专利名称：用于牛粒细胞集落刺激因子及其变体的制剂的制作方法
用于牛粒细胞集落刺激因子及其变体的制剂粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是生长激素超基因家族的成员。G-CSF刺激特定的骨髓前体细胞的增殖和它们分化为粒细胞。此外，G-CSF是中性粒细胞增殖和体内成熟的有效刺激(Cohen 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1., 1987 ；84: 2484-2488 ;还参见 Heidari等人，Vet.Tmmol.1munopathol.2001 ;81:45-57)。G-CSF还能够诱导体外成熟中性粒细胞的功能激活或者“引发” (ffeisbart, R.H.等人,Annals of Internal Medicine 1989 ；110:297-303)。G-CSF已被证明引发人粒细胞并且增加由趋化肽N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸刺激的超氧化物释放(S.Kitagawa,等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1987 ; 144:1143-1146 和 C.F.Nathan, Blood 1989 ;74:301-306)并且被证明激活人中性粒细胞IgA介导的吞噬作用(Weisbart，R.H.，等人，Nature 1988 ；332:647-649)。已经发现G-CSF在治疗其中中性粒细胞的增加将提供益处的适应症中是有用的。G-CSF单独地或与其它化合物(例如其它细胞因子)结合也可用于培养中的细胞的生长或扩增，例如用于骨髓移植。重组人G-CSF (hG-CSF)的cDNA克隆和表达已被描述，并且重组hG_CSF显示天然分子的大多数，即使不是全部的生物学特性。(Souza, L.等人，Science 232，61-65(1986))。cDNA和基因组DNA克隆的序列分析允许氣基酸序列的减除并且表明蛋白质是具有30个氨基酸信号序列的204个氨基酸长。成熟蛋白质是174个氨基酸长并且不具有潜在的N-连接糖基化位点但具有几个用于O-连接糖基化的可能位点。包含hG-CSF的药物制剂在本领域是已知的并且包括许多制剂。例如，hG-CSF的多种制剂描述在 Piedmonte 等人，Advanced Drug Delivery Reviews, 60: 50-58 (2008),Herman 等人，Formulation, Characterization, and Stability of Protein Drugs,Rodney Pearlman 和 Y.John Wang 编辑，Plenum Press, New York (1996), Michaelis 等人的第5，919，757号美国专利和Sato等人的第6，908，610号美国专利中。通常，表面活性剂包含在hG-CSF制剂中并且可在潜在地不稳定界面处保护hG-CSF免受加工过程中接触的表面的影响并且免受其构象稳定性改变的影响。还描述了重组牛G-CSF (bG-CSF)的cDNA克隆和表达。例如，成熟bG_CSF的多核苷酸和多肽序列在第5，849，883号美国专利中提供，其还描述了克隆、分离和纯化多肽及其类似物的方法。成熟bG-CSF的长度为174个氨基酸并且具有与hG-CSF的82%同源性。Heidari等人在上面描述了 bG_CSF的表达、纯化和生物活性。向牛给予bG-CSF能提供治疗益处。因此，包含bG-CSF的药物制剂适用于利用其治疗潜能。然而，根据本领域已知的常规方法开发的bG-CSF药物制剂导致不期望的产品性质，例如bG-CSF多肽和/或制剂的聚集和不稳定。
因此，亟需具有期望性质如最小的产品聚集和不稳定性质的稳定的bG-CSF药物制剂。因此，本发明提供了具有bG-CSF多肽或其变体的稳定的水性药物制剂，其显示期望的性质并且还提供了相关优点。本发明提供了包含bG-CSF多肽或其变体、缓冲物质和赋形剂的稳定的水性制剂，其中所述制剂基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯。本发明还提供了使用所述制剂的冻干形式或粉末形式的方法以及制备所述制剂的方法。本发明的牛粒细胞集落刺激因子(“bG-CSF”)的稳定的水性制剂包含bG-CSF多肽或其变体。如本文使用的，“牛G-CSF多肽”(或者称为“bG-CSF多肽”、“牛G-CSF”或“ bG-CSF，，)及其变体应包括具有CSF、bG-CSF类似物、bG-CSF突变体、改变糖基化的bG-CSF、PEG共轭bG-CSF、bG·-CSF亚型、bG-CSF模拟物、bG-CSF片段、混合bG-CSF蛋白质、其融合蛋白质、低聚物和多聚物、同系物、糖基化模型变体、变体、剪接变体和突变蛋白质的至少一种生物活性的那些多肽和蛋白质，不管相同的生物活性并且还不管其合成或制备方法，所述合成或制备方法包括但不限于通过显微注射核酸分子进行的体外、体内重组(不论从cDNA、基因组DNA、合成DNA或核酸的其它形式制备的)，合成、转基因和基因激活方法。此夕卜，术语bG-CSF多肽或其变体包括包含一个或多个氨基酸替换、添加或删除的bG-CSF多肽。参见第5，849，883号美国专利，例如牛G-CSF的类似物。长度为174个氨基酸的成熟bG-CSF多肽的序列如下:
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SQLHRFLELAYRGLRYLAEP。此外，具有初始甲硫氨酸氨基酸残基的bG-CSF多肽如下: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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ASQLHRFLELAYRGLRYLAEP。bG-CSF中许多氨基酸位置的替换已被描述。包括但不限于调节药物稳定性、增加激动剂活性、增加蛋白酶抗性、转化多肽成为拮抗剂等的那些替换被术语bG-CSF多肽或其变体所包括。术语bG-CSF多肽或其变体还包括糖基化bG-CSF，例如但不限于在任何氨基酸位置处的多肽糖基化、多肽的N-连接糖基化形式或多肽的O-连接糖基化形式。包含单一核苷酸变化的变体也被认为是bG-CSF多肽的生物活性变体。包含单一核苷酸变化的变体也被认为是bG-CSF的生物活性变体。此外，还包括剪接变体。术语bG-CSF多肽或其变体还包括任何一种或多种bG-CSF的bG-CSF异源二聚体、同源二聚体、异源多聚体或同源多聚体，或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接物、配体或通过化学方法连接的或表达为融合蛋白质的其它任何类型的活性分子(参见例如，第6，261，550号；第6，166，183号；第6，204，247号；第6，261，550号；和第6，017，876号美国专利)以及包含例如特定删除或其它改变仍保持生物活性的多肽类似物(参见例如，第6，261，550号；第6，004，548号；和第6，632，426号美国专利)。bG-CSF多肽及其变体例如在第12/507，237号美国专利申请(现在的第2010/0035812号美国专利申请公开)中进行描述，其通过应用并入本文。在一些实施方案中，将一个或多个非天然编码的氨基酸并入bG-CSF中的一个或多个下列位置:8、62、69、125、133、136及其任意组合(成熟bG-CSF多肽或具有初始甲硫氨酸氨基酸残基的bG-CSF多肽中相应的氨基酸)。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸对乙酰基苯丙氨酸(PAF)在下列位置中的一个被天然编码的氨基酸取代:S8、S62、L69、G125、T133、A136及其任意组合(成熟bG-CSF多肽或具有初始甲硫氨酸氨基酸残基的bG-CSF多肽中相应的氨基酸)。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF_S8pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置S8处进行。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF_S62pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置S62处进行。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF-L69pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置L69处进行。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF_G125pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置G125处进行。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF_T133pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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ASQLHRFLELAYRGLRYLAEP其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置T133处进行。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF_A136pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置A136处进行。本发明的制剂能包含与连接物、聚合物或生物活性分子连接的bG-CSF多肽或其变体。连接物、聚合物和生物活性分子在第12/507,237号美国专利申请(现在的第2010/0035812号美国专利申请公开)中进行描述。本文使用的术语“连接基团(linkage)”或“连接物”是指通常由于化学反应而形成并且通常为共价连接的基团或键。水解稳定的连接基团是指连接基团在水中基本上稳定并且在有效的PH值下不与水反应，其包括但不限于在生理学条件下不与水反应达延长的时间段，可能甚至是无限期的。水解不稳定或可降解的连接基团是指连接基团在水中或在包括例如血液的水性溶液中是可降解的。酶不稳定或可降解的连接基团是指连接基团可被一种或多种酶降解。如本领域所理解的，PEG和相关聚合物可在聚合物骨架中包括可降解的连接基团或在聚合物骨架和聚合物分子的一个或多个末端官能团之间的连接物基团中包括可降解的连接基团。例如，通过PEG甲酸或活性PEG甲酸与生物活性剂上的醇基团反应形成的酯连接基团通常在生理学条件下水解以释放试剂。其它水解可降解的连接基`团`包括但不限于碳酸酯连接基团；由胺和醛的反应产生的亚胺连接基团；通过使醇与磷酸盐基团反应形成的磷酸酯连接基团；为酰肼和醛的反应产物的腙连接基团；为醛和醇的反应产物的缩醛连接基团；为甲酸和醇的反应产物的原酸酯连接基团；包括但不限于在聚合物如PEG的末端通过胺基团和肽的羧基形成的肽连接基团；以及包括但不限于在聚合物的末端通过亚磷酰胺基团和寡核苷酸的5’羟基形成的寡核苷酸连接基团。在一些实施方案中，bG-CSF多肽或其变体与水溶性聚合物连接。如本文使用的，术语“水溶性聚合物”是指溶于水性溶剂的任何聚合物。水溶性聚合物与bG-CSF多肽或其变体的连接能产生改变，其包括但不限于增加或调节血清半衰期、相对于未改进形式增加或调节治疗半衰期、调节免疫原性、调节物理结合特性如聚集和多聚体形成、改变受体结合、改变与一种或多种结合伴侣的结合以及改变受体二聚或多聚。水溶性聚合物可能具有或可能不具有其自身的生物活性并且可被用作用于连接bG-CSF与其它物质的连接物，其包括但不限于一种或多种bG-CSF多肽或其变体，或者一种或多种生物活性分子。合适的聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单Cl-ClO烷氧基或芳氧基衍生物(在第5，252，714号美国专利中描述)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、包括硫酸葡聚糖的葡聚糖衍生物、聚丙二醇、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺等或其混合物。这类水溶性聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇和血清白蛋白。WO 03/074087和WO 03/074088描述了蛋白质或小分子与羟基烷基淀粉(HAS)的结合。羟基烷基淀粉的实例包括但不限于羟基乙基淀粉。羟基烷基淀粉和另一分子的结合，例如，可包含HAS的末端醛基团和其它分子的反应基团之间的共价连接基团。在一些实施方案中，水溶性聚合物为聚(乙二醇)部分。在一些实施方案中，聚(乙二醇)部分具有约0.1 kDa至约100 kDa的分子量。在另一实施方案中，水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约50 kDa的分子量。在一些实施方案中，水溶性聚合物具有约10 kDa至约30 kDa的分子量。在另一实施方案中，水溶性聚合物具有约15 kDa至约25 kDa的分子量。在另一实施方案中，水溶性聚合物具有约20 kDa的分子量。本领域技术人员理解基于所述部分的规格和多分散性具有“约20 kDa”的分子量的水溶性聚合物包括约15%的分子量的可变性(即，约17 kDa至约23 kDa)。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF_S8pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置S8处进行并且与聚(乙二醇)部分连接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有约20 kDa的分子量，则在该实施方案中的bG-CSF多肽或其变体能被认为是“bG-CSF-S8pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分与在位置S8处进行的pAF替换连接。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF_S62pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC AAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCL
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其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置S62处进行并且与聚(乙二醇)部分连接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有约20 kDa的分子量，则在该实施方案中的bG-CSF多肽或其变体能被认为是“bG-CSF-S62pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分与在位置S62处进行的pAF替换连接。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF_L69pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置L69处进行并且与聚(乙二醇)部分连接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有约20 kDa的分子量，则在该实施方案中的bG-CSF多肽或其变体能被认为是“bG-CSF-L69pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分与在位置L69处进行的pAF替换连接。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF_G125pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置G125处进行并且与聚(乙二醇)部分连接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有约20 kDa的分子量，则在该实施方案中的bG-CSF多肽或其变体能被认为是“bG-CSF-G125pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分与在位置G125处进行的pAF替换连接。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF_T133pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置T133处进行并且与聚(乙二醇)部分连接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有约20 kDa的分子量，则在该实施方案中的bG-CSF多肽或其变体能被认为是“bG-CSF-T133pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分与在位置T133处进行的pAF替换连接。在一个实施方案中，bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF_A136pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中单一对乙酰基苯丙氨酸(pAF)替换在位置A136处进行并且与聚(乙二醇)部分连接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有约20 kDa的分子量，则在该实施方案中的bG-CSF多肽或其变体能被认为是“bG-CSF-A136pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分与在位置A136处进行的pAF替换连接。如本文使用的，在包含bG-CSF多肽或其变体的制剂的上下文中术语“稳定性”和“稳定的”是指在给定的制造、准备、运输和储存条件下，bG-CSF多肽或其变体的热和化学解折叠、聚集、降解、变性、断裂或不稳定。本发明“稳定的”制剂保持结构完整，其导致生物活性的保留，期望在给定的制造、准备、运输和储存条件下为大于80%、85%、90%、95%、98%、99%或99.5%。能通过本领域技术人员已知和本文进一步描述的方法由聚集、去聚乙二醇化、降解、变性或断裂的程度评价制剂的稳定性。如本文使用的，包含bG-CSF多肽或其变体的制剂的上下文中的术语“水性”是指水、一种或多种水溶性有机溶剂或其混合物。以其常规意义在本文使用的术语“有机溶剂”是指液体有机化合物，通常为液体形式的单体有机材料，优选为相对无粘性的液体，其分子结构包含氢原子、碳原子和任选其它原子，并且其能够溶解固体、气体或液体。本发明的药物制剂可包含药物可接受的载体。药物可接受的载体部分地通过被给予的特定组合物以及通过用于给予组合物的特定方法决定(参见例如，Remington’ sPharmaceutical Sciences,第17版，1985))。合适的药物可接受的载体包括但不限于缓冲物质和赋形剂，例如包含盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和/或其组合的那些。合适的载体能为包含琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、组氨酸、咪唑、醋酸盐、碳酸氢盐和其它有机酸的缓冲物质。合适的载体能为赋形剂，其包含多元糖醇，氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α - 一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即，<10残基)；蛋白质如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮；单糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖如蜜三糖和多糖如葡聚糖。根据本发明，柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐或其组合能用作缓冲物质。在一些实施方案中，在稳定的水性制剂中柠檬酸盐或琥珀酸盐用作缓冲物质。在一些实施方案中，缓冲物质具有约10 mM至约50 mM的摩尔浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有约30 mM的摩尔浓度。缓冲物质能以相应游离酸的形式或以碱、碱土或铵盐的形式存在。此外，制剂还能包含常见药物辅助物质。在制备液体药物制剂过程中添加各种辅助物质的顺序或者添加活性物质的顺序很大程度上独立于根据本发明发现的储存中的稳定效应并且由本领域技术人员自 由裁定。根据本发明，氯化钠、海藻糖、山梨醇、精氨酸或其组合能用作赋形剂。在一个实施方案中，赋形剂为精氨酸。在一些实施方案中，精氨酸具有约100 mM至约500 mM的摩尔浓度。在其它实施方案中，精氨酸具有约200至约300 mM的摩尔浓度。在一些实施方案中，精氨酸具有约250 mM的摩尔浓度。通常，蛋白质的药物制剂包含表面活性剂。表面活性剂的内含物可在潜在不稳定界面处保护蛋白质免受加工过程中接触的表面的影响并且免受其热力学构象稳定性改变的影响。表面活性剂是本领域熟知的，例如聚山梨醇酯表面活性剂。聚山梨醇酯表面活性剂的一个实例为聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯，还称为商标名Tween 20 。然而，包含痕量水平的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯的bG-CSF制剂的研究表明在25°C下孵育5天后聚集体增加高至3.2% (如由尺寸排阻色谱(SEC)测定的)。因此，本发明的制剂基本上不含表面活性剂、聚山梨醇酯表面活性剂和/或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯。如本文使用的，术语“基本上不含”表面活性剂、聚山梨醇酯表面活性剂和/或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯是指包含小于0.033%、小于0.001%、小于0.0005%、小于
0.0003%或小于0.0001%的表面活性剂、聚山梨醇酯表面活性剂和/或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯的制剂。本发明的制剂基本上不含表面活性剂、聚山梨醇酯表面活性剂和/或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯以实现具有期望性质的稳定的制剂，所述期望性质例如最小的广品聚集和最小的不稳定以及在应用时减少的去聚乙~■醇化。本文使用的术语“生物活性分子”是指可影响与有机体相关的生物系统、通路、分子或相互作用的任何物理或生物化学性质的任何物质，所述有机体包括但不限于病毒、细菌、噬菌体、转位子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人。特别地，如本文使用的，生物活性分子包括但不限于意图用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人或其它动物的疾病的任何物质，或者另外增强人或动物的身体健康或心理健康的任何物质。生物活性分子的实例包括但不限于肽、蛋白质、酶、小分子药物、疫苗、免疫原、硬药、软药、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、类毒素、毒素、原核细胞和真核细胞、病毒、多糖、核酸以及其得自或衍生自病毒、细菌、昆虫、动物或任何其它细胞或细胞类型、脂质体、微粒和胶束的部分。本发明的药物制剂包括除了 bG-CSF多肽或其变体之外还任选包含一种或多种其它活性成分的那些。如本文使用的，术语“活性成分”或“治疗成分”是指治疗活性化合物及其任何前药，和所述化合物和前药的药物可接受的盐、水合物和溶剂化物。其它活性成分可与bG-CSF多肽或其变体组合并可单独地或在相同的药物制剂中给予。基于使用bG-CSF的治疗，待给予的其它活性成分的量可由本领域技术人员容易地确定。本发明的药物制剂包括除了 bG-CSF多肽或其变体之外还任选包含一种或多种其它非活性成分的那些。如本 文使用的，术语“非活性成分”是指治疗非活性化合物及其任何前药，和所述化合物和前药的药物可接受的盐、水合物和溶剂化物。其它非活性成分可与bG-CSF多肽或其变体组合并可单独地或在相同的药物制剂中给予。基于使用bG-CSF的治疗，待给予的其它非活性成分的量可由本领域技术人员容易地确定。稳定的水性制剂中bG-CSF多肽或其变体的量足以实现治疗作用。如本文使用的，术语“治疗有效量”是指对动物产生期望益处的量并且包括治疗和预防给药二者。所述量因人而异并且依赖许多因素，包括患者的整体身体状况和待治疗的疾病状态的根本原因。用于治疗的bG-CSF多肽或其变体的量提供可接受的变化率并在有益水平下保持期望的反应。本组合物的治疗有效量可由本领域一般技术人员使用公共可利用的物质和步骤容易地确定。例如，bG-CSF多肽或其变体的量能以约0.5至约12克/升，优选约5克/升的量存在于制剂中。根据本发明，能在各个pH值下配制bG-CSF多肽或其变体的稳定的水性制剂。在一些实施方案中，稳定的水性制剂能具有约5.7至约6.6的pH值。在一个实施方案中，稳定的水性制剂具有约6.0至约6.3的pH。通过添加碱如碱性氢氧化物、碱土氢氧化物和氢氧化铵调整制剂的期望的PH值。氢氧化钠优选用于pH调节。通过添加碱性溶液能基本上实现期望的PH值的调节。通常，能使用强碱与弱酸的盐，例如醋酸钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾或碳酸钠。如果辅助物质的药物溶液具有碱性PH值，则通过使用酸滴定来调整直至达到4-5或7-8的期望的pH范围。考虑生理学耐受的无机酸或有机酸作为酸，例如盐酸、磷酸、醋酸、柠檬酸或具有酸性pH值的物质的常规溶液。在该方面，一些示例性物质为强酸与弱碱的盐，例如磷酸二氢钠或磷酸二氢钾。如在下面实施例中显示的，本发明的bG-CSF制剂在压力贮存条件下和在加速贮存条件下显示bG-CSF多肽或其变体的期望低的聚集体浓度。如本文使用的，在25°C下将制剂样品孵育5天后评价压力贮存条件。如本文使用的，在40°C下将制剂样品孵育I天后评价加速贮存条件。为了本发明的目的，还能在其它各个温度和持续时间下评价贮存条件。例如，能在25°C下将制剂样品孵育28天后或在40°C下将制剂样品孵育3天后评价贮存条件。在压力贮存条件和加速贮存条件之后分析bG-CSF多肽或其变体的聚集体浓度。在一些实施方案中，本发明的bG-CSF制剂在压力贮存条件下具有小于约2.1% (重量/重量百分比)的bG-CSF多肽或其变体的聚集体浓度。在其它实施方案中，本发明的bG-CSF制剂在压力贮存条件下具有小于约L 5% (重量/重量百分比)的bG-CSF多肽或其变体的聚集体浓度。在一些实施方案中，本发明的bG-CSF制剂在加速贮存条件下具有小于约1.5%(重量/重量百分比)的bG-CSF多肽或其变体的聚集体浓度。在其它实施方案中，本发明的bG-CSF制剂在压力贮存条件下具有小于约L 5% (重量/重量百分比)的bG-CSF多肽或其变体的聚集体浓度。此外，强制搅拌研究或冻融研究能用于评价本发明制剂的稳定性性质。例如，强制搅拌研究能由使用磁力搅拌器在设定速度如60 rpm下在玻璃烧杯中混合制剂样品组成。搅拌能发生确定的时间，例如两小时以确定制剂样品的特性。冻融循环能由在约_75°C下将制剂样品冷冻I小时并在室温下融化约I小时直至观察到没有冰组成。此外，如在下面实施例中显示的，在压力贮存条件下和在加速贮存条件下本发明的bG-CSF制剂能显示bG-CSF多肽或其变体的期望的不稳定和/或去聚乙二醇化性质。如本文使用的，术语“去聚乙二醇化”是指与bG-CSF多肽或其变体结合的聚乙二醇化部分的连接稳定性，即这种聚乙二醇化部分随时间推移是否保持与多肽结合，例如在水性溶液中贮存期间，或它们是否倾向于分离，例如由于酯键水解。在一些实施方案中，能使用柠檬酸盐作为缓冲物质并使用精氨酸作为赋形剂配制bG-CSF多肽或其变体的稳定的水性制剂。在一个实施方案中，能使用柠檬酸一水合物(Fisher, C/6200/60或等同物)作为缓冲物质并使用L-精氨酸(Sigma，A8094或等同物)作为赋形剂制备水性制剂。能通过将1.6克土 0.1克的柠檬酸一水合物和10.9克土 0.1克的L-精氨酸添加至200 mL的优质水制备水性制剂。此后，能使用盐酸将pH调整至6.0土 0.1并能使用优质水将混合物稀释至250 mL。生成的制剂能包含30 mM柠檬酸盐、250mM精氨酸和bG-CSF多肽或其变体，pH为6.0。通过常规冻干法本发明的水性制剂能用于制备冻干粉或粉末。通过将冻干粉溶于水中或其它水性溶液中再次获得本发明的制剂。还称为冷冻-干燥法的术语“冻干法”是用于呈递蛋白质通常使用的技术，其用于从感兴趣的蛋白质制剂中去除水。冻干法是待干燥的物质首先通过其被冷冻然后在真空环境中通过升华去除冰或冷冻溶剂的方法。可在预-冻干的制剂中包含赋形剂以增强冷冻-干燥过程期间的稳定性和/或提高贮存时冻干产品的稳定性。例如，参见Pikal, M.Biopharm.3(9)26-30 (1990)和Arakawa等人，Pharm.Res.8(3):285-291 (1991)。药物成分的喷雾干燥也是本领域一般技术人员已知的。例如，参见Broadhead,J.等人，“The Spray Drying of Pharmaceuticals，，在 Drug Dev.1nd.Pharm, 18 (11 和12),1169-1206 (1992)中。除了小分子药物外，已经被喷雾干燥的多种生物材料包括:酶、血清、血浆、微生物和酵母。喷雾干燥是有用的技术 因为它能在一步过程中将液体药物制剂转化为细小、无尘或聚结的粉末。基础技术包括下列四步:a)雾化给料溶液成为雾状物；b)雾状物-空气接触；c)干燥雾状物；和d)从干燥空气中分离干燥的产物。例如，第6，235，710号和第6，001, 800号美国专利描述了通过喷雾干燥制备重组红细胞生成素。使用包含bG-CSF多肽或其变体的制剂的方法也被本发明包括。bG-CSF具有多种生物活性，包括但不限于与其受体结合、导致其受体二聚、刺激中性粒细胞产生和刺激细胞增殖和分化。粒细胞集落刺激因子和bG-CSF的一些生物活性的实例在上文和第6，676，947号；第 6, 579, 525 号；第 6, 531, 121 号；第 6, 521, 245 号；第 6, 489, 293 号；第 6, 368, 854 号；第 6，316，254 号；第 6，268，336 号；第 6，239，109 号；第 6，165，283 号；第 5，986，047 号；第5，830，851号；第5，043，156号；和第5，773，569号美国专利中进行描述。本发明的包含b-GCSF多肽或其变体的制剂用于治疗或预防多种病症。“预防”是指降低受体遭受或发展本文描述的任何病理学疾病状态的可能性并且包括预防性给药。术语“预防”特别适用于易患特定病理学疾病状态的患者。“治疗”是指介导疾病或疾病状态并预防、逆转疾病的临床效果，或者减轻其进一步发展或改善与所述疾病或疾病状态相关的症状。G-CSF产物的给药导致白细胞形成。因此，本发明的包含bG-CSF多肽或其变体的制剂的给药可用于预防处于感染风险中的动物的感染。可将本发明的包含bG-CSF多肽或其变体的制剂给予患有感染的动物。可使用本发明的包含bG-CSF多肽或其变体的制剂治疗的感染包括但不限于乳腺炎和船运热。能将本发明的包含bG-CSF多肽或其变体的制剂给予动物，例如，在分娩前两周至一天并且任选地能在分娩当天或直至分娩后一周给予另外的给药。在一些实施方案中，给予本发明的包含bG-CSF多肽或其变体的制剂的动物为母牛并且将分娩称为“产犊”。在一个实施方案中，本发明的包含bG-CSF多肽或其变体的制剂可给予围产期奶牛用于预防乳腺炎。根据本发明，可通过适用于蛋白质或多肽的任何常规途径给予包含bG-CSF多肽或其变体的制剂，包括但不限于肠胃外给药，例如注射，其包括但不限于皮下注射或静脉内注射或注射或输注的任何其它形式。能通过许多途径给予包含bG-CSF多肽或其变体的制齐U，包括但不限于口服、静脉内、腹膜内、肌内、透皮、皮下、局部、舌下、血管内、乳房内或直肠途径。还能通过脂质体给予包含bG -CSF多肽或其变体的制剂。这种给药途径和合适的制剂通常是本领域技术人员已知的。还能将单独的或结合其它合适组分的包含bG-CSF多肽或其变体的制剂制成通过吸入给予的气雾剂(即，它们能为“雾状的”)。能将气雾剂放入加压可接受的推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。适用于肠胃外给药(例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径)的包含bG-CSF多肽或其变体的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液(其能包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标受体的血液等渗的溶质)，以及水性和非水性无菌悬浮液(其能包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。能以单一剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)形式提供包含bG-CSF多肽或其变体的制剂。还能以注射器(如预充式注射器)形式提供包含bG-CSF多肽或其变体的制剂。肠胃外给药和静脉内给药是本发明制剂的可能的给药方法。特别地，已经用于天然氨基酸同系物治疗的给药途径(包括但不限于通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFNs、白介素、抗体、FGFs和/或任何其它药物递送的蛋白质的那些)连同目前使用的制剂提供了可能的给药途径以及本发明的包含bG-CSF多肽或其变体的制剂。在一些实施方案中，本发明的制剂包含含量为约0.5至约12克/升的bG-CSF多肽或其变体。在本发明的上下文中给予动物的剂量随时间足以在动物中具有有益的治疗反应，或者依赖应用具有其它合适的活性。通过特定载体或制剂的功效和使用的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和动物的疾病状态以及待治疗的动物的体重或表面积来确定剂量。还通过在特定动物中伴随特定载体、制剂等的给药的任何不利副作用的存在、性质和程度确定剂量大小。在本发明的上下文中给予动物的剂量随时间应足以在受试者中引起有益反应。通常，每次给药肠胃外给予的本发明的bG-CSF多肽或其变体的总药物有效量为约0.01 μ g/kg/天至约100 μ g/kg或约0.05 mg/kg至约I mg/kg的动物体重,尽管这受制于治疗判断。或者，每次给药肠胃外给予的本发明的bG-CSF多肽或其变体的药物有效量为约I mg至约25 mg或约5 mg至约20 mg。例如,每次给药肠胃外给予的本发明的bG-CSF多肽或其变体的药物有效量能为约14 mg。给药频率也受制于治疗判断。可以单一剂量或以多剂量计划的一部分给予动物药物有效量的bG-CSF多肽或其变体。例如，可以其中计划为至少两个剂量方案的多剂量计划给予bG-CSF多肽或其变体。在一个实施方案中，多剂量计划为两个剂量方案。在一个实·施方案中，多剂量计划包括在动物分娩之前约I天至约14天给予动物第一个剂量并在在动物分娩后约4天至约7天给予动物第二个剂量。在另一实施方案中，多剂量计划包括在动物分娩之前约7天给予动物第一个剂量并在在动物分娩当天给予动物第二个剂量。还包括下列实施方案:
1.稳定的水性制剂，其包含bG-CSF多肽或其变体、缓冲物质和赋形剂，其中所述制剂基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯。2.如项I所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体与连接物、聚合物或生物活性分子连接。3.如项I或2所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体与水溶性聚合物连接。4.如项3所述的制剂，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。5.如项3或4所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约100 kDa的分子量。6.如项3至5中任一项所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约50 kDa的分子量。7.如项3至6中任一项所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约20 kDa的分子量。8.如项I至7中任一项所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF-T133pAF-20K PEG。9.如项I至8中任一项所述的制剂，其中bG-CSF多肽或其变体以约0.5至约12
克/升的量存在。10.如项I至9中任一项所述的制剂，其中bG-CSF多肽或其变体以约5克/升的
量存在。11.如项I至10中任一项所述的制剂，其中所述缓冲物质为柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐或其组合。
12.如项I至11中任一项所述的制剂，其中所述缓冲物质为柠檬酸盐或琥珀酸盐。13.如项I至12中任一项所述的制剂，其中所述缓冲物质为柠檬酸盐。14.如项I至12中任一项所述的制剂，其中所述缓冲物质为琥珀酸盐。15.如项I至14中任一项所述的制剂，其中所述缓冲物质具有约10 mM至约50mM的摩尔浓度。16.如项I至15中任一项所述的制剂，其中所述缓冲物质具有约30 mM的摩尔浓度。17.如项I至16中任一项所述的制剂，其中所述赋形剂为氯化钠、海藻糖、山梨
醇、精氨酸或其组合。18.如项I至17中任一项所述的制剂，其中所述赋形剂为精氨酸。19.如项18所述的制剂，其中精氨酸具有约100 mM至约500 mM的摩尔浓度。20.如项18或19所述的制剂，其中精氨酸具有约200至约300 mM的摩尔浓度。21.如项18至20中任一项所述的制剂，其中精氨酸具有约250 mM的摩尔浓度。
`
22.如项I至21中任一项所述的制剂，其中所述制剂具有约5.7至约6.6的pH。23.如项I至22中任一项所述的制剂，其中所述制剂具有约6.0至约6.3的pH。24.如项I至23中任一项所述的制剂，其中在压力贮存条件下在五天孵育期后所述制剂具有小于约2.1% wt/wt%的bG-CSF多肽或其变体的平均聚集体浓度。25.如项I至24中任一项所述的制剂，其中在加速贮存条件下在一天孵育期后所述制剂具有小于约1.5% wt/wt%的bG-CSF多肽或其变体的平均聚集体浓度。26.如项I至25中任一项所述的制剂，其任选包含一种或多种其它治疗成分。27.项I至26中任一项所述的制剂的冻干粉或粉末。28.水溶液，其通过将项27所述的冻干粉或粉末溶于水制备。29.用于制备项I至26中任一项所述的制剂的方法，其包括形成包含bG_CSF多肽或其变体、缓冲物质和赋形剂的稳定的水溶液，其中所述制剂基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯。30.治疗患有由bG-CSF调节的病症的动物的方法，其包括给予所述动物治疗有效量的项I至26中任一项所述的制剂。31.如项30所述的方法，其中所述病症为感染。32.如项31所述的方法，其中所述感染为乳腺炎并且其中所述动物为围产期奶牛。33.稳定的水性制剂，其包含bG-CSF多肽或其变体、柠檬酸盐或琥珀酸盐缓冲液、精氨酸和任选用于精氨酸的抗衡离子。34.如项33所述的制剂，其中所述制剂基本上不含聚山梨醇酯表面活性剂。35.如项33或34所述的制剂，其中所述bG_CSF多肽或其变体与连接物、聚合物或生物活性分子连接。36.如项33至35中任一项所述的制剂，其中所述bG_CSF多肽或其变体与水溶性聚合物连接。37.如项36所述的制剂，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
38.如项36或37所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约100kDa的分子量。39.如项36至38中任一项所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约50 kDa的分子量。40.如项36至39中任一项所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约20 kDa的
分子量。41.如项34至40中任一项所述的制剂，其中所述聚山梨醇酯表面活性剂为单月桂酸钠的聚氧乙烯衍生物。42.如项34至41中任一项所述的制剂，其中所述聚山梨醇酯表面活性剂为聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯。43.如项33至42中任一项所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF-T133pAF-20K PEG。44.如项43所述的制剂，其中bG-CSF-T133pAF_20K PEG以约0.5至约12克/升的量存在，所述柠檬酸盐缓冲液具有约30 mM的摩尔浓度，精氨酸具有约250 mM的摩尔浓度并且其中所述制剂具有约6.0的pH值。45.如项43或44所述的制剂，其中在25°C下的28天孵育期后所述制剂具有小于约 1.6% wt/wt% 的 bG-CSF-T133pAF-20K PEG 的平均聚集体浓度。46.如项43至45中任一项所述的制剂，其中在40°C下的3天孵育期后所述制剂具有小于约2.8% wt/wt%的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集体浓度。47.如项43至46中任一项所述的制剂，其中在强制搅拌研究后所述制剂具有约1.6% wt/wt%*更少的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集体浓度。48.如项43至47中任一项所述的制剂，其中在五个冻融循环后所述制剂具有小于约1.6% wt/wt%的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集体浓度。49.如项33至48中任一项所述的制剂，其中所述用于精氨酸的抗衡离子为氯离子或硫酸根离子。50.如项33至49中任一项所述的制剂，其任选包含一种或多种其它治疗成分。51.项33至50中任一项所述的制剂的冻干粉或粉末。52.水溶液，其通过将项51所述的冻干粉或粉末溶于水制备。53.用于制备项33至50中任一项所述的制剂的方法，其包括形成包含bG_CSF多肽或其变体、柠檬酸盐缓冲液、精氨酸和任选用于精氨酸的抗衡离子的稳定的水溶液。54.如项53所述的方法，其中所述制剂基本上不含聚山梨醇酯表面活性剂。55.如项53或54所述的方法，其中所述bG_CSF多肽或其变体为bG-CSF-T133pAF-20K PEG。56.治疗患有由bG-CSF调节的病症的动物的方法，其包括给予所述动物治疗有效量的项33至50中任一项所述的制剂。
57.如项56所述的方法，其中所述病症为感染。58.如项57所述的方法，其中所述感染为乳腺炎并且其中所述动物为围产期奶牛。59.稳定的水性制剂，其基本上由bG-CSF多肽或其变体、柠檬酸盐或琥珀酸盐缓冲液、精氨酸和任选用于精氨酸的抗衡离子组成。60.如项59所述的制剂，其中所述制剂基本上不含表面活性剂。61.如项59或60所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体与连接物、聚合物或生物活性分子连接。62.如项59至61中任一项所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体与水溶性聚合物连接。63.如项62所述的制剂，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。64.如项62或63所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约100kDa的分子量。65.如项62至64中任一项所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约50 kD的分子量。66.如项62至65中任一项所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约20 kDa的
分子量。67.如项60至66中任一项所述的制剂，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯表面活性剂。68.如项60至67中任一项所述的制剂，其中所述表面活性剂为单月桂酸钠的聚氧乙烯衍生物。69.如项60至68中任一项所述的制剂，其中所述表面活性剂为聚氧乙烯(20)山
梨糖醇酐单月桂酸酯。70.如项59至69中任一项所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF-T133pAF-20K PEG。71.如项70所述的制剂，其中bG-CSF-T133pAF-20K PEG以约0.5至约12克/升的量存在，所述柠檬酸盐缓冲液具有约30 mM的摩尔浓度，精氨酸具有约250 mM的摩尔浓度并且其中所述制剂具有约6.0的pH值。72.如项70或71所述的制剂，其中在25°C下的28天孵育期后所述制剂具有小于约 1.6% wt/wt% 的 bG-CSF-T133pAF-20K PEG 的平均聚集体浓度。73.如项70至72中任一项所述的制剂，其中在40°C下的3天孵育期后所述制剂具有小于约2.8% wt/wt%的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集体浓度。74.如项70至73中任一项所述的制剂，其中在强制搅拌研究后所述制剂具有约1.6% wt/wt%*更少的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集体浓度。75.如项70至74中任一项所述的制剂，其中在五个冻融循环后所述制剂具有小于约1.6% wt/wt%的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集体浓度。76.如项59至75中任一项所述的制剂，其中所述用于精氨酸的抗衡离子为氯离子或硫酸根离子。
77.如项59至76中任一项所述的制剂，其任选包含一种或多种其它治疗成分。78.项59至77中任一项所述的制剂的冻干粉或粉末。
79.水溶液，其通过将项78所述的冻干粉或粉末溶于水制备。
80.用于制备项59至77中任一项所述的制剂的方法，其包括形成基本上由bG-CSF多肽或其变体、柠檬酸盐缓冲液、精氨酸和任选用于精氨酸的抗衡离子组成的稳定的水溶液。
81.如项80所述的方法，其中所述制剂基本上不含表面活性剂。82.如项80或81所述的方法，其中所述bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF-T133pAF-20K PEG。83.治疗患有由bG-CSF调节的病症的动物的方法，其包括给予所述动物治疗有效量的项59至77中任一项所述的制剂。84.如项83所述的方法，其中所述病症为感染。85.如项84所述的方法，其中所述感染为乳腺炎并且其中所述动物为围产期奶牛。86.稳定的水性制剂，其基本上由bG-CSF-T133pAF_20K PEG、柠檬酸盐缓冲液、精氨酸和任选用于精氨酸的抗衡离子组成，其中所述柠檬酸盐缓冲液具有约30 mM的摩尔浓度，其中精氨酸具有约250 mM的摩尔浓度。实施例1
缓冲液和赋形剂筛选研究
能使用多种缓冲液和赋形剂(氯化钠、海藻糖和精氨酸)筛选在背景中不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯的bGCSF-T133-20K PEG制剂以评价产物稳定性。所有透析缓冲液的目标pH为pH 6.0ο为了比较，能制备在pH 6.0下包含10 mM磷酸盐、180 mM甘露醇和60 mM海藻糖的制剂。能在存在和不存在氧气的条件下评价制剂对蛋白质聚集和去聚乙二醇化的影响。能通过在2-8°C下透析I mL的bGCSF-T133-20K PEG进入各个制剂制备样品。能在归一化蛋白质浓度至5 mg/mL之前测定透析样品的蛋白质浓度。在透析和浓度归一化后，能将约3 X I mL的透析后并稀释的混合物填充至5 mL玻璃瓶中。能测试一组样品以提供初始条件。在测试前能将第二组在25°C/60%RH下储存5天。能在冻干室中将第三组样品脱气，在惰性环境(氮气)下封闭，然后在测试前在25°C/60%RH下储存5天。如果在5天后通过SEC测定的聚集体水平 2.0%，则能将脱气和未脱气样品二者在40°C下孵育一天。在孵育五天后，能测定各个样品的蛋白质浓度。表I显示蛋白质浓度。表1.来自缓冲液和赋形剂筛选研究的蛋白质浓度
权利要求
1.定的水性制剂，其包含bG-CSF多肽或其变体、缓冲物质和赋形剂，其中所述制剂基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯。
2.按权利要求1所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体与连接物、聚合物或生物活性分子连接。
3.按权利要求1所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体与水溶性聚合物连接。
4.按权利要求3所述的制剂，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
5.按权利要求4所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约100 kDa的分子量。
6.按权利要求4所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约50 kDa的分子量。
7.按权利要求4所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约20kDa的分子量。
8.按权利要求1所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF-T133pAF-20KPEG。
9.按权利要求1所述的制剂，其中 bG-CSF多肽或其变体以约0.5至约12克/升的量存在。
10.按权利要求9所述的制剂，其中bG-CSF多肽或其变体以约5克/升的量存在。
11.按权利要求1所述的制剂，其中所述缓冲物质为柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐或其组合。
12.按权利要求11所述的制剂，其中所述缓冲物质为柠檬酸盐或琥珀酸盐。
13.按权利要求12所述的制剂，其中所述缓冲物质为柠檬酸盐。
14.按权利要求12所述的制剂，其中所述缓冲物质为琥珀酸盐。
15.按权利要求12所述的制剂，其中所述缓冲物质具有约10mM至约50 mM的摩尔浓度。
16.按权利要求15所述的制剂，其中所述缓冲物质具有约30mM的摩尔浓度。
17.按权利要求1所述的制剂，其中所述赋形剂为氯化钠、海藻糖、山梨醇、精氨酸或其组合。
18.按权利要求17所述的制剂，其中所述赋形剂为精氨酸。
19.按权利要求18所述的制剂，其中精氨酸具有约100mM至约500 mM的摩尔浓度。
20.按权利要求19所述的制剂，其中精氨酸具有约200至约300mM的摩尔浓度。
21.按权利要求20所述的制剂，其中精氨酸具有约250mM的摩尔浓度。
22.按权利要求1所述的制剂，其中所述制剂具有约5.7至约6.6的pH。
23.按权利要求22所述的制剂，其中所述制剂具有约6.0至约6.3的pH。
24.按权利要求1所述的制剂，其中在压力贮存条件下在五天孵育期后所述制剂具有小于约2.1% wt/wt%的bG-CSF多肽或其变体的平均聚集体浓度。
25.按权利要求1所述的制剂，其中在加速贮存条件下在一天孵育期后所述制剂具有小于约1.5% wt/wt%的bG-CSF多肽或其变体的平均聚集体浓度。
26.按权利要求1所述的制剂，其任选包含一种或多种其它治疗成分。
27.权利要求1所述的制剂的冻干粉或粉末。
28.溶液，其通过将权利要求27所述的冻干粉或粉末溶于水制备。
29.关于制备权利要求1所述的制剂的方法，其包括形成包含bG-CSF多肽或其变体、缓冲物质和赋形剂的稳定的水溶液，其中所述制剂基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯。
30.疗患有由bG-CSF调节的病症的动物的方法，其包括给予所述动物治疗有效量的权利要求1所述的制剂。
31.按权利要求30所述的方法，其中所述病症为感染。
32.按权利要求31所述的方法，其中所述感染为乳腺炎并且其中所述动物为围产期奶牛。
33.定的水性制剂，其包含bG-CSF多肽或其变体、柠檬酸盐或琥珀酸盐缓冲液、精氨酸和任选用于精氨酸的抗衡离子。
34.按权利要求33所述的制剂，其中所述制剂基本上不含聚山梨醇酯表面活性剂。
35.按权利要求33所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体与连接物、聚合物或生物活性分子连接。
36.按权利要求33所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体与水溶性聚合物连接。
37.按权利要求36所述的制剂，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
38.按权利要求37所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约100 kDa的分子量。
39.按权利要求37所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约50 kDa的分子量。
40.按权利要求37所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约20kDa的分子量。
41.按权利要求34所述的制剂，其中所述聚山梨醇酯表面活性剂为单月桂酸钠的聚氧乙烯衍生物。
42.按权利要求34所述的制剂，其中所述聚山梨醇酯表面活性剂为聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯。
43.按权利要求33所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF-T133pAF-20KPEG。
44.按权利要求43所述的制剂，其中bG-CSF-T133pAF-20KPEG以约0.5至约12克/升的量存在，所述柠檬酸盐缓冲液具有约30 mM的摩尔浓度，精氨酸具有约250 mM的摩尔浓度并且其中所述制剂具有约6.0的pH值。
45.按权利要求43所述的制剂，其中在25°C下的28天孵育期后所述制剂具有小于约1.6% wt/wt% 的 bG-CSF-T133pAF-20K PEG 的平均聚集体浓度。
46.按权利要求43所述的制剂，其中在40°C下的3天孵育期后所述制剂具有小于约2.8% wt/wt% 的 bG-CSF-T133pAF-20K PEG 的平均聚集体浓度。
47.按权利要求43所述的制剂，其中在强制搅拌研究后所述制剂具有约1.6%wt/wt%或更少的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集体浓度。
48.按权利要求43所述的制剂，其中在五个冻融循环后所述制剂具有小于约1.6% wt/wt%的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集体浓度。
49.按权利要求33所述的制剂，其中所述用于精氨酸的抗衡离子为氯离子或硫酸根离子。
50.按权利要求33所述的制剂，其任选包含一种或多种其它治疗成分。
51.权利要求33所述的制剂的冻干粉或粉末。
52.溶液，其通过将权利要求51所述的冻干粉或粉末溶于水制备。
53.关于制备权利要求33所述的制剂的方法，其包括形成包含bG-CSF多肽或其变体、柠檬酸盐缓冲液、精氨酸和任选用于精氨酸的抗衡离子的稳定的水溶液。
54.按权利要求53所述的方法，其中所述制剂基本上不含聚山梨醇酯表面活性剂。
55.按权利要求53所述的方法，其 中所述bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF-T133pAF-20KPEG。
56.疗患有由bG-CSF调节的病症的动物的方法，其包括给予所述动物治疗有效量的权利要求33所述的制剂。
57.按权利要求56所述的方法，其中所述病症为感染。
58.按权利要求57所述的方法，其中所述感染为乳腺炎并且其中所述动物为围产期奶牛。
59.定的水性制剂，其基本上由bG-CSF多肽或其变体、柠檬酸盐或琥珀酸盐缓冲液、精氨酸和任选用于精氨酸的抗衡离子组成。
60.按权利要求59所述的制剂，其中所述制剂基本上不含表面活性剂。
61.按权利要求59所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体与连接物、聚合物或生物活性分子连接。
62.按权利要求59所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体与水溶性聚合物连接。
63.按权利要求62所述的制剂，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
64.按权利要求63所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约100 kDa的分子量。
65.按权利要求63所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约0.1 kDa至约50 kD的分子量。
66.按权利要求63所述的制剂，其中所述水溶性聚合物具有约20kDa的分子量。
67.按权利要求60所述的制剂，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯表面活性剂。
68.按权利要求67所述的制剂，其中所述表面活性剂为单月桂酸钠的聚氧乙烯衍生物。
69.按权利要求68所述的制剂，其中所述表面活性剂为聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯。
70.按权利要求59所述的制剂，其中所述bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF-T133pAF_20KPEG。
71.按权利要求70所述的制剂，其中bG-CSF-T133pAF-20K PEG以约0.5至约12克/升的量存在，所述柠檬酸盐缓冲液具有约30 mM的摩尔浓度，精氨酸具有约250 mM的摩尔浓度并且其中所述制剂具有约6.0的pH值。
72.按权利要求70所述的制剂，其中在25°C下的28天孵育期后所述制剂具有小于约·1.6% wt/wt% 的 bG-CSF-T 133pAF-20K PEG 的平均聚集体浓度。
73.按权利要求70所述的制剂，其中在40°C下的3天孵育期后所述制剂具有小于约·2.8% wt/wt% 的 bG-CSF-T 133pAF-20K PEG 的平均聚集体浓度。
74.按权利要求70所述的制剂，其中在强制搅拌研究后所述制剂具有约1.6%wt/wt%或更少的bG-CSF-T 133pAF-20K PEG的平均聚集体浓度。
75.按权利要求70所述的制剂，其中在五个冻融循环后所述制剂具有小于约1.6% wt/wt%的bG-CSF-T 133pAF-20K PEG的平均聚集体浓度。
76.按权利要求70所述的制剂，其中所述用于精氨酸的抗衡离子为氯离子或硫酸根离子。
77.按权利要求59所述的制剂，其任选包含一种或多种其它治疗成分。
78.权利要求59所述的制剂的冻干粉或粉末。
79.溶液，其通过将权利要求78所述的冻干粉或粉末溶于水制备。
80.关于制备权利要求59所述的制剂的方法，其包括形成基本上由bG-CSF多肽或其变体、柠檬酸盐缓冲液、精氨酸和任选用于精氨酸的抗衡离子组成的稳定的水溶液。
81.按权利要求80所述的 方法，其中所述制剂基本上不含表面活性剂。
82.按权利要求80所述的方法，其中所述bG-CSF多肽或其变体为bG-CSF-T133pAF-20KPEG。
83.疗患有由bG-CSF调节的病症的动物的方法，其包括给予所述动物治疗有效量的权利要求59所述的制剂。
84.按权利要求83所述的方法，其中所述病症为感染。
85.按权利要求84所述的方法，其中所述感染为乳腺炎并且其中所述动物为围产期奶牛。
86.定的水性制剂，其基本上由bG-CSF-T133pAF-20KPEG、柠檬酸盐缓冲液、精氨酸和任选用于精氨酸的抗衡离子组成，其中所述柠檬酸盐缓冲液具有约30 mM的摩尔浓度，其中精氨酸具有约250 mM的摩尔浓度。
全文摘要
本发明提供了包含bG-CSF多肽或其变体、缓冲物质和赋形剂的稳定的水性制剂，其中所述制剂基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯。本发明还提供了使用所述制剂的冻干形式或粉末形式的方法以及制备所述制剂的方法。
文档编号C07K14/535GK103096916SQ201180045228
公开日2013年5月8日 申请日期2011年9月22日 优先权日2010年9月23日
发明者J.达瓦尼诺, C.N.哈, A.V.克罗茨 申请人:伊莱利利公司