一种2’-fana类氟代寡核苷酸的合成方法
【专利摘要】本发明涉及一种2’-FANA类制备氟代寡核苷酸（FANA）的合成方法，其特征在于以1-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖为原料，经氟代和溴化反应得到1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5-二-O-苯甲酰-α-D-阿拉伯糖，用碱基或特定修饰的碱基与1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5-二-O-苯甲酰-α-D-阿拉伯糖通过亲核取代（SN2）反应，再水解制备得到系列2′-FANA类核苷酸衍生物。该合成工艺路线具有原料易得和产率较高的特点，利用2′-FANA类核苷酸，可以用于制备系列siRNA。
【专利说明】—种2’ -FANA类氟代寡核苷酸的合成方法
【技术领域】[0001]本发明属于生物有机合成【技术领域】，涉及一种2’ -FANA类制备氟代寡核苷酸(FANA)的生物有机合成方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。它的形成是由多基因突变累积与相互作用形成导致的。从1998年发展起来的RNA干扰技术，是由SiRNA介导的高度特异的转录后基因沉默效应，具有高效性，特异性的特点(Andrew Fire, et al.Nature, 1998, 391:806-811)。现已发展成为一种成熟的抑制靶基因表达的有力工具，尤其是对于由基因转录水平增加而导致的基因过度表达是一种强有力的抑制手段(Xia Haibin, et al.Nature,2002，20:1006-1010)。RNA干扰应用于肿瘤治疗目前主要的障碍是转运途径的问题，目前解决这个问题的最有效的途径有两个:1、化学修饰SiRNA，使其具备更好的核糖核酸酶抗性，从而提高其生物稳定性，增加其生物利用度；2、应用病毒载体表达shRNA，从而使被感染细胞内能够较为容易的表达shRNA。其它的如脂质体等转染试剂帮助siRNA或shRNA表达载体转运也是很有希望的途径(Arndt B.Cancer cell, 2002，2(3): 167-168)。siRNA在体内环境的生物稳定性很差。实验表明，没有经过修饰的siRNA在血清中的半衰期小于15分钟，这极大的限制了 siRNA在临床治疗中的应用。为解决该项技术的缺陷，目前研究已经证实，经过化学修饰后的siRNA能在保留原有生物活性的基础之上，进一步提高体内的稳定性，其在血清中的半衰期可以增加数十倍，具备了临床治疗应用的潜力(Elbashir SM,et al.Nature.2001; 411: 494-498)。
[0003]文献报道的化学修饰RNA方法较多，主要分为核糖核酸的末端和化学基团修饰、核苷酸的骨架修饰或2’ _、4’ -位修饰、碱基修饰、组合修饰等等。硫代磷酸的修饰是第一代的核酸修饰方法，其产物抗核酸酶解能力较强，但是有较大的非特异毒性。核糖的2位羟基的烷基修饰是第二代的核酸修饰法，其重要代表是2’ -0-methyl (OMe)和
2,-0-methoxy-ethyl (MOE) RNA。其产物在性能上虽有一定改善，但非特异毒性依然存在。在这个基础上，发展了许多各式各样的修饰方法，主要有Peptide nucleic acids (PNAs)、N3， -P5， phosphoroamidates (NPs)、， -Deoxy-2， -fluoro-b
-D-arabino nucleic acid (FANA)、Locked nucleic acid (LNA)、Morpholinooligonucleotides (MF)、Cyclohexene nucleic acids (CeNA) > Tricyclo-DNA (tcDNA)等方法，称之为第三代的核酸修饰法(Xiaolan Chen, et al.Drug discovery todaytargets, 2005,10 (8): 587-593)。
[0004]FANA (2，-Deoxy-2 J -fl uor o-b-D-ar ab i no nucleic acid, 2，-脱氧-2’ -氟-b-D-阿拉伯糖核苷酸)修饰的RNA是指由FANA替代核糖组成寡核苷酸的骨架形成的RNA类似物。
[0005]近几年的文献已证实，FANA修饰是极少数的能够增强siRNA血清中半衰期的同时还能增强 siRNA 的活性的方法之一(Chiu YL，et al.RNA, 2003, 9 (9): 1034 1048)。但目前尚未见到该方法修饰的siRNA应用于肿瘤治疗的报道。采用FANA修饰法对siRNA进行恰当的修饰，既能保留甚至增强其生物学活性，又能显著增加其生物学稳定性，是一种很有前景的siRNA修饰方案。本发明提供了一种用于制备siRNA的氟代寡核苷酸的合成方法。
【发明内容】
[0006]本发明通过下述方法实现的:本发明涉及一种2’ -FANA类制备氟代寡核苷酸(FANA)的合成方法如下:
①以1-乙酰基_2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖为原料，二氯甲烷为溶剂，在酸性条件下，经重排反应，制备获得，以1，3，5-三-O-苯甲酰基-2-羟基-β -D-呋喃核糖，收率约70%。
[0007]②经三氟甲基磺酸酯取代活化，通过亲核取代(SN2)反应，利用氟化试剂进行氟代反应，获得关键中间体2-脱氧-2-氟-1，3，5-三-O-苯甲酰-β -D-阿拉伯糖。
[0008]③在氢溴酸乙酸的条件下，溴代反应制备1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5- 二 _0_苯甲酰-β-D-阿拉伯糖。
[0009]④采用修饰好的碱基或未经修饰的碱基与1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5- 二 _0_苯甲酰-β -D-阿拉伯糖进行氮烷基取代反应，通过水解制备获得系列FANA核苷酸单体。
【具体实施方式】
[0010]下面结合具体的实施例，对本发明作进一步的阐述，但不限于这些具体的实施例，而所有的实施例均按上述的操作步骤操作。
[0011](I) I，3，5-三-O- 苯甲酰基-2-羟基-β-D-呋喃核糖的制备
将20g的1-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖(40mmol)溶于二氯甲烷80ml，加入乙酰氯3ml，0-5°C通入干燥氯化氢搅拌2 h，冰箱静置12h。减压浓缩至干，剩余油状物溶于乙腈30ml，滴加水5ml，冰水浴条件下搅拌，O °C放置2 h后，抽滤，滤饼用冰乙醚20ml洗涤，干燥，得到的白色固体16g，溶于乙酸乙酯100ml，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩至干，得白色固体12 g，mpl40-142°C。
[0012]1HNMR (DMS0, 400ΜΗζ): δ 7.4-8.1 (m, 15H), 6.3 (s，lH), 5.8 (m, 1H),
5.7 (d, 1H)，4.8 (m, 1H)，4.6-4.7 (dd, 1H)，4.4-4.5 (dd, 1H)
(2)1，3，5-三-0-苯甲酰基-2-氟-β -D-呋喃核糖的制备
将12 g的1，3，5_三-O-苯甲酰基-2-羟基-β-D-呋喃核糖溶于二氯甲烷200ml中，-20°C滴加7 g硫酰氯，0-5°C加入IOml的DMF，反应3 h，分批加入咪唑17g，搅拌4 h。反应液倾入冰水中，100ml的二氯甲烷提取3次，合并有机相，饱和盐水洗2次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液蒸除溶剂，剩余油状物加至异丙醇25ml中，加入石油醚50ml，静置析晶，滤饼用异丙醇与石油醚混合液洗涤，烘干，得白色粉末状固体10.5g，mpl29-131°C。
[0013]将10.5g的1，3，5-三-O-苯甲酰基_2_咪唑磺酰基-D-呋喃核糖溶于100ml的乙酸乙酯，加入13.5g的37%的氢氟酸三乙胺溶液，80°C搅拌3 h，TLC[展开剂:丙酮:石油醚(1:5)]显示原料全部转化完全，加入IOml三乙胺，继续反应3 h。停止加热，自然冷却至室温，反应液倒入冰水(200ml )中，加入碳酸氢钠调至中性，乙酸乙酯40mlml提取3次，合并有机相，饱和盐水洗涤2次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩，得7.2g油状物，加入乙醇与水的混合液中重结晶，得3.7g的白色固体物。(注:油状物也可以直接投入下步反应)。
[0014]1HNMR (DMS0, 400ΜΗζ): δ 7.4-8.2 (m, 15 H), 6.5 (d, I H), 5.7 (d, 1H)，
5.5 (d, 1H)，4.7 (m, 1H)，4.6-4.5 (m, 2H)
(3)1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5- 二一O-苯甲酰基-β -D-呋喃核糖的制备
5g的I，3，5-三-O-苯甲酰基-2-氟-β -D-呋喃核糖溶于50ml的二氯甲烷中，加入40%HB r的乙酸溶液10ml，室温搅拌8 h，迅速加入饱和碳酸氢钠溶液，调至中性，二氯甲烷提取2次，合并有机相，饱和碳酸氢钠溶液洗涤I次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩至干，得油状约4.7 g，可直接用于下步反应。
(4)1- (3,5- 二 --O-苯甲酰基-2-脱氧-2-氟-β -D-呋喃核糖基)尿嘧啶
将2g的尿嘧啶，4mg的硫酸铵，以及IOml的六甲基二氮硅烷，加入100ml的反应瓶中，通氮气保护，加热回流2h，减压蒸出过量的六甲基二氮硅烷，得白色固体物，加入50ml氯仿，加入8.1g的1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5-二一O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖与25ml的氯仿溶液，回流反应8 h，冷却，加入饱和的碳酸钠水溶液，硅藻土过滤，滤饼用氯仿洗3次，减压浓缩至尽得白色固体，加入IOml的甲醇回流I h，冷却，过滤，得白色固体2.5g。
[0015]1HNMR (DMS0, 40 OMHz): δ 8.1 (d, 2H)，7.9 (d, 2H)，7.5_7.7 (m, 8Η, Ar H),
6.4 (dd, 1Η)，5.4-5.7 (m, 3Η)，4.7 (m, 1Η)，4.6 (m, 1Η)
(5)2’-脱氧-2’ -氟-β-D-阿拉伯糖尿嘧啶
将2.5g的1- (3，5- 二一O-苯甲酰基-2-脱氧-2-氟-β -D-呋喃核糖基)尿嘧啶加入30ml的甲醇中，通入氨气，搅拌48h，减压浓缩至尽，硅胶柱分离(展开剂:乙酸乙酯:乙醇=1:2)，得白色固体1.3g。
[0016]1HNMR (DMS0, 400ΜΗζ): δ 7.4-7.5 (dd, 2H), 6.3 (dd, 1H), 5.2 (m, 1H), 4.4(m, I H), 4.0-3.8 (m, 3 H)
(6)2’ -脱氧-2’ -氟-5- O- (4-甲氧基三苯基甲基)-β -D-阿拉伯糖尿嘧啶
将Ig的2’-脱氧-2’-氟-β -D-阿拉伯糖尿嘧啶加入20ml干燥的吡啶中，加入1.5g的三苯基甲基氯，室温搅拌10h，TLC跟踪，再加入0.5g的三苯基甲基氯，室温搅拌5h，减压浓缩至尽，硅胶柱分离得白色胶状固体1.3g。
[0017]1HNMR (DMS0, 400ΜΗζ): δ 7.6 (d, 2H)，6.9 - 7.5 (m, 14H), 6.1 (dd, 1H),
5.9 (d, 1H)，5.4 (d, 1H)，4.9-5.1 (m, 1H)，4.0-4.2 (m, 2H)，3.7 (s, 6H)，2.9 (m,2H) (7)1-(3-0-(β-氰基乙基-N，N-二异丙基磷酰基)-2’-脱氧-2’-氟-5- O- (4-甲氧基三苯基甲基)-β -D-阿拉伯糖尿嘧啶
将1.3g的2’-脱氧-2’-氟-5- O- (4-甲氧基三苯基甲基)-β-D-阿拉伯糖尿嘧啶粗品溶解于IOml的二氯甲烷中，加入0.5g的无水二异丙氨基咪唑盐，室温搅拌lh，通氮气的条件下，加入2ml的2-氰基乙基-N，N，N’，N’ -四异丙亚磷酰胺试剂，室温搅拌24h，硅胶柱分离得白色胶状固体1.lg。
[0018]1HNMR (DMS0, 40OMHz): δ 11.5 (s, 1H), 7.6 (d, 1H)，6.9 - 7.5 (m, 14H), 6.2(dd, 1H)， 5.5 (d, 1H)， 5.2-5.4 (dd, 1H)，4.4 (m, 1H)，4.0 (m, 1H)，3.7 (s, 6H)，3.6 (m, 2H) , 3.5 (m, 2H)，2.8 (t, 2H) , 1.1 (d, 6H)，0.9 (d, 6H)
FAB-MS: C39H46FN408P:767.5
(8)2’ -脱氧-2’ -氟-β -D-阿拉伯糖腺嘌呤将Ig的腺嘌呤，1.5mg的硫酸铵，以及IOml的六甲基二氮硅烷，加入100ml的反应瓶中，通氮气保护，加热回流2h，减压蒸出过量的六甲基二氮硅烷，得白色固体物，加入50ml氯仿，加入2.2g的1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5- 二一O-苯甲酰基-β -D-呋喃核糖与25ml的氯仿溶液，回流反应8 h，冷却，加入饱和的碳酸钠水溶液，硅藻土过滤，滤饼用氯仿洗3次，减压浓缩至尽得油壮物，硅胶柱分离得白色固体0.5g。加入甲醇20ml中，加入甲醇钠
0.5g，30°C反应2h。冷却至室温，用稀盐酸调至PH6-7，减压浓缩至尽，加入甲醇20ml，过滤，滤饼用冰甲醇洗涤，减压浓缩至尽，硅胶柱分离得白色固体0.3g。
[0019]1HNMR (DMS0, 400ΜΗζ): δ 8.1 (d, 1H), 7.9 (s, 1H), 7.8 (2H), 6.2 (dd, 1H), 5.1(m, 1H)，4.5 (m, I H), 4.0 (m, I H), 3.9 (m, 1H)，3.6-3.7 (m, 2H)。
[0020](9) 2’ -脱氧-2’ -氟-5- O- (4-甲氧基三苯基甲基)-β -D-阿拉伯糖腺嘌呤 将0.25g的2’ -脱氧-2’ -氟-β -D-阿拉伯糖腺嘌呤加入20ml干燥的吡啶中，加入
1.0g的三苯基甲基氯，室温搅拌4h，TLC跟踪，再加入0.2g的三苯基甲基氯，室温搅拌5h，减压浓缩至尽，硅胶柱分离得白色固体约0.2g。
[0021]1HNMR (DMS0, 40OMHz): δ 8.2 (m, 2H), 7.6 - 6.9 (m, 14H), 6.3 (dd, 1H), 5.4(d, 1H)，5.2 (m, 1H)，5.0 (m, 1H)，4.4 (m, 1H)，3.8 (s, 6H)，3.0 (m, 2H)。
[0022](10) 1-(3-0_(β-氰基乙基-队^二异丙基磷酰基)-2’-脱氧-2’-氟-5_0- (4-甲氧基三苯基甲基)-β -D-阿拉伯糖腺嘌呤
将0.2g的2’-脱氧-2’-氟-5- O- (4-甲氧基三苯基甲基)_β-D-阿拉伯糖腺嘌呤粗品溶解于IOml的二氯甲烷中，加入0.15g的无水二异丙氨基咪唑盐，室温搅拌lh，通氮气的条件下，加入0.5ml的2-氰基乙基-N，N, N’，N’ -四异丙亚磷酰胺试剂，室温搅拌24h，硅胶柱分离得白色胶状固体0·.lg。
[0023]1HNMR (DMS0, 40OMHz): δ 11.4 (s, 1H), 8.2 (m, 2H), 7.0 - 7.5 (m, 14H), 6.2(dd, 1H), 5.5 (d, 1H)，5.2—5.4 (dd, 1H)，4.4 (m, 1H), 4.0 (m, 1H), 3.7 (s, 6H)，
3.6 (m, 2H) , 3.5 (m, 2H)，2.8 (t, 2H) , 1.1 (d, 6H)，0.9 (d, 6H)。
【权利要求】
1.本发明涉及一种2’-FANA类制备氟代寡核苷酸(FANA)的合成方法，其特征在于以1-乙酰基_2，3，5-三-O-苯甲酰基-β -D-呋喃核糖为原料，经氟代和溴化反应合成1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5- 二 -O-苯甲酰-a -D-阿拉伯糖，用碱基或特定修饰的碱基与1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5- 二 -O-苯甲酰-a -D-阿拉伯糖通过亲核取代(SN2)反应，再水解制备得到系列2' -FANA类核苷酸。
2.按照权利要求1所述，其特征在于以1-乙酰基_2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖为原料，二氯甲烷为溶剂，在酸性条件下，经重排反应，获得，以1，3，5-三-O-苯甲酰基-2-羟基-β -D-呋喃核糖。
3.按照权利要求1所述，其特征在于经三氟甲基磺酸酯取代活化，通过亲核取代(SN2)反应，利用氟化试剂进行氟代反应，获得2-脱氧-2-氟-1，3，5-三-O-苯甲酰-β -D-阿拉伯糖。
4.按照权利要求1所述，其特征在于在氢溴酸的乙酸溶液条件下，溴代反应制备1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5- 二 -O-苯甲酰-β -D-阿拉伯糖。
5.按照权利要求1所述，其特征在于采用修饰好的碱基或未经修饰的碱基与1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5- 二 -O-苯甲酰-β -D-阿拉伯糖进行氮烷基取代反应，再通过水解制备获得2' -FANA类核苷酸。
【文档编号】C07H1/00GK103570784SQ201210279505
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月8日 优先权日:2012年8月8日
【发明者】不公告发明人 申请人:安徽瑞赛生化科技有限公司