冲液是含有NaCl、且pH值为 7. 0、浓度为0. 05mol/L的磷酸缓冲液，上样缓冲液中NaCl的浓度为0. 15mol/L ；步骤一中发酵解淀粉芽孢杆菌TM8的液体培养基按8. Og牛肉膏、5. Og酵母膏、 10. Og葡萄糖和IOOOmL水的比例组成，pH值为7. 2。本实施方式步骤二 Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析图谱如图2所示，图 2中浅颜色曲线为紫外光检测值曲线，图2中深颜色曲线为电导率曲线。本实施方式步骤三Superdex 75分子筛凝胶过滤层析图谱如图3所示，图3中浅颜色曲线为紫外光检测值曲线。采用高效液相色谱检测本实施方式所得的到解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白，其结果如图4所示，说明本实施方式方法得到的解淀粉芽孢杆菌TM8抗菌蛋白纯度高，无杂质蛋白。本实施方式中使用蛋白定量试剂盒测定各个步骤的蛋白产量及收率，本实施方式最终收率为55.3%。
权利要求
1.解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白按以下步骤进行分离纯化一、取解淀粉芽孢杆菌TM8(Bacillus amyloliquefaciens TF28)发酵液的上清液， 向上清液中加入固体硫酸铵，至硫酸铵浓度为20%饱和度，然后4°C条件下静置2h，再以 6000r/min的速度离心30min，收集离心上清液，向离心上清液中加入固体硫酸铵，至硫酸铵浓度为40%饱和度，收集沉淀，将沉淀溶解在浓度为0. 02mol/L、pH值为6. 8的磷酸缓冲液中透析并浓缩，得到抗菌蛋白粗提物；二、室温下用AKTApurifier液相色谱系统进行QSepharose Fast Flow阴离子交换层析，载样缓冲液流速为0. 5mL/min，基线走平后上样，待流出峰出现且UV-900紫外光检测值接近基线进行阶梯式梯度洗脱，收集第二个洗脱峰并超滤浓缩，获得浓缩蛋白；三、室温下用AKTApurifier液相色谱系统进行Superdex75分子筛凝胶过滤层析，上样缓冲液流速为0. 4mL/min，基线走平后上样，收集第一个吸收峰，得到解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白；步骤二中上样样品为抗菌蛋白粗提物；步骤二中的载样缓冲液是PH值为7. 6、浓度为 0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液；步骤二中阶梯式梯度洗脱选用pH值为7. 6的Tris-NaCl 缓冲液作为洗脱缓冲液，洗脱缓冲液中iTris浓度为0. 05mol/L，洗脱缓冲液中NaCl浓度为 2mol/L ；步骤二阶梯式梯度洗脱分三次进行，第一次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为8 2，第二次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为6 4，第三次洗脱载样缓冲液与洗脱缓冲液的体积比为4 6；步骤三中上样样品为浓缩蛋白；步骤三中的上样缓冲液是含有NaCl、且pH值为7.0、浓度为0. 05mol/L的磷酸缓冲液，上样缓冲液中NaCl的浓度为0. 15mol/L。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于步骤三中手动上样，上样体积为100 μ L0
3.根据权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于步骤一中发酵解淀粉芽孢杆菌ΤΜ8的液体培养基按8.0g牛肉膏、5.0g酵母膏、lO.Og葡萄糖和IOOOmL水的比例组成，pH值为7. 2。
全文摘要
解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法，它涉及一种芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法。它解决了现有蛋白质的分离纯化方法无法获得高纯度的解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌蛋白、杂质蛋白多和抗菌蛋白收率低的问题。方法一、获得抗菌蛋白粗提物；二、阴离子交换层析获得浓缩蛋白；三、分子筛凝胶过滤层析，得到解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白。本发明用于解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化。
文档编号C07K1/18GK102153618SQ201110028639
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者孟利强, 张云湖, 张淑梅, 李晶, 王玉霞, 赵晓宇 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所