专利名称：基因载体系统及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基因载体系统及其制备方法。
背景技术：
随着生物科学技术的不断进步，基因治疗将在人类攻克癌症、遗传疾病等顽症的过程中占据重要地位，并将逐步成为一种常见的有效手段。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用， 从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。将基因物质导入细胞进行表达是实现基因治疗的关键步骤，成功的基因治疗依赖于有效的基因载体。常见的载体分为病毒类载体和非病毒载体，其中，病毒类载体包括逆转录病毒、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等，但是病毒类载体容易引起人体的免疫性反应，在临床应用中存在着较大的安全隐患。非病毒载体多为高分子阳离子聚合物，具有安全、有效、无免疫原性等优点，已成为基因载体的研究热点之一。阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)是非病毒类载体中受到关注最多的一个，它已经在体外和体内的转染实验中得到应用，但由于其毒性高、转染效率低、在体内运输过程的非特异性吸附以及没有靶向性的缺点，阻碍了其进一步发展。理想的基因治疗过程是载有质粒DNA的基因载体在血液中循环，到达肿瘤组织后被肿瘤细胞内吞并完成转染治疗，但实际过程中有诸多因素阻碍了基因载体系统到达肿瘤组织首先，血液中含有较多带负电的蛋白类物质，其可与带正电的载体吸附并凝聚成大颗粒沉淀，从而导致基因载体系统无法发挥作用；其次，正常体液环境中，细胞表面带负电荷，带正电的基因载体系统在静电作用下容易接近正常细胞，被正常细胞内吞，从而影响转染效率。为了提高基因载体体系进入目标组织细胞的效率，常用的方法包括以下几种(1) 引入遮蔽体系。遮蔽体系通常选用带负电的高分子材料，复合在基因载体体系表面，使整个基因载体系统带负电，避免在血液运输过程中的非特异性吸附，但是，单纯的遮蔽体系会影响基因载体与目标细胞组织的结合效率。( 引入靶向配体。在基因载体上引入对目标细胞具有特异性结合能力的靶向配体，如精甘天短肽(RGD短肽)、叶酸等，使基因载体系统具有靶向性，顺利达到目标组织细胞，但是，靶向配体无法阻止基因载体的非特异性吸附。⑶ 同时引入遮蔽体系和靶向配体，如申请号为200810050859.8的中国专利文献公开了一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统，包括由带含精甘天短肽的靶向配体和透明质酸分子连接组成的遮蔽体系、聚乙烯亚胺或聚乙烯亚胺-聚谷氨酸苄酯阳离子载体和质粒DNA。该含靶向遮蔽体系的基因载体系统虽然能够避免基因载体的非特异性吸附，也能够顺利达到目标组织细胞，但是，由于遮蔽体系表面所带的负电与细胞表面带负电荷会产生斥力，影响载体体系与目标细胞组织的结合效率依然较低，即其体内转染效率低。
发明内容
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有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基因载体系统及其制备方法， 本发明提供的基因载体系统细胞毒性小、转染效率高。本发明提供了一种基因载体系统，包括pH值敏感材料，所述pH值敏感材料为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为低聚磺胺，或者为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物，其中，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为 600 10000，所述聚赖氨酸的分子量为1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000，所述聚乙二醇的分子量为1000 10000，所述低聚磺胺的分子量为1000 5000 ；由基因载体和基因物质组成的复合物，所述基因载体与所述基因物质的质量比为 0.5 1 50 1，所述基因载体为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺或聚赖氨酸；所述PH值敏感材料复合在所述复合物的表面，所述pH值敏感材料与所述复合物中的基因载体的质量比为1 1 80 1。优选的，所述低聚磺胺为低聚磺胺甲噻二唑、低聚磺胺二甲氧嘧啶、低聚磺胺嘧啶或低聚磺胺甲基嘧啶。优选的，所述基因物质为质粒DNA或siRNA。本发明还提供了一种基因载体系统的制备方法，包括以下步骤将基因载体水溶液与基因物质水溶液混合后孵育，得到复合物，所述基因载体与所述基因物质的质量比为0.5 1 50 1，所述基因载体为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺或聚赖氨酸；向所述复合物中加入pH值敏感材料的水溶液，得到基因载体系统，所述pH值敏感材料与所述基因载体的质量比为1 1 80 1，所述PH值敏感材料为超支化聚乙烯亚胺、 聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为低聚磺胺，或者为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物，其中，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为600 10000，所述聚赖氨酸的分子量为1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000，所述聚乙二醇的分子量为1000 10000，所述低聚磺胺的分子量为 1000 5000。优选的，所述超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物按照以下方法制备将超支化聚乙烯亚胺和ε -苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐在氯仿中反应，得到第一中间产物；向所述第一中间产物中加入Y -苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐，反应后得到苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物；将所述苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物脱保护，得到超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。优选的，所述聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物按照以下方法制备将超支化聚乙烯亚胺和ε -苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐在氯仿中反应，得到第一中间产物；向所述第一中间产物中加入Y -苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐，反应后得到苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物；将所述苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物脱保护，得到超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物；带有羧基的聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺发生反应，得到第二中间产物；向所述第二中间产物中加入所述超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，反应后得到聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。优选的，所述低聚磺胺按照以下方法制备向氢氧化钠和丙酮的混合溶液中加入磺胺单体和甲基丙烯酰氯，冰浴反应后得到带有双键的甲基丙烯酰氯磺胺；向所述带有双键的甲基丙烯酰氯磺胺中加入巯基乙胺、偶氮二异丁腈和二甲基亚砜，反应后得到低聚磺胺。优选的，所述聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物按照以下方法制备向氢氧化钠和丙酮的混合溶液中加入磺胺单体和甲基丙烯酰氯，冰浴反应后得到带有双键的甲基丙烯酰氯磺胺；向所述带有双键的甲基丙烯酰氯磺胺中加入巯基乙胺、偶氮二异丁腈和二甲基亚砜，反应后得到低聚磺胺；带有羧基的聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺发生反应，得到第二中间产物；向所述第二中间产物中加入所述低聚磺胺，反应后得到聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物。优选的，所述磺胺单体为磺胺甲噻二唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶或磺胺甲基嘧啶。优选的，所述基因物质为质粒DNA或s iRNA。与现有技术相比，本发明提供的基因载体系统包括pH值敏感材料和由基因载体和基因物质组成的复合物，所述PH值敏感材料复合在所述复合物的表面，其中，所述pH值敏感材料为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为低聚磺胺，或者为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为600 10000，所述聚赖氨酸的分子量为1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000，所述聚乙二醇的分子量为1000 10000， 所述低聚磺胺的分子量为1000 3000 ；所述基因载体为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺或聚赖氨酸；所述基因载体与所述基因物质的质量比为0.5 1 50 1;所述pH值敏感材料与所述复合物中的基因载体的质量比为1 1 80 1。本发明提供的基因载体系统具有pH值敏感性，可根据pH值的变化而改变自身的正负电性当所述基因载体系统在PH值约为7.4的正常细胞组织中时，其带正电，与细胞膜表面的负电荷产生静电排斥作用，从而使正常细胞对基因载体系统的吞噬效率较低，有效保护基因物质在正常细胞环境内的运输；当所述基因载体系统达到呈酸性的肿瘤细胞内时，其电荷翻转，表现为带正电或不带电，带正电时与肿瘤细胞膜表面的负电荷相互吸引， 利于基因载体系统被肿瘤细胞吞噬，不带电时不会与肿瘤细胞膜表面的负电荷相互排斥，不会影响基因载体系统被肿瘤细胞吞噬，从而提高肿瘤细胞对基因载体系统的吞噬，使其中的基因物质进入肿瘤细胞发挥治疗作用或者纠正基因缺陷。本发明提供的基因载体系统能够有效保护基因载体和基因物质在正常细胞内的运输，从而提高基因物质的利用效率；能够促进基因载体和基因物质与肿瘤细胞的结合，从而提高转染效率。实验结果表明，本发明提供的基因载体系统对Hela细胞具有较高的转染效率，可达70%;本发明提供的基因载体系统对肿瘤具有良好的抑制作用。另外，本发明提供的基因载体系统无细胞毒性。
具体实施例方式本发明提供了一种基因载体系统，包括pH值敏感材料，所述pH值敏感材料为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为低聚磺胺，或者为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物，其中，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为 600 10000，所述聚赖氨酸的分子量为1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000，所述聚乙二醇的分子量为1000 10000，所述低聚磺胺的分子量为1000 5000 ；由基因载体和基因物质组成的复合物，所述基因载体与所述基因物质的质量比为 0.5 1 50 1，所述基因载体为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺或聚赖氨酸；所述pH值敏感材料复合在所述复合物的表面，所述pH值敏感材料与所述复合物中的基因载体的质量比为1 1 80 1。本发明提供的基因载体系统包括由基因载体和基因物质组成的复合物，其中，所述基因物质为人的正常基因或者具有治疗作用的基因，可以为在真核细胞表达的质粒DNA 或siRNA，如pGL-3或VEGFsiRNA等；所述基因载体为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺或聚赖氨酸，优选为聚乙烯亚胺。在本发明中，所述基因载体为阳离子聚合物，带正电，能够与基因物质通过静电复合得到复合物颗粒。在所述复合物中，所述基因载体与所述基因物质的质量比优选为0.5 1 50 1，更优选为1 1 30 1，最优选为2 1 10 1。本发明提供的基因载体系统中还包括pH值敏感材料，所述pH值敏感材料为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为低聚磺胺，或者为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物，优选为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物或聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。按照本发明，所述pH值敏感材料可以为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，其中，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为600 10000，优选为600 5000，更优选为1000 2000 ；所述聚赖氨酸的分子量为1000 25000，优选为2000 20000，更优选为3000 15000 ；所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000，优选为2000 20000，更优选为 3000 15000。在所述超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物中，超支化聚乙烯亚胺带负电，聚赖氨酸带正电，聚谷氨酸带负电，而所述超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物呈现PH值敏感性当pH值大于7.0时，该共聚物带负电，在正常细胞环境中不会与蛋白类凝聚形成沉淀，也不会被带负电的正常细胞吞噬；当PH值小于6. 0时，该共聚物带正电，在肿瘤细胞环境内，能够被待负电的肿瘤细胞吞噬，从而进入肿瘤细胞纠正基因缺陷或者发挥治疗作用。按照本发明，所述pH值敏感材料可以为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，其中，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为600 10000，优选为600 5000，更优选为1000 2000 ；所述聚赖氨酸的分子量为1000 25000，优选为2000 20000，更优选为3000 15000 ；所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000，优选为2000 20000，更优选为3000 15000 ；所述聚乙二醇的分子量优选为1000 10000，更优选为 1000 5000，最优选为2000 4000。在所述聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物中，聚乙二醇不带电，超支化聚乙烯亚胺带负电，聚赖氨酸带正电，聚谷氨酸带负电，而所述聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物呈现PH值敏感性当pH值大于7. 0时，该共聚物带负电，在正常细胞环境中不会与蛋白类凝聚形成沉淀，也不会被带负电的正常细胞吞噬；当PH值小于6. 0时，该共聚物带正电，在肿瘤细胞环境内，能够被待负电的肿瘤细胞吞噬，从而进入肿瘤细胞纠正基因缺陷或者发挥治疗作用。按照本发明，所述pH值敏感材料可以为低聚磺胺，所述低聚磺胺的分子量为 1000 5000，优选为2000 4000，更优选为2500 4000 ；所述低聚磺胺优选为低聚磺胺甲噻二唑、低聚磺胺二甲氧嘧啶、低聚磺胺嘧啶或低聚磺胺甲基嘧啶。所述低聚磺胺呈现pH值敏感性当pH值大于7. 2时，低聚磺胺带负电，在正常细胞环境中不会与蛋白类凝聚形成沉淀，也不会被带负电的正常细胞吞噬；当pH值小于6.0 时，低聚磺胺不带电，在肿瘤细胞环境内，能够被待负电的肿瘤细胞吞噬，从而进入肿瘤细胞纠正基因缺陷或者发挥治疗作用。按照本发明，所述pH值敏感材料可以为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物，所述低聚磺胺的分子量为1000 5000，优选为2000 4000，更优选为2500 4000 ；所述低聚磺胺优选为低聚磺胺甲噻二唑、低聚磺胺二甲氧嘧啶、低聚磺胺嘧啶或低聚磺胺甲基嘧啶。所述聚乙二醇的分子量优选为1000 10000，更优选为1000 5000，最优选为2000 4000。所述聚乙二醇和低聚磺胺的缩合物呈现pH值敏感性当pH值大于7. 2时，该缩合物带负电，在正常细胞环境中不会与蛋白类凝聚形成沉淀，也不会被带负电的正常细胞吞噬；当PH值小于6.0时，该缩合物不带电，在肿瘤细胞环境内，能够被待负电的肿瘤细胞吞噬，从而进入肿瘤细胞纠正基因缺陷或者发挥治疗作用。在本发明提供的基因载体系统中，所述pH值敏感材料复合在所述由基因载体和基因物质组成的复合物的表面，因此，所述基因载体系统可表现出所述PH值敏感材料的性质，即所述基因载体系统具有PH值敏感性，可根据pH值的变化而改变自身的正负电性当所述基因载体系统在PH值约为7.4的正常细胞组织中时，其带正电，与细胞膜表面的负电荷产生静电排斥作用，从而使正常细胞对基因载体系统的吞噬效率较低，有效保护基因物质在正常细胞环境内的运输；当所述基因载体系统达到呈酸性的肿瘤细胞内时，其电荷翻转，表现为带正电或不带电，带正电时与肿瘤细胞膜表面的负电荷相互吸引，利于基因载体系统被肿瘤细胞吞噬，不带电时不会与肿瘤细胞膜表面的负电荷相互排斥，不会影响基因载体系统被肿瘤细胞吞噬，从而提高肿瘤细胞对基因载体系统的吞噬，使其中的基因物质进入肿瘤细胞发挥治疗作用或者纠正基因缺陷。在本发明中，所述pH值敏感材料与所述复合物中的基因载体的质量比为1 1 80 1，优选为2 1 40 1，更优选为4 1 10 1。本发明提供的基因载体系统在正常细胞运输过程中能够有效保护由基因载体和基因物质组成的复合物不被正常细胞吞噬，在达到肿瘤细胞内后又有利于被肿瘤细胞吞噬，因此，能够提高基因物质的利用率，提高基因物质的转染效率。实验表明，本发明提供的基因载体系统对Hela细胞的转染效率可达70%。本发明还提供了一种基因载体系统的制备方法，包括以下步骤将基因载体水溶液与基因物质水溶液混合后孵育，得到复合物，所述基因载体与所述基因物质的质量比为0.5 1 50 1，所述基因载体为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺或聚赖氨酸；向所述复合物中加入pH值敏感材料的水溶液，得到基因载体系统，所述pH值敏感材料与所述基因载体的质量比为1 1 80 1，所述PH值敏感材料为超支化聚乙烯亚胺、 聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为低聚磺胺，或者为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物，其中，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为600 10000，所述聚赖氨酸的分子量为1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000，所述聚乙二醇的分子量为1000 10000，所述低聚磺胺的分子量为 1000 5000。本发明首先将基因载体水溶液和基因物质水溶液混合后孵育，使基因载体和基因物质复合形成复合物。所述基因物质为人的正常基因或者具有治疗作用的基因，可以为在真核细胞表达的质粒DNA或siRNA，如pGL-3或VEGFsiRNA等；所述基因载体为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺或聚赖氨酸，优选为聚乙烯亚胺。在本发明中，所述基因载体为阳离子聚合物，带正电，能够与基因物质通过静电复合得到复合物颗粒。在本发明中，所述基因载体水溶液的浓度优选为0. 02mg/mL ang/mL，更优选为0. 05mg/mL 1. 5mg/mL。所述基因物质水溶液的浓度优选为0. 01mg/mL 0. 05mg/mL,更优选为0. 02mg/mL 0. (Mmg/mL。所述基因载体与所述基因物质的质量比优选为0.5 1 50 1，更优选为1 1 30 1，最优选为2 1 10 1。得到复合物后，向所述复合物加入pH值敏感材料的水溶液，所述pH值敏感材料与所述复合物通过静电作用复合，且所述PH值敏感材料复合在所述复合物表面，形成基因载体系统。在本发明中，所述pH值敏感材料为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为低聚磺胺，或者为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物，优选为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物或聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。按照本发明，所述pH值敏感材料可以为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，所述超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物优选按照以下方法制备将超支化聚乙烯亚胺和ε -苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐在氯仿中反应，得到第一中间产物；向所述第一中间产物中加入Y -苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐，反应后得到苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物；将所述苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物脱保护，得到超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。首先将超支化聚乙烯亚胺溶解于氯仿中，加入ε -苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐的氯仿溶液，超支化聚乙烯亚胺与ε -苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐发生反应，生成第一中间产物，所述第一中间产物为超支化聚乙烯亚胺和聚赖氨酸的聚合物；所述超支化聚乙烯亚胺与ε -苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐进行反应的温度优选为20°C 40°C，时间优选为60h 200h。所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为600 10000，优选为600 5000，更优选为1000 2000 ；所述超支化聚乙烯亚胺与所述ε -苄氧羰基_L_赖氨酸N-羧酸酐的摩尔比优选为1 10 80，更优选为1 20 70。得到第一中间产物后，向所述第一中间产物中加入Y -苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐，γ -苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐与第一中间产物发生反应，将得到的反应产物在乙醚中沉降，干燥后得到苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。Y-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐与第一中间产物发生反应的温度优选为20°C 40°C，时间优选为 60h 200h。所述超支化聚乙烯亚胺与所述Y-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐的摩尔比优选为1 10 200，更优选为1 20 150。将所述苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物脱保护后， 即可得到超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。本发明对所述脱保护的方法没有特殊限制，优选将超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物溶于三氟乙酸中， 加入溴化氢的乙酸溶液进行脱保护，将脱保护后的反应产物用乙醚沉降、干燥后，将得到的固体物质在透析袋中透析48h，冻干后得到超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。所述超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物呈现pH值敏感性当pH值大于7.0时，该共聚物带负电，在正常细胞环境中不会与蛋白类凝聚形成沉淀，也不会被带负电的正常细胞吞噬；当PH值小于6. 0时，该共聚物带正电，在肿瘤细胞环境内，能够被待负电的肿瘤细胞吞噬，从而进入肿瘤细胞纠正基因缺陷或者发挥治疗作用。按照本发明，所述pH值敏感材料可以为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，优选按照以下方法制备带有羧基的聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺发生反应，得到第二中间产物；向所述第二中间产物中加入上述技术方案所述的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，反应后得到聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。首先将带有羧基的聚乙二醇溶于水中，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，带有羧基的聚乙二醇与NHS、EDC发生反应， 得到第二中间产物。所述聚乙二醇的分子量优选为1000 10000，更优选为1000 5000， 最优选为2000 4000。所述带有羧基的聚乙二醇与NHS、EDC发生反应的温度优选为室温，时间优选为20h 60h。得到第二中间产物后，向所述第二中间产物中加入超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，反应后得到聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。所述第二中间产物与所述超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物发生反应的温度优选为室温，时间优选为20h 60h。所述超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物与所述聚乙二醇的摩尔比优选为1 1。所述聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物呈现pH值敏感性当PH值大于7. 0时，该共聚物带负电，在正常细胞环境中不会与蛋白类凝聚形成沉淀， 也不会被带负电的正常细胞吞噬；当PH值小于6. 0时，该共聚物带正电，在肿瘤细胞环境内，能够被待负电的肿瘤细胞吞噬，从而进入肿瘤细胞纠正基因缺陷或者发挥治疗作用。按照本发明，所述pH值敏感材料可以为低聚磺胺，所述低聚磺胺优选按照以下方法制备向氢氧化钠和丙酮的混合溶液中加入磺胺单体和甲基丙烯酰氯，冰浴反应后得到带有双键的甲基丙烯酰氯磺胺；向所述带有双键的甲基丙烯酰氯磺胺中加入巯基乙胺、偶氮二异丁腈和二甲基亚砜，反应后得到低聚磺胺。首先将磺胺单体溶解于氢氧化钠和丙酮的混合溶液中，搅拌溶解后将反应混合液置于冰浴条件下，待反应混合液温度降至0°c时，向所述反应混合液中缓慢加入甲基丙烯酸酰氯，加入甲基丙烯酸酰氯的过程中猛烈搅拌所述反应混合液，加入完毕后，将所述反应混合液在冰浴中反应lh，将得到的反应混合物用G3漏斗过滤，将过滤产物水洗、干燥后得到带有双键的磺胺。所述磺胺单体优选为磺胺甲噻二唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶或磺胺甲基嘧啶。将所述带有双键的磺胺、巯基乙胺、偶氮二异丁腈和无水无氧的二甲基亚砜 (DMSO)加入反应瓶中进行反应，得到低聚磺胺。带有双键的磺胺与巯基乙胺的摩尔比优选为5 50 1，更优选为10 40 1。所述反应的温度优选为50°C 80°C，时间优选为 20h 40h。反应完毕后，将反应产物用IOOODa的透析袋对水透析除去DMS0，然后将透析产物离心、冷冻干燥后得到低聚磺胺。所述低聚磺胺的分子量为1000 5000，优选为2000 4000，更优选为2500 4000。所述低聚磺胺呈现pH值敏感性当pH值大于7. 2时，低聚磺胺带负电，在正常细胞环境中不会与蛋白类凝聚形成沉淀，也不会被带负电的正常细胞吞噬；当pH值小于6. 0 时，低聚磺胺不带电，在肿瘤细胞环境内，能够被待负电的肿瘤细胞吞噬，从而进入肿瘤细胞纠正基因缺陷或者发挥治疗作用。按照本发明，所述pH值敏感材料可以为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物，所述聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物优选按照以下方法制备带有羧基的聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺发生反应，得到第二中间产物；向所述第二中间产物中加入上述技术方案所述的低聚磺胺，反应后得到聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物。首先将带有羧基的聚乙二醇溶于水中，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和
111-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，带有羧基的聚乙二醇与NHS、EDC发生反应， 得到第二中间产物。所述聚乙二醇的分子量优选为1000 10000，更优选为1000 5000， 最优选为2000 4000。所述带有羧基的聚乙二醇与NHS、EDC发生反应的温度优选为室温， 时间优选为20h 60h。得到第二中间产物后，向所述第二中间产物中加入低聚磺胺，反应后得到聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物。所述第二中间产物与所述低聚磺胺发生反应的温度优选为室温， 时间优选为20h 60h。所述低聚磺胺与所述聚乙二醇的摩尔比优选为1 1。所述聚乙二醇和低聚磺胺的缩合物呈现pH值敏感性当pH值大于7. 2时，该缩合物带负电，在正常细胞环境中不会与蛋白类凝聚形成沉淀，也不会被带负电的正常细胞吞噬；当PH值小于6.0时，该缩合物不带电，在肿瘤细胞环境内，能够被待负电的肿瘤细胞吞噬，从而进入肿瘤细胞纠正基因缺陷或者发挥治疗作用。将所述pH值敏感材料的水溶液加入到所述复合物中后，所述pH值敏感材料通过静电作用复合在所述复合物表面，形成基因载体系统。所述PH值敏感材料的水溶液浓度优选为0. 02mg/mL ang/mL，更优选为0. 05mg/mL 1. 5mg/mL。所述pH值敏感材料与所述基因载体的质量比为1 1 80 1，优选为2 1 40 1，更优选为4 1 10 1。得到基因载体系统后，进行所述基因载体系统的体外转染实验、体内pDNA转染实验和体内siRNA转染实验，实验结果表明，本发明提供的基因载体系统具有较高的体外转染效率和体内转染效率，对肿瘤具有良好的抑制作用。在本发明提供的基因载体系统中，所述pH值敏感材料复合在所述由基因载体和基因物质组成的复合物的表面，因此，所述基因载体系统可表现出所述PH值敏感材料的性质，即所述基因载体系统具有PH值敏感性，可根据pH值的变化而改变自身的正负电性当所述基因载体系统在PH值约为7. 4的正常细胞组织中时，其带正电，与细胞膜表面的负电荷产生静电排斥作用，从而使正常细胞对基因载体系统的吞噬效率较低，有效保护基因物质在正常细胞环境内的运输；当所述基因载体系统达到呈酸性的肿瘤细胞内时，其电荷翻转，表现为带正电或不带电，带正电时与肿瘤细胞膜表面的负电荷相互吸引，利于基因载体系统被肿瘤细胞吞噬，不带电时不会与肿瘤细胞膜表面的负电荷相互排斥，不会影响基因载体系统被肿瘤细胞吞噬，从而提高肿瘤细胞对基因载体系统的吞噬，使其中的基因物质进入肿瘤细胞发挥治疗作用或者纠正基因缺陷。本发明提供的基因载体系统在正常细胞运输过程中能够有效保护由基因载体和基因物质组成的复合物不被正常细胞吞噬，在达到肿瘤细胞内后又有利于被肿瘤细胞吞噬，因此，能够提高基因物质的利用率，提高基因物质的转染效率。为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的基因载体系统及其制备方法进行详细描述。实施例1 8pH值敏感材料的制备按照表1所示的原料比例，按照以下方法制备由超支化PEI、PLL和PGlu连接组成的PH值敏感材料将超支化聚乙烯亚胺(PEI)溶于氯仿，然后加入ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐(Lys(z)-NCA)的氯仿溶液，于30°C下反应72小时后，继续加入苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG-NCA)的氯仿溶液，30°C反应72小时。将得到的反应产物用乙醚沉降、干燥，得到固体产物，将所述固体产物溶于三氟乙酸，加入溴化氢的乙酸溶液脱保护后，继续用乙醚沉降、干燥，将得到的干燥产物用透析袋透析72小时，透析期间换水6次，冻干得到PEI-PLL-PGlupH值敏感材料。将所述pH值敏感材料溶于水溶液，并测定其颗粒大小及表面电位，结果参见表2。表1实施例1 8的原料及比例
权利要求
1.一种基因载体系统，包括PH值敏感材料，所述pH值敏感材料为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为低聚磺胺，或者为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物，其中，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为600 10000，所述聚赖氨酸的分子量为1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000， 所述聚乙二醇的分子量为1000 10000，所述低聚磺胺的分子量为1000 5000 ；由基因载体和基因物质组成的复合物，所述基因载体与所述基因物质的质量比为 0.5 1 50 1，所述基因载体为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺或聚赖氨酸；所述PH值敏感材料复合在所述复合物的表面，所述pH值敏感材料与所述复合物中的基因载体的质量比为1 1 80 1。
2.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述低聚磺胺为低聚磺胺甲噻二唑、低聚磺胺二甲氧嘧啶、低聚磺胺嘧啶或低聚磺胺甲基嘧啶。
3.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述基因物质为质粒DNA或 SiRNA0
4.一种基因载体系统的制备方法，包括以下步骤将基因载体水溶液与基因物质水溶液混合后孵育，得到复合物，所述基因载体与所述基因物质的质量比为0.5 1 50 1，所述基因载体为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺或聚赖氨酸；向所述复合物中加入PH值敏感材料的水溶液，得到基因载体系统，所述pH值敏感材料与所述基因载体的质量比为1 1 80 1，所述pH值敏感材料为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为低聚磺胺，或者为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物，其中，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为600 10000，所述聚赖氨酸的分子量为1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量为1000 25000，所述聚乙二醇的分子量为1000 10000，所述低聚磺胺的分子量为 1000 5000。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物按照以下方法制备将超支化聚乙烯亚胺和ε -苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐在氯仿中反应，得到第一中间产物；向所述第一中间产物中加入Y -苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐，反应后得到苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物；将所述苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物脱保护，得到超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、 聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物按照以下方法制备将超支化聚乙烯亚胺和ε -苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐在氯仿中反应，得到第一中间产物；向所述第一中间产物中加入Y -苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐，反应后得到苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物；将所述苄基保护的超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物脱保护，得到超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物；带有羧基的聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺发生反应，得到第二中间产物；向所述第二中间产物中加入所述超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物， 反应后得到聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述低聚磺胺按照以下方法制备 向氢氧化钠和丙酮的混合溶液中加入磺胺单体和甲基丙烯酰氯，冰浴反应后得到带有双键的甲基丙烯酰氯磺胺；向所述带有双键的甲基丙烯酰氯磺胺中加入巯基乙胺、偶氮二异丁腈和二甲基亚砜， 反应后得到低聚磺胺。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物按照以下方法制备向氢氧化钠和丙酮的混合溶液中加入磺胺单体和甲基丙烯酰氯，冰浴反应后得到带有双键的甲基丙烯酰氯磺胺；向所述带有双键的甲基丙烯酰氯磺胺中加入巯基乙胺、偶氮二异丁腈和二甲基亚砜， 反应后得到低聚磺胺；带有羧基的聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺发生反应，得到第二中间产物；向所述第二中间产物中加入所述低聚磺胺，反应后得到聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述磺胺单体为磺胺甲噻二唑、 磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶或磺胺甲基嘧啶。
10.根据权利要求4 8任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述基因物质为质粒 DNA 或 siRNA。
全文摘要
本发明提供了一种基因载体系统，包括pH值敏感材料，所述pH值敏感材料为超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为聚乙二醇、超支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚谷氨酸的共聚物，或者为低聚磺胺，或者为聚乙二醇与低聚磺胺的缩合物；由基因载体和基因物质组成的复合物，所述基因载体与所述基因物质的质量比为0.5∶1～50∶1；所述pH值敏感材料复合在所述复合物的表面，所述pH值敏感材料与所述复合物中的基因载体的质量比为1∶1～80∶1。本发明提供的基因载体系统能够有效保护基因载体和基因物质在正常细胞内的运输，能够促进基因载体和基因物质与肿瘤细胞的结合，从而提高转染效率。
文档编号C07C303/40GK102277387SQ20111017735
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者林琳, 焦自学, 田华雨, 董璇, 郭兆培, 陈学思, 陈杰 申请人:中国科学院长春应用化学研究所