专利名称：具有耐盐功能的基因、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有耐盐功能的基因、其编码蛋白及其应用。特别涉及一种盐藻 {Dunaliella viridis)硫氧还蛋白(thioredoxin)基因DvTRX的核苷酸序列,及其编码蛋白及其在提高生物耐盐能力和在改良农作物性状中的应用。
背景技术：
世界人口日益增长，耕地面积日趋减少，提高农作物产量成为了解决这对矛盾的重要途径。然而，土壤盐溃化、干旱、极端温度和营养贫瘠等各种环境胁迫严重影响了农作物的生长和发育并降低其产量。植物遭受逆境胁迫时，在初期阶段会造成植物体离子失衡和渗透紊乱；胁迫的延续或加重还常常会伴随活性氧的产生和氧化胁迫的发生。盐碱化是影响植物生长的最重要的环境压力之一，它严重影响了农作物的产量和生产力。世界20% 的可耕土地严重的盐溃化，严重影响了粮食的产量。大量实验证明转基因植物中活性氧清除因子的过量表达，或具有更高活性氧清除功能的突变体对环境胁迫，具有更强的耐受性。 研究生物的抗盐机制，利用分子生物学技术来获得抗性基因，揭示植物与逆境之间的关系， 辅助作物育种，已经成为了提高农作物产量的有效途径之一。杜氏藻属(JJunaliella)是自然界中广泛存在的真核单细胞绿藻,广泛分布于盐湖、海洋、盐土等高盐度的环境中，尤其在高盐水域中是主要种群，很容易从自然环境中分离得到。咎MiDunaliella ririt/is)是杜氏藻属中具有代表性的一个种。该种又称杜氏盐藻、绿色杜氏藻、盐生绿色杜氏藻等。对环境具有极强的适应能力，是已知最耐盐的真核生物能耐受高盐、重金属、强烈紫外线辐射等环境胁迫。因此，盐藻成为了一个重要的耐逆基因资源宝库。硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)是一类广泛存在于生物体内的多功能酸性蛋白。硫氧还蛋TRX家族是一类小分子量(约12 kD)的蛋白质，普遍存在于从原核生物到高等真核生物的几乎所有生物个体中。硫氧还蛋白具有多种生物学功能，对维持生物体内稳定的氧化还原状态具有重要的作用。其功能绝大多数是依赖于硫氧还蛋白还原靶蛋白中的二硫键。所有硫氧还蛋白均有一个保守的氧化还原活性位点氨基酸基序， Cys-Gly-Pro-Cys (CGPC)，活性中心有两个具有氧还活性的半胱氨酸残基，2个Cys残基可通过转移2个电子和2个质子可逆地形成二硫化物，为一系列生理反应提供氧化还原对。除了还原靶蛋白的二硫键之外，它还作为H+供体参与对酶的调节，对转录因子进行调控及在氧化逆境中发挥作用。Trx具有调节细胞生长、抑制凋亡、调节基因转录等功能。Trx还与植物耐逆性相关，如参与植物抗旱、耐热和抗氧化胁迫过程，调节抗逆基因的表达等。目前，还没有文献报到硫氧还蛋白具有耐盐的功能。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有耐盐功能的基因，该基因是从盐藻
3{Dunaliella viridis)中分离出来的硫氧还蛋白(thioredoxin)基因,称为iVTEf。本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。本发明的目的之三在于提供一种载体，该载体含有本发明的基因。本发明的目的之四在于提供一种含有本发明基因的宿主细胞。本发明目的之五是提供利用基因提高生物耐盐性方面的应用，其特征在于含有 /VTET基因的盐敏感酵母细胞可以获得一定的耐盐能力。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种具有耐盐功能的基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO 1所不的DNA序列。上述的基因的编码蛋白，其特征在于该蛋白是SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组表达载体。一种上述的具有耐盐功能的基因在提高生物体耐盐能力中的应用。一种上述的具有耐盐功能的基因在改良农作物性状中的应用。本发明通过逆境胁迫的方法，从盐藻中克隆到了一个硫氧还蛋白基因，并通过实验证明了它还具有耐盐的功能。隆分析盐藻中TRX基因有助于深入理解盐藻抗盐机制，同时也会为生物耐盐基因工程和分子育种提供了基因资源。本发明首次从盐藻 viridis)中分离到硫氧还蛋白(thioredoxin)基因iVTET，并通过转化酵母细胞证明该基因还具有耐盐功能和改良农作物性状的应用价值。
图I为本发明的/VTET基因编码蛋白的物种间同源性分析图。方框标注为/VTET 基因具有氧化还原活性位点氨基酸基序，Cys-Gly-PiO-Cys (CGPC)。图2为本发明的/VTET基因编码的蛋白进化分析图，表明该编码蛋白属于硫氧还蛋白家族。图3为本发明的融合GST标签的/VTET基因编码蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M:蛋白 marker ；1 :pGEX4T_l 全菌；2 :pGEX4T_l 上清；3 :pGEX4T_l 沉淀；4 pGEX4T-l-TRX 全菌；5 :pGEX4T-l_TRX 上清；6 :pGEX4T-l_TRX 沉淀；7 :未诱导 PGEX4T-1-TRX全菌；8 :未诱导pGEX4T_l_TRX上清；9 :未诱导pGEX4T_l_TRX沉淀。以上红色箭头所示为诱导表达融合GST标签的/VTET基因编码蛋白。图4为本发明的/VTET基因在酵母突变体似沒中的功能分析。即含伽/ET完整 ORF的EST序列插入到酵母表达载体PAJ401中，转化酵母盐敏感突变体G19，在含不同浓度的NaCl的表型展示培养基上进行表型测定。具体实施方法
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遗传学方法(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Adams A et al 编，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 出版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一全长编码区的克隆与分析
对盐藻ft viridis受不同浓度盐诱导的cDNA文库EST序列(表达序列标签)进行分析，通过序列比对，分离到了一个盐藻硫氧还蛋白基因，命名为DvTRX。DvTRX的cDNA全长 841 bp，含有完整的开放阅读框(ORF)、Kozak序列(GGCMeC)以及poly(A)结构。实施例二 DvTRX编码的蛋白结构、同源分析
Vector NTI软件的分析结果显示该基因编码一个含161个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小为18.02 kDa，等电点为9. 44。/VTET编码的蛋白有5个β链和4个α链。 iV/ET与其他物种的Thioredoxin基因具有较高的同源性。该基因编码的蛋白N端还具有 Thioredoxin保守的Cys-Gly-Pro-Cys(CGPC)序列,这是硫氧还蛋白氧化还原活性位点氨基酸基序(图I)。图2为本发明的/VTET基因编码的蛋白进化分析图，表明该编码蛋白属于硫氧还蛋白家族。实施例三/VTET编码蛋白的定位预测及原核表达分析
通过WoLFPSORT软件预测，DvTRX蛋白定位在叶绿体中，属于TRX的X类亚家族。通过PCR的方法，在伽/ET基因的ORF两端加入限制性内切酶位点EcoRl和通ol，连接T载体测序正确后，及和通ol双酶切目的片段连接到同样双酶切的原核表达载体PGEX4T-1 上，得到重组质粒pGEX4T-l-DvTRX。重组质粒转化进入大肠杆菌表达菌株BL21中，ImM IPTG, 25°C诱导4个小时后超声破碎菌体。图3为融合GST标签的DvTRX蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。实施例四DvTRX在酵母突变体中的功能分析 (一)酵母表达载体的构建
首先将含有完整ORF的EST序列(4977)构建到酵母表达载体中我们将 4977序列利用限制性内切酶位点I和ZAo I构建到酵母表达载体PAJ401中。(二)转化酵母
使用LiAc热激转化法将含有4977的重组克隆转化到酵母盐敏感突变体G19 (Mat^ ura3 his3 trpl ade2 enal Δ : : ena4 Δ)中。(三)酵母转化子的表型鉴定
所用基本培养基为AP培养基，并加入所需氨基酸。筛选标记为尿嘧啶营养缺陷。转入载体为PAJ401的转化子表型展示培养基，添加2%的半乳糖作为碳源。所用表型展示培养基以不含NaCl的AP培养基为对照生长条件，加入不同浓度的NaCl的AP培养基为耐盐表型分析生长条件。首先将酵母转化子在AP培养基中培养至OD6tltl=O. 6，以5 μ L为一个滴度，并以5倍稀释度为系列稀释滴度，在表型展示培养基上展示酵母转化子的耐盐表型。在PAJ401组成型强表达启动子启动下，4977成功互补了酵母盐敏感突变体G19的表型(图4);结果表明转化了含/VTET完整ORF的EST序列的酵母盐敏感突变体可以在220mM NaCl下仍然有表型， 说明了 iVTET基因能够部分恢复酵母突变体的功能，证明了 DvTRX能够有效地提高生物体的耐盐能力。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的， 即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种具有耐盐功能的基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO :1所示的DNA序列。
2.一种根据权利要求I所述的基因的编码蛋白，其特征在于该蛋白是SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.—种重组表达载体，该重组载体含有根据权利要求I所述的基因。
4.一种宿主细胞,该宿主细胞含有根据权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种根据权利要求I所述的具有耐盐功能的基因在提高生物体耐盐能力中的应用。
6.一种根据权利要求I所述的具有耐盐功能的基因在改良农作物性状中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有耐盐功能的基因、其编码蛋白及其应用。该基因为SEQIDNO1所示的DNA序列。本发明首次从盐藻(Dunaliellaviridis)中分离到硫氧还蛋白(thioredoxin)基因DvTRX，并通过转化酵母细胞证明该基因还具有耐盐功能和改良农作物性状的应用价值。
文档编号C07K14/405GK102586281SQ20121000357
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者刘翔, 孙文杰, 宋任涛, 李平, 李松, 王任, 许政暟 申请人:上海大学