专利名称：Cd40抗体制剂和方法
CD40抗体制剂和方法
背景技术：
CD40是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。其在抗原呈递细胞(B细胞、 树突细胞、单核细胞)、造血前体、内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞以及多数人肿瘤上表达。(Grewal & Flavell, Ann. Rev. Immunol. , 1996,16 :111-35 ;Toes & Schoenberger, Seminars in Immunology, 1998,10(6) :443-8)。使用 CD40 激动剂的研究报道了对 CD40 受体的刺激引发了与抗肿瘤活性相关的级联效果。例如，已经表明对抗原呈递细胞上CD40 受体的刺激可增强它们的成熟、抗原呈递功能、共刺激潜能及其免疫调节细胞因子的释放 (Lee 等，PNAS USA, 1999,96(4) :1421-6 ；Cella 等，J. Exp. Med. , 1996,184(2) :747-52)。 已经报道⑶40激动剂促进了⑶40+肿瘤的凋亡并提高它们被树突细胞加工的能力(von Leoprechting 等，Cancer Res. ,1999,59 1287-94 ；Sotomayo 等，Nature Medicine,1999, 5(7) :780-87 ；Eliopoulos 等，Mol. Cell Biol.，2000，29 (15) :5503-15 ;Ziebold 等，Arch. Immunol. Therapiae Experimentalis,2000,48(4) :225-33 ；Hoffmann 等，J. Immunol., 2001,24(2) :162-71)。已经在动物模型中说明了这些免疫刺激和直接抗肿瘤效果的重要性，其中已经表明⑶40激动剂抗体能防止肿瘤生长并逆转肿瘤耐受性(Diehl等，Nature Med.，1999，5 (7) :774-9 ；Francisco 等，Cancer Res.，2000,60 (12) :32225-31)。以下专利公开中涉及 CD40 抗体:U. S. 5，786，456 ；U. S. 5，674，492 ；WO 02/088186 ；US2003059427 ； US20020142358 ；WO 01/56603 ；U.S.5，801，227 ；EP806963 ；W088/06891 和 W094/04570。然而，对于CD40抗体还没有描述高度有效的给药方法和制剂。适用于这样治疗中的稳定制剂也是有用的。发明概述本发明涉及治疗需要这样治疗的患者的癌症的方法，包括将CD40激动剂抗体或其片段给药于所述患者，其中根据至少两个循环的间歇给药方案来给药所述抗体，每个循环包括(a)给药阶段，该过程中将治疗有效量的所述⑶40激动剂抗体给药于所述患者，和此后(b)静息阶段。一实施方案中，给药产生了 0.0148/1111至1(^8/1111的抗体血浆浓度， 维持至少三小时，而静息阶段为至少1周。另一实施方案中，给药阶段为至少一天、1-5天或 1-3天。另一实施方案中，静息阶段为1-8、1-6周，2-5周，或3-4周。特定实施方案中，⑶40激动剂抗体的治疗有效量产生所述抗体约0. 03μ g/ml 至 10 μ g/ml,约 0. 03 μ g/ml 至 1 μ g/ml,约 0. 03 μ g/ml 至 0. 3 μ g/ml,或约 0. 1 μ g/ml 至 0.3 μ g/ml的血浆浓度，持续3至120小时。一些实施方案中，所指明的血浆浓度维持至少一天，24至30小时，24至36小时，24至48小时，24至72小时，24至96小时，或M至120 小时。一些实施方案中，血浆浓度维持3至96或12至72小时。特定实施方案中，在给药阶段过程中给药的CD40激动剂抗体的治疗有效量为约 0. 03 至 3. 0mg/kg/ 天，0. 1 至 3. 0mg/kg/ 天，0. 1 至 1. 0mg/kg/ 天，或约 0. 1 至 0. 3mg/kg/ 天。一实施方案中，给药所述剂量持续1-5天或1-3天，连续或隔天。如上结合肿瘤治疗所述的，CD40激动剂抗体的间歇给药方案，在提高患者的免疫应答中也是有用的，因此，本发明还提供了这样的用途。特定实施方案中，患者免疫应答的提高使得患者全血中B细胞上CD23或MHC-II表达的提高，例如，可以在给药阶段结束时进行测量。一些实施方案中，将抗CD40抗体给药于患有原发和/或联合免疫缺陷的患者，包括⑶40-依赖性高-IgM性免疫缺陷综合征、常见的可变型免疫缺陷、Bruton' s丙种球蛋白缺乏血症、IgG亚类缺乏和X-连锁的SCID(常见γ链突变)。一些实施方案中，给药抗 CD40抗体来治疗免疫抑制患者，例如由于化疗，或具有免疫-衰弱疾病，包括任何获得性免疫缺陷疾病，如HIV。一些实施方案中，给药抗CD40抗体来提高老年患者的免疫力。一些实施方案中，给药抗CD40抗体来治疗细菌、病毒、真菌或寄生虫感染的患者。一些实施方案中，可以将人激动剂抗CD40抗体预防性地给药于患者来预防感染或减少感染次数或减轻感染严重程度，这些患者由于年龄、疾病或总体差的健康状况而易于受到感染的影响。本发明还提供了治疗患者肿瘤的方法，包括给药⑶40激动剂抗体和DNA复制抑制剂，优选钼衍生物，尤其是顺钼。特定实施方案中，将顺钼静脉内给药。一些实施方案中， 顺钼的给药量为每m2患者体表面积约25至300mg，每m2约50至150mg，或每m2约75至 IOOmgo 一实施方案，以一次剂量给药顺钼(例如，单次静脉内输注)。另一实施方案中，在 2-5天内给药。特定实施方案中，联合顺钼给药的CD40抗体的给药剂量为约0. 1至3. Omg/ kg,或约 0. 1 至 1. Omg/kg,或约 0. 1 至 0. 3mg/kg。另一方面中，顺钼的给药联合CD40抗体的间歇给药方案，在一个或多个给药阶段或静息阶段中给药顺钼。另一方面中，本发明涉及治疗需要这样治疗的患者的肿瘤的方法，通过以低于 lmg/kg/天的剂量将CD40激动剂抗体或其片段给药于患者，其中由给药抗体引起的患者 Cmax血清浓度低于50 μ g/ml。一实施方案中，剂量为0. 1至0. 3mg/kg,患者的抗体Cmax血清浓度为 0.5 M 10 μ g/ml。另一方面中，本发明涉及适于非肠道给药的稳定液体药物制剂，包括pH为 5. 0-6. 0的抗⑶40抗体和药物学上可接受的载体，制剂稳定至少三个月。制剂优选具有至少约5mg/ml的CD40抗体浓度。一实施方案中，制剂包括抗CD40抗体、醋酸钠、氯化钠和聚山梨酸酯80。优选，其含有20mM醋酸钠、140mM氯化钠和0. aiig/mL聚山梨酸酯80。抗⑶40 抗体优选具有选自抗体21. 4. 1或3. 1. 1的抗体的氨基酸序列。附图简述
图1显示了在免疫细胞存在下⑶40激动剂抗体抑制了⑶40(-)肿瘤K562的生长。 在肿瘤攻击时动物接受单次注射(IP)21.4. 1或KLH。在第21天以mm2记录每个个体动物的肿瘤大小(每组10只动物)。研究是至少5次单独研究的代表。图2显示了⑶40激动剂抑制了人乳房肿瘤细胞系BT474的生长。数值表示注射后第53天的各个肿瘤测量值，每组使用6只动物。研究是两次单独实验的代表。通过水平线表示每个处理组的平均值。图3显示⑶40激动剂抑制了⑶40 (+)肿瘤的生长，单独或在免疫细胞存在下。在肿瘤攻击时动物接受单次注射21. 4. 1。(a)单独注射肿瘤或(b)与人外周血T细胞和DC 一起。数据点表示每个个体动物的肿瘤大小(mm2)。通过水平线表示每个处理组(N = 10) 的平均值。研究是至少3次单独实验的代表。图4显示了⑶40激动剂抗体延迟由B细胞淋巴瘤(Daudi)诱导的死亡率的效果。数据点指的是存活动物的平均数目。每组N =10。图5显示了⑶40激动剂抗体和顺钼联合治疗引起的肿瘤消退。优选实施方案的详述如在此所用的，术语“激动剂CD40抗体”或“激动剂抗CD40抗体”意思是当加入表达⑶40的细胞、组织或生物体中时，特异性结合人⑶40分子并提高一种或多种⑶40活性至少约20%的抗体。一些实施方案中，抗体激活⑶40活性至少40%、50%、60%、70%、 80%或85%。一些实施方案中，在⑶40L存在下发生激活。一些实施方案中，使用全血表面分子上调测试来测量激活抗体的活性。另一实施方案中，使用测量IL-12释放的树突细胞测试来测量激活抗体的活性。另一实施方案中，使用体内肿瘤模型来测量激活抗体的活性。如在此所用的术语“抗体”指的是完整抗体，或其与完整抗体竞争特异性结合的结合片段。通过重组DNA技术，或通过对完整抗体的酶促或化学裂解来产生结合片段。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和单链抗体。可以理解在此涉及完整(例如，整个、全长等)抗体时包括重链具有末端赖氨酸缺失的抗体，其通常在重组表达过程中发生。优选，激动剂CD40抗体是人抗体。如在此所用的，术语“人抗体”意思是其中可变和恒定结构域序列源自人序列的抗体。人CD40抗体详细描述于2001年11月9日申请的U. S.临时申请no. 60/348, 980和2002年11月8日申请的PCT国际申请No. PCT/ US02/36107(现在公开为WO 03/040170)中，整个公开内容在此引入作为参考。人抗体在本发明的治疗方法中提供了实质性的优势，因为预期它们可最小化与人患者中使用非人抗体相关的免疫原性和过敏性反应。用于本发明的示范性人抗⑶40抗体包括具有指定为3. 1. 1,3. 1. 1H-A78T、 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A、7. 1. 2,10. 8. 3,15. 1. 1,21. 4. 1,21. 2. 1,22. 1. 1,22. 1. 1H-C109A、 23. 5. 1,23. 25. 1,23. 28. 1,23. 28. 1H_D16E、23. 29. 1,24. 2. 1、3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A/3. 1 .1L-L4M-L83V和23. 28. 1L-C92A的抗体的氨基酸序列的抗体，以及包括任何示范性抗体的 CDR或可变区的抗体。识别相同或相似表位的抗体或其片段，和任一种示范性抗体一样，也可以用于本发明中。即，因为本领域技术人员基于在此所提供的公开内容，可以理解与本发明抗体(例如，3. 1. 1,3. 1. 1Η-Α78Τ、3· 1. 1H-A78T-V88A_V97A、7. 1. 2,10. 8. 3,15. 1. 1,21. 4. 1,21. 2. 1、 22. 1. 1,22. 1. 1H-C109A、23. 5. 1,23. 25. 1,23. 28. 1,23. 28. 1H_D16E、23. 29. 1,24. 2. 1、3· 1. 1H-A78T-V88A-V97A/3. 1. 1L-L4M-L83V 和 23. 28. 1L-C92A，等)竞争的抗体可以如在此别处所公开的一样有用。使用本领域公知的表征抗体的方法可以容易地鉴定与在此列举的抗体竞争的目标抗体。更具体地，评估抗体结合特征的测试以及将那些结合特征与另一种抗体相比较的测试，是本领域技术人员公知的。这样的方法包括，但不限于，基于ELISA的测试， 使用BIAcore结合研究以及详细描述于Walker等的US专利申请公开No. 2003/0157730A1 中的那些。如在此所用的关于抗体的术语“竞争”，意思是第一个抗体与第二个抗体竞争结合，其中与第二个抗体不存在时第一个抗体的结合相比较，在第二个抗体存在下，可检测到第一个抗体与其同源表位的结合降低。或者，可以是(但无需是)在第一个抗体存在下， 可检测到第二个抗体与其表位的结合也降低了。即，第一个抗体可以抑制第二个抗体与其表位的结合而第二个抗体没有抑制第一个抗体与其表位的结合。然而，当每个抗体可检测地抑制另一个抗体与其同源表位或配体的结合，不管程度是相同、更高或更低，认为抗体彼此相互“交叉竞争”结合它们各自的表位。例如，交叉竞争抗体可以结合本发明抗体(例如，3. 1. 1,3. 1. 1Η-Α78Τ、3· 1. 1H-A78T-V88A_V97A、7. 1. 2,10. 8. 3,15. 1. 1,21. 4. 1,21. 2. 1、 22. 1. 1,22. 1. 1H-C109A、23. 5. 1,23. 25. 1,23. 28. 1,23. 28. 1H_D16E、23. 29. 1,24. 2. 1、3· 1. 1H-A78T-V88A-V97A/3. 1. 1L-L4M-L83V 和 23. 28. 1L-C92A)结合的表位，或表位的一部分。 本发明包括竞争和交叉竞争抗体两者。与产生这样的竞争或交叉竞争的机理(例如，位阻， 构象改变或与共同表位或其片段结合等)无关，本领域技术人员基于在此提供的教导将认识到这样的竞争和/或交叉竞争抗体被包括在内并可用于在此所公开的方法中。此外，可以通过一个或多个氨基酸残基的置换、添加或缺失来进一步修饰示例抗体而不消除抗体结合抗原并发挥其激动剂功能的能力。实际上，称为“3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A/3. 1. 1L-L4M-L83V”的抗体，在重链可变区中包括三个氨基酸置换，即氨基酸残基编号 78的丙氨酸置换为苏氨酸，氨基酸残基编号88的缬氨酸置换为丙氨酸，和氨基酸残基编号 97的缬氨酸置换为丙氨酸(SEQ ID NO :9)，所有均相对于抗体3. 1. 1的重链可变区的氨基酸序歹Ij (SEQ ID NO 1) ο 此外，3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A/3. 1. 1L-L4M-L83V 抗体进一步包括轻链可变区中氨基酸残基编号4的亮氨酸至甲硫氨酸的氨基酸置换和氨基酸残基编号83 的亮氨酸至缬氨酸的置换(SEQ I D NO :10)，与抗体3. 1. 1的轻链可变区的氨基酸序列相比较(SEQ I D NO 3)。3. 1. 1 和 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A/3. 1. 1L-L4M-L83V 抗体的重链 (SEQ ID NO 2)和轻链(SEQ ID NO 4)恒定区的氨基酸序列是相同的。抗体3. 1. 1Η-Α78Τ -V88A-V97A/3. 1. 1L-L4M-L83V也称为“3. 1. 1H3L2”来反映出相对于抗体3. 1. 1，该抗体包括重链中的三个氨基酸置换和轻链中的两个氨基酸置换。因此，一些实施方案中，可以通过例如⑶R或框架区中一至十个，一至五个，或一至三个氨基酸残基的置换、添加或缺失来修饰示例抗体。这些示例抗体和产生它们的方法详细描述于2001年11月9日申请的U. S.临时申请no. 60/；348，980和2002年11月8日申请的PCT国际申请No. PCT/US02/36107(W0 03/040170)中。然而，本发明不受限于这些或任何其他的氨基酸置换。相反，本领域技术人员根据在此所提供的教导将认识到本发明包括多种氨基酸置换。杂交瘤3. 1. 1,7. 1. 2、10. 8. 3、15. 1. 1和21. 4. 1根据布达佩斯条约于2001年8月 6日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209。杂交瘤 21. 2. 1,22. 1. 1,23. 5. 1,23. 25. 1,23. 28. 1,23. 29. 1 和 24. 2. 1 于 2002 年7月16日保藏于ATCC。已经指定杂交瘤为以下保藏编号
杂交瘤保藏No.3. 1. 1(LN 15848)PTA-36007. 1. 2(LN 15849)PTA-360110「8;3-("LrN"15-8-50)--P-T-A-36 0215. 1. 1(LN15851)PTA-360321.4. 1(LN15853)PTA-360521. 2. 1(LN15874)PTA-454922. 1. 1(LN15875)PTA-455023. 5. 1(LN15855)PTA-454823. 25.1 (LN15876)PTA-455123. 28.1 (LN15877)PTA-455223. 29.1 (LN 15878)PTA-455324. 2. 1(LN15879)PTA-4554这些抗体的序列是已知的，并描述于WO 03/040170中, 些抗体中两个的重链和轻链的氨基酸序列抗体3. 1. 1
为了方便，以下显示了这
权利要求
1.激活CD40活性至少40%的CD40激动剂抗体或其片段用于制备治疗患者的癌症的药物的用途，其中所述药物适于根据至少两个循环的间歇给药方案给药所述抗体，每个循环包括(a)给药阶段，该过程中将治疗有效量的所述CD40激动剂抗体给药于所述患者，此后，(b)静息阶段；其中给药的CID40激动剂抗体的治疗有效量是0. 03至3. Omg/kg/天，持续1-5天，连续或隔天；且静息阶段是1-8周。
2.激活CD40活性至少40%的CD40激动剂抗体或其片段用于制备在患者中增强免疫应答的药物的用途，其中所述药物适于根据至少两个循环的间歇给药方案给药所述抗体， 每个循环包括(a)给药阶段，该过程中将治疗有效量的所述⑶40激动剂抗体给药于所述患者，此后，(b)静息阶段；其中给药的CD40激动剂抗体的治疗有效量是0. 03至3. Omg/kg/ 天，持续1-5天，连续或隔天；且静息阶段是1-8周。
3.权利要求1或2的用途，其中治疗有效量产生所述抗体0.01 μ g/ml至10 μ g/ml的血浆浓度持续至少三小时，且静息阶段为至少1周。
4.根据权利要求1或2的用途，其中治疗有效量产生0.03 μ g/ml至1. 0 μ g/ml的血浆浓度。
5.根据权利要求1-4任一项的用途，其中所述抗体选自具有抗体3.1. 1,3. 1. 1H-A78T、 3.1.1H-A78T-V88A-V97A.3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V、7.1. 2、 10. 8. 3,15. 1. 1,21. 4. 1,21. 2. 1,22. 1. 1,22. 1. 1H_C109A、23. 5. 1,23. 25. 1,23. 28. 1、 23. 28. 1H-D16E、23. 29. 1,24. 2. 1、3. 1. 1L-L4M-L83V 和 23. 28. 1L-C92A 的氨基酸序列的抗体。
6.根据权利要求1-4任一项的用途，其中所述抗体包括选自称为3.1. 1,3. 1. 1H-A78T、 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A.3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A/3. 1. 1L-L4M-L83V、7. 1. 2、 10. 8. 3,15. 1. 1,21. 4. 1,21. 2. 1,22. 1. 1,22. 1. 1H_C109A、23. 5. 1,23. 25. 1,23. 28. 1、 23. 28. 1H-D16E、23. 29. 1,24. 2. 1,3. 1. 1L-L4M-L83V 禾口 23. 28. 1L-C92A 的抗体的抗体的 CDR或可变区。
7.根据权利要求1-4任一项的用途，其中所述抗体与选自称为3.1. 1,3. 1. 1H-A78T、 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A.3. 1. 1L-L4M-L83V、3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1. 1L-L4M-L8 3V、7. 1. 2,10. 8. 3,15. 1. 1,21. 4. 1,21. 2. 1,22. 1. 1,22. 1. 1H_C109A、23· 5. 1,23. 25. 1、 23. 28. 1,23. 28. 1H_D16E、23. 29. 1,24. 2. 1 和 23. 28. IL-C 92A 的抗体的 CD40 抗体结合相同的表位。
8.根据权利要求1-4任一项的用途，其中所述抗体与选自称为3.1. 1,3. 1. 1H-A78T、 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A、7. 1. 2,10. 8. 3,15. 1. 1,21. 4. 1,21. 2. 1,22. 1. 1,22. 1. 1H-C109A、 23. 5. 1,23. 25. 1,23. 28. 1,23. 28. 1H_D16E、23. 29. 1,24. 2. 1,3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A/3. 1. IL -L4M-L83V和23. 28. 1L-C92A的抗体的CD40抗体竞争。
9.根据权利要求1-4任一项的用途，其中所述抗体具有选自21.4.1,3. 1. 1和3. 1. IH-A78T-V88A-V97A/3. 1. 1L-L4M-L83V 的抗体的氨基酸序列。
10.适于非肠道给药的稳定液体药物制剂，包括pH5.0-6. 0的⑶40激动剂抗体和药物学上可接受的载体，所述制剂稳定至少三个月，其中所述抗CD40抗体具有21. 4. 1抗体的氨基酸序列，其中所述抗体的浓度为至少约5mg/ml，且其中所述药学上可接受的载体选自醋酸钠、氯化钠和聚山梨酸酯80。
11.权利要求10的制剂，含有醋酸钠、氯化钠和聚山梨酸酯80。
全文摘要
本发明涉及CD40抗体制剂和方法。具体而言，本发明提供了治疗患者肿瘤的方法，包括根据间歇给药时间表将CD40激动剂抗体给药于所述患者。本发明还提供了治疗患者肿瘤的方法，包括给药CD40激动剂抗体和DNA复制抑制剂的组合。还提供了治疗中所用的制剂。
文档编号C07K16/28GK102552905SQ20121000286
公开日2012年7月11日 申请日期2004年12月9日 优先权日2003年12月22日
发明者J·D·库斯马诺, R·P·格拉杜, V·贝蒂安 申请人:辉瑞产品公司