多核苷酸引物和探针的制作方法

多核苷酸引物和探针的制作方法
【专利摘要】本发明提供了涉及改进的引物设计的新技术。这些引物对具有广泛的应用并且提供了高敏感性和特异性。
【专利说明】多核苷酸引物和探针
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.§ 119(e)要求2011年2月14日提交的美国临时申请第61/442，729号的优先权，所述美国临时申请的全文以引用的方式并入本文。
发明领域
[0003]本发明涉及多核苷酸组合及它们的用途。
[0004]背景
[0005]核酸的检测和扩增在遗传分析、分子诊断和药物发现中起着重要作用。许多此类应用需要某些DNA或RNA分子、基因表达、存在于总多核苷酸的一小部分中的DNA突变或DNA甲基化的特异性、敏感且低成本的定量检测。许多现行方法使用聚合酶链式反应，或PCR,并且具体地，实时PCR(定量或qPCR)来检测和定量临床样本中的非常少量的DNA或RNA。
[0006]虽然现行PCR测定的性能不断提高，但是它们的敏感性、特异性和成本离成为广泛接受的诊断测试仍然很远 。事实上，本领域中目前使用的许多PCR方法存在使得它们不适用于许多实际应用的技术限制。例如，在靶分子具有抑制或甚至完全阻止一种或两种引物与靶结合的二级结构的情况下，扩增可能会减少或甚至不存在，这例如从诊断的角度来看可能会导致假阴性，尽管使用具有预期敏感的结合特性的高特异性引物。其他挑战包括现行的实时PCR测定在检测和鉴别在与成千上万种非突变DNA分子混合的情况中具有单个碱基突变的罕见DNA分子的低敏感性，以及将多个突变检测测定组合成一个多重诊断测定的能力。
[0007]因此，本领域仍然需要开发组合了高结合特异性与低合成成本、保留了克服本领域中公认的技术问题的能力的扩增引物，包括用于使用下一代测序平台诊断的PCR的新应用。
发明概要
[0008]在一方面，本公开提供了包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的多核苷酸引物组合，其中第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域(T1)互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，并且第二多核苷酸(F)包含具有与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的序列的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd)，所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc和Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，并且其中所述靶多核苷酸具有被Fb与靶多核苷酸的杂交变性的二级结构。在一方面，靶多核苷酸的二级结构抑制在不存在F的情况下靶多核苷酸的聚合酶延伸。本公开进一步涵盖了其中多核苷酸引物组合P和 /或F进一步包含经修饰的核酸的方面。
[0009]本公开进一步 提供了包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的多核苷酸引物组合，其中第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域(T1)互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，并且第二多核苷酸(F)包含具有与第二靶多核苷酸区域(τ2)互补的序列的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd)，所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc和Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，并且其中P和/或F进一步包含经修饰的核酸。
[0010]还提供了包含第一多核苷酸、第二多核苷酸和阻断剂多核苷酸(blockerpolynucleotide)的多核苷酸引物组合，第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域0\)互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，第二多核苷酸(F)包含具有与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的序列的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd)，所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc与Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，并且阻断剂多核苷酸包含与第三靶多核苷酸区域(T3)互补的核苷酸序列，其中Τ3位于?\和Τ2的5’处。在引物组合的方面，在Ρ的3’端的核苷酸和在阻断剂多核苷酸的5’端的核苷酸重叠。在另一方面，阻断剂多核苷酸具有在Pa的整个长度上与Pa重叠的序列。在又一方面，在P的3’端的核苷酸和在阻断剂多核苷酸的5’端的核苷酸不同。在这些方面中的每一个中，涵盖了其中P、F和/或阻断剂多核苷酸包含经修饰的核酸的实施方案。
[0011]本公开进一步提供了包含第一多核苷酸、第二多核苷酸和探针多核苷酸的多核苷酸引物组合，第一多核苷酸包含与第一靶多核苷酸区域0\)互补的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，第二多核苷酸(F)包含与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd)，所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc和Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，并且探针多核苷酸包含与第三靶多核苷酸区域(T4)互补的核苷酸序列，其中Τ4位于?\和Τ2的5’处。在某些方面，探针多核苷酸包含标记和淬灭剂。在其他方面，P、F和/或探针多核苷酸包含经修饰的核酸。还提供了其中多核苷酸引物组合进一步包含阻断剂多核苷酸的实施方案，其中阻断剂多核苷酸包含与第四靶多核苷酸区域(T3)互补的核苷酸序列，并且其中Τ3位于1\和1~2的5’处及Τ4的3’处。在一方面，该阻断剂包含经修饰的核酸。
[0012]还提供了包含第一多核苷酸、第二多核苷酸和通用淬灭剂多核苷酸(universalquencher polynucleotide)的多核苷酸引物组合,第一多核苷酸(P)包含与第一祀多核苷酸区域0\)互补的第一结构域(Pa)、包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，及在其5’端的标记，第二多核苷酸(F)包含与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd)，所述第二结构域(Fd)包含两个多核苷酸序列，即，与Pc的5’序列充分互补从而使得Pc的5’多核苷酸序列与Fd将在适当的条件下杂交的5’多核苷酸序列，和与通用淬灭剂多核苷酸充分互补从而使得Fd的3’多核苷酸序列与该通用淬灭剂将在适当的条件下杂交的3’多核苷酸序列，并且通用淬灭剂多核苷酸包含淬灭剂及与Fd的3’多核苷酸序列充分互补从而使得通用淬灭剂多核苷酸与Fd的3’多核苷酸序列将在适当的条件下杂交的核苷酸序列。在一方面，P、F和/或通用淬灭剂多核苷酸包含经修饰的核酸。在另一方面，多核苷酸引物组合进一步包含反向引物，其中反向引物包含互补于含有与?\杂交的序列的多核苷酸链的多核苷酸序列。
[0013]在本文提供的任何引物组合的各个方面，Ρ包含经修饰的核酸。在其他方面，F进一步包含经修饰的核酸，并且在这些方面的某些中，经修饰的核酸在Pa中，和/或经修饰核酸在Fb中。[0014]在本公开的每种多核苷酸引物组合中，提供了其中P在Pa中包含多个经修饰的核酸，和/或其中F在Fb中包含多个经修饰的核酸的方面。当P包含经修饰的核酸时，提供了其中经修的饰核酸为位于P的3’端的核苷酸的方面。
[0015]在所公开的每种引物组合中，提供了其中Fd与Pc至少70%互补，其中Pc与Fd至少70%互补，其中Pc和Fd在不存在模板多核苷酸的情况下彼此杂交，其中P为DNA、经修饰的DNA、RNA、经修饰的RNA、肽核酸(PNA)或它们的组合，和/或其中F为DNA、经修饰的0嫩、1?應、经修饰的8應、肽核酸(PNA)或它们的组合的方面。
[0016]在每种引物对组合中，提供了其中多核苷酸引物组合进一步包含在其3’端连接至F的阻断从DNA聚合酶的延伸的阻断基团(blockinggroup)的方面。在这个方面,提供了其中阻断基团选自3’磷酸基团、3’氨基、双脱氧核苷酸和反转脱氧胸苷(dT)的实施方案。
[0017]在每种引物对组合的另一方面，提供了其中Pa为长度约5个碱基至长度约30个碱基、长度约5个碱基至长度约20个碱基、长度约5个碱基长度约15个碱基、长度约5个碱基至长度约10个碱基、长度约5个碱基至长度约8个碱基的某些实施方案。在其他方面，Pc为长度约5个碱基至长度约200个碱基、长度约5个碱基至长度约150个碱基、长度约5个碱基至长度约100个碱基、长度约5个碱基至长度约50个碱基、长度约5个碱基至长度约45个碱基、长度约5个碱基至长度约40个碱基、长度约5个碱基至长度约35个碱基、长度约5个碱基至长度约30个碱基、长度约5个碱基至长度约25个碱基、长度约5个碱基至长度约20个碱基、长度约5个碱基至长度约15个碱基、长度约10个至长度约50个碱基、长度约10个碱基至长度约45个碱基、长度约10个碱基至长度约40个碱基、长度约10个碱基至长度约35个碱基、长度约10个碱基至长度约30个碱基、长度约10个碱基至长度约25个碱基、长度约10个碱基至长度约20个碱基，或长度约10个碱基至长度约15个碱基。在又一些其他方面，Fb为长度约10个碱基至长度约5000个碱基、长度约10个碱基至长度约4000个碱基、长度约10个碱基至长度约3000个碱基、长度约10个碱基至长度约2000个碱基、长度约10个碱基至长度约1000个碱基、长度约10个碱基至长度约500个碱基、长度约10个碱基至长度约250个碱基、长度约10个碱基至长度约200个碱基、长度约10个碱基至长度约150个碱基、长度约10个碱基`至长度约100个碱基、长度约10个碱基至长度约95个碱基、长度约10个碱基至长度约90个碱基、长度约10个碱基至长度约85个碱基、长度约10个碱基至长度约80个碱基、长度约10个碱基至长度约75个碱基、长度约10个碱基至长度约70个碱基、长度约10个碱基至长度约65个碱基、长度约10个碱基至长度约60个碱基、长度约10个碱基至长度约55个碱基、长度约10个碱基至长度约50个碱基、长度约10个碱基至长度约45个碱基、长度约10个碱基至长度约40个碱基、长度约10个碱基至长度约35个碱基、长度约10个碱基至长度约30个碱基，或长度约10个碱基至长度约100个碱基。在又一些其他方面，Fd为长度约5个碱基至长度约200个碱基、长度约5个碱基至长度约150个碱基、长度约5个碱基至长度约100个碱基、长度约5个碱基至长度约50个碱基、长度约5个碱基至长度约45个碱基、长度约5个碱基至长度约40个碱基、长度约5个碱基至长度约35个碱基、长度约5个碱基至长度约30个碱基、长度约5个碱基至长度约25个碱基、长度约5个碱基至长度约20个碱基、长度约5个碱基至长度约15个碱基、长度约10个至长度约50个碱基、长度约10个碱基至长度约45个碱基、长度约10个碱基至长度约40个碱基、长度约10个碱基至长度约35个碱基、长度约10个碱基至长度约30个碱基、长度约10个碱基至长度约25个碱基、长度约10个碱基至长度约20个碱基，或长度约10个碱基至长度约15个碱基。
[0018]在引物对组合的每个方面，提供了包括其中P包含标记的实施方案。在一些方面，标记位于P的5’端,和/或该标记是可淬灭的。在这些实施方案的一些方面，F包含淬灭剂和/或淬灭剂位于F的3’端。在具体实施方案中，淬灭剂选自Black Hole QuencherUBlack Hole Quencher-2>1wa Black FQ、1wa Black RQ 和 Dabcyl.G-base。
[0019]在包含经修饰的核酸的某些引物对组合中，阻断剂多核苷酸中的经修饰的核酸为位于阻断剂多核苷酸5’端的核苷酸，经修饰的核酸为位于P的3’端的核苷酸，和/或经修饰的核酸为锁核酸。
[0020]本公开进一步提供了用引物组合检测样本中靶多核苷酸的存在的方法，所述引物组合包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域(T1)完全互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，Pa具有与样本中的非靶多核苷酸不完全互补的序列，并且第二多核苷酸(F)包含与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd)，第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc与Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，所述方法包括以下步骤:使样本与引物组合和 聚合酶在当样本中存在靶多核苷酸时允许来自Pa的与靶多核苷酸互补的序列延伸的条件下接触，以及检测从Pa延伸的序列，从而指示样本中靶多核苷酸的存在。在某些方面，所述方法提供了具有非靶多核苷酸的样本的序列检测与具有靶多核苷酸的样本的序列检测相比的变化。
[0021]还提供了用如本文所公开的引物组合检测样本中靶多核苷酸的存在的方法，其中P包含与T1完全互补的第一结构域并且其中Pa与样本中的非靶多核苷酸不完全互补，所述方法包括以下步骤:使样本与引物组合和聚合酶在当样本中存在靶多核苷酸时允许来自Pa的与靶多核苷酸互补的序列延伸的条件下接触，以及检测从Pa延伸的序列，其中检测指示样本中靶多核苷酸的存在。在一些方面，所述方法提供了具有非靶多核苷酸的样本的序列检测与具有靶多核苷酸的样本的序列检测相比的变化。
[0022]在这些方法的每种中，提供了其中检测步骤使用聚合酶链式反应进行的实施方案。在这些实施方案中，提供了这样的方面，其中聚合酶链式反应利用引物组合的P及反向引物，所述反向引物具有与从Pa延伸的序列互补的序列，和/或聚合酶链式反应利用与从Pa延伸的序列互补的反向引物以及具有互补于与Pa杂交的靶多核苷酸链的序列的正向引物。
[0023]在这些方法的另一方面，检测实时进行。
[0024]本公开进一步提供了使用引物组合启动样本中的靶多核苷酸上的聚合酶延伸的方法，所述引物组合包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域(T1)完全互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，Pa具有与样本中的非靶多核苷酸不完全互补的序列，并且第二多核苷酸(F)包含与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd)，所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc和Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，其中所述样本包含以下二者的混合物:(i)在第一区域中具有与Pa中的序列完全互补的序列(T1)的靶多核苷酸和(ii)在第一区域中具有与Pa不完全互补的序列(T1*)的非靶多核苷酸，所述方法包括以下步骤:使样本与引物组合和聚合酶在当Pa接触?\时允许来自Pa的与靶多核苷酸链互补的序列延伸的条件下接触。在所述方法的某些方面，靶多核苷酸中的第一区域0\)中的序列与非靶多核苷酸中的第一区域(!\*)中的序列有一个碱基不同。在其他方面，所述方法进一步包括检测从Pa延伸的序列的步骤，其中检测指示样本中靶多核苷酸的存在。
[0025]本公开还提供了使用如本文所公开的引物组合启动样本中靶多核苷酸上的聚合酶延伸的方法，其中P包含与第一靶多核苷酸区域0\)完全互补的第一结构域(Pa)，并且其中Pa与样本中的非靶多核苷酸不完全互补，所述方法包括以下步骤:使样本与引物组合和聚合酶在当样本中存在靶多核苷酸时允许来自Pa的与靶多核苷酸互补的序列延伸的条件下接触。在一些方面，所述方法进一步包括检测从Pa延伸的序列的步骤，从而指示样本中靶多核苷酸的存在。在各个实施方案中，检测步骤使用聚合酶链式反应进行，并且在这个实施方案的某些方面，聚合酶链式反应利用引物组合的P及反向引物，所述反向引物具有与从Pa延伸的序列互补的序列，和/或聚合酶链式反应利用与从Pa延伸的序列互补的反向引物及具有互补于与Pa杂交的靶多核苷酸链的序列的正向引物。在所述方法的每个实施方案中，提供了其中检测实时进行的方面。
[0026]还提供了使用多核苷酸引物组合扩增样本中的靶多核苷酸的方法，所述引物组合包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域0\)完全互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，Pa具有与样本中的非靶多核苷酸不完全互补的序列，并且第二多核苷酸(F)包含与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd)，所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc和Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，其中所述样本包含以下二者的混合物:(i)在第一区域0\)中具有与Pa中的序列完全互补的序列的靶多核苷酸和(ii) 一个或多个与Pa不完全互补的非靶多核苷酸；所述方法包括以下步骤:(a)使样本与引物组合和聚合酶在当样本中存在靶多核苷酸时允许来自Pa的与靶多核苷酸互补的序列延伸的条件下接触，(b)使从Pa延伸的序列从靶多核苷酸变性，以及(c)在具有与步骤(b)中从Pa延伸的序列中的区域互补的序列的反向引物的存在下重复步骤(a)以扩增靶多核苷酸，其中靶多核苷酸的延伸和扩增在Pa与Pa中的序列完全互补时发生，但是在靶多核苷酸中的第一区域与Pa中的序列不完全互补时效率较低或者不发生。
[0027]本公开还提供了使用如本文所公开的多核苷酸引物组合扩增样本中的靶多核苷酸的方法，其中第一多核苷酸(P)包含与第一靶多核苷酸区域0\)完全互补的第一结构域(Pa)，并且其中Pa与样本中的非靶多核苷酸不完全互补，所述方法包括以下步骤:(a)使样本与引物组合和聚合酶在当样本中存在靶多核苷酸时允许来自Pa的与靶多核苷酸互补的序列延伸的条件下接触，(b)使从Pa延伸的序列从靶多核苷酸变性，以及(c)在具有与步骤(b)中从Pa延伸的序列中的区域互补的序列的反向引物的存在下重复步骤(a)以扩增靶多核苷酸，其中靶多核苷酸的延伸和扩增在?\与Pa中的序列完全互补时发生，但是在靶多核苷酸中的第一区域与Pa中的序列不完全互补时效率较低或者不发生。在所述方法的一些方面，反向引物具有与从Pa延伸的序列中的区域完全互补的序列。在其他方面，反向引物为包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的引物组合，第一多核苷酸(PP)包含具有与步骤(a)中从Pa延伸的序列中的第一区域(TTJ完全互补的序列的第一结构域(PPa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(PPc)，并且第二多核苷酸(FF)包含与步骤(a)中从Pa延伸的序列中的第二区域(TT2)互补的第一结构域(FFb)及第二结构域(FFd)，所述第二结构域(FFd)包含与PPc充分互补从而使得PPc与FFd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列。在某些方面，所述方法进一步包括检测在所述方法中扩增的产物的步骤，并且在其他方面，使用聚合酶链式反应进行检测，和/或实时进行检测。
[0028]在本公开的每种方法中，提供了其中反向引物为如本文所公开的引物组合的方面。
[0029]附图简述
[0030]图1示出本文所公开的基础多核苷酸组合(即，第一多核苷酸和第二核苷酸)的结构关系。
[0031]图2示出包含具有三个祀结合结构域a、g和b的两个三向接合点(three-wayjunction)的引物组合。
[0032]图3示出包含具有两个靶结合结构域的稳定四向㈧和五向⑶接合点的多核苷酸组合。
[0033]图4示出具有阻断剂多核苷酸的引物组合。如图4A中所示，阻断剂多核苷酸的5’碱基与第一多核苷酸的3’碱基重叠并且不同。阻断剂多核苷酸的5’碱基与靶多核苷酸不互补，并且在第一多核苷酸由聚合酶引起的延伸后被置换。如图4B中所示，阻断剂多核苷酸的5’碱基与第一多核苷酸的3’碱基重叠并且不同。阻断剂多核苷酸的5’碱基与非革巴多核苷酸100%互补，而第一多核苷酸的3’碱基与非靶多核苷酸不互补。在这种构造中，阻断剂多核苷酸阻断由聚合酶引起的第一多核苷酸的延伸。
[0034]图5示出具有探针多核苷酸的引物组合。如图5A中所示，探针多核苷酸在其5’端包含标记并在其3’端包含淬灭剂。图5B示`出探针多核苷酸与第一 /第二多核苷酸对和阻断剂多核苷酸的组合的结构关系。
[0035]图6示出具有通用淬灭剂多核苷酸的基础多核苷酸组合的结构关系。如所示出的，通用淬灭剂多核苷酸与第二多核苷酸的第二结构域互补并且在其3’端包含淬灭剂，而第一多核苷酸在其5’端包含标记。
[0036]图7是示出如在聚合酶链式反应(PCR)中使用的多核苷酸组合的示意图。
[0037]图8示出基础多核苷酸组合与反向引物的结构关系。在图8A中，反向引物为单个多核苷酸。在图8B中，反向引物为第二组第一和第二多核苷酸。
[0038]图9A示出具有非特异性RNA接头的荧光团-淬灭剂标记的第一多核苷酸(引物A)，和典型的第二多核苷酸(固定物(Fixer)A)。图9B示出图9A中所示的组合在PCR中的使用。当产生与引物A相反的链时，RNA-DNA杂交体被RNA酶H切割释放荧光团(或淬灭剂)，并且检测荧光信号。图9C示出具有位点特异性RNA-DNA接头的荧光团-淬灭剂标记的第一多核苷酸(引物A)，和典型的第二多核苷酸(固定物A)。图9D示出图9C中所示的组合在PCR中的使用。当包含引物A的PCR产物被变性时，RNA-DNA接头与引物A下游的区域杂交，RNA酶H切割RNA-DNA杂交体并释放荧光团，并且检测序列特异性荧光信号。
[0039]图10示出用于实时PCR的具有三向或四向接合点的引物组合。就三向接合点引物而言，在引物多核苷酸(即，第一多核苷酸)的5’端用荧光团进行标记，并且在固定物多核苷酸(即，第二多核苷酸)的3’端用淬灭剂进行标记。就四向接合点引物而言，在引物多核苷酸的5’端用荧光团进行标记，并且在卡钉(staple)的3’端用淬灭剂进行标记。固定物多核苷酸未被标记。因为引物和固定物多核苷酸的第二结构域区域都是独特的，因此卡钉多核苷酸可用作:“通用”淬灭剂多核苷酸。
[0040]图11(方案11)示出利用具有非共价连接的反引物(ant1-primer, AP)的基础引物和固定物多核苷酸的三个实例。
[0041]图12示出用基础引物多核苷酸("PO")和经修饰的固定物多核苷酸结构(“F1至F4”)构建的多核苷酸。当与模板多核苷酸结合时，包含茎环结构的经修饰的经修饰的多核苷酸组合(I至4，方案12)可用于提供增加水平的特异性。
[0042]图13示出用经修饰的引物多核苷酸(〃P1〃)和基础固定物多核苷酸(〃F〃)构建的多核苷酸组合(方案13)。在方案13中，经修饰的引物多核苷酸示出在左侧，其中完整的多核苷酸组合(经修饰的引物多核苷酸和基础固定物多核苷酸)示出在右侧。
[0043]图14(方案16)示出使用本文所公开的基础多核苷酸组合(即，第一多核苷酸和第二多核苷酸)检测点突变的两种情况。在顶部的情况中，引物多核苷酸的第一结构域与模板DNA多核苷酸100%互补并且延伸发生，产生产物。在底部的情况中，引物多核苷酸的第一结构域含有相对于模板DNA多核苷酸的错配并且由于引物多核苷酸的短第一结构域的不稳定性，延伸被阻断。这种不稳定性将导致PCR效率非常低并且将产生非常少的或没有可检测产物。
[0044]图15示出使用多核苷酸组合(即，第一多核苷酸和第二多核苷酸)执行下一代测序(NGS)。
[0045]图16示出使用本文所公开的基础多核苷酸组合(即，第一多核苷酸和第二多核苷酸)在染色染料SYT09的存在下的定量PCR的结果。
[0046]图17示出用荧光体标记的探针引物(即，第一多核苷酸)和淬灭剂标记的固定物(即，第二多核苷酸)的定量PCR测定的结果。
[0047]图18示出使用荧光体-标记的探针引物(即，第一多核苷酸)和通用淬灭剂的qPCR测定的结果。
[0048]图19示出使用第一多核苷酸、固定物(即，第二多核苷酸)和用SYBR green染料染色来检测混合物中的突变KRAS G12V的qPCR测定的结果。
[0049]图20示出使用第一多核苷酸、固定物(即，第二多核苷酸)和用SYBR green染料染色来检测甲醛固定的样本中的突变KRAS G12V的qPCR测定的结果。
[0050]图21示出使用第一多核苷酸、固定物(即，第二多核苷酸)和探针多核苷酸(即，TaqMan)检测混合物中的突变KRAS G12V的qPCR测定的结果。
[0051]图22示出使用第一多核苷酸、固定物(即，第二多核苷酸)、探针多核苷酸(即，TaqMan)和阻断剂多核苷酸检测混合物中的突变KRASG12V的qPCR测定的结果。
[0052]图23示出使用3’端用LNA修饰的第一多核苷酸、固定物(即，第二多核苷酸)、探针多核苷酸(即，TaqMan)和阻断剂多核苷酸检测混合物中的突变KRAS G12V的qPCR测定的结果。
[0053]图24A-D不出使用3’端用LNA修饰的第一多核苷酸、固定物(即，第二多核苷酸)、探针多核苷酸(即，TaqMan)和阻断剂多核苷酸在具有0.5拷贝/反应的KRAS G12V DNA(统计确定)的混合物中检测突变KRAS G12V的qPCR测定的结果。图24E-H示出使用3’端用LNA修饰的第一多核苷酸、固定物(即，第二多核苷酸)、探针多核苷酸(即，TaqMan)和阻断剂多核苷酸在不具有KRAS G12V DNA拷贝的混合物中检测突变KRAS G12V的qPCR测定的结果。94%的WT DNA样本(16个中的15个)显示无信号，表明改进的KRAS G12V qPCR突变测定对单个突变DNA检测具有非常高的选择性。
[0054]发明详述
[0055]本发明基于不连续的多核苷酸设计克服在多核苷酸与靶多核苷酸的杂交，并且特别地，扩增引物与靶多核苷酸的杂交过程中遇到的问题这一发现。这些问题包括但不限于克服难处理的靶多核苷酸的二级结构及对靶多核苷酸中的单个碱基变化的低特异性。
[0056]当使用难以有效扩增的多核苷酸模板时，本文所描述的多核苷酸组合提供了优于标准PCR引物和长PCR引物的优势。此类模板包括，例如，含有通过内部自杂交形成的一定程度的二级结构的模板，所述内部自杂交产生，例如，妨碍与互补序列的杂交、导致与互补序列的杂交低效率或抑制与互补序列的杂交的环、发夹等。模板二级结构可阻止利用标准PCR引物进行的引发，标准PCR引物不能破坏内部杂交的稳定性，因而不能与引物互补体杂交。使用本发明的多核苷酸组合，模板二级结构去杂交(或解链)，并且与互补的模板区域在适当条件下发生杂交。如本文所使用的，“标准PCR引物”长度可为约10至约100个碱基。
[0057]长PCR引物能够分解靶多核苷酸中的二级结构，但不能同时在引物的3’ (引发)端附近提供特异性或敏感性。这是因为对于长PCR引物，大部分与靶多核苷酸杂交并且在引物的3’端附近的相对于靶多核苷酸的错配将不足以降低引发效率。因此，尽管存在错配，PCR产物仍然会被合成。
[0058]本发明的多核苷酸组合提供了其他优势。例如，单独的短PCR引物可用于与靶多核苷酸的精确序列杂交，但是为了获得PCR所期望的引物与靶多核苷酸的结合的高特异性，通常选择最高可能退火温度。这种退火温度基于给定引物的解链温度进行选择，并且对于短引物，退火温度将相对低。然而，低退火温度具有允许短引物与靶多核苷酸非特异性杂交，从而导致形成非特异性PCR产物的缺`点。基于必须用于允许短PCR引物与其靶多核苷酸退火的相对低的退火温度，短引物与靶多核苷酸形成双链体，所述双链体通常是不稳定的，甚至当所述短引物与靶多核苷酸区域100%互补时也是不稳定的。而且，当引物小于100%互补(即，引物与靶多核苷酸区域之间存在至少一个错配)时，这些双链体更不稳定。本发明的多核苷酸组合帮助克服与使用短PCR引物有关的不稳定性问题并且允许与期望靶高特异性结合。例如，本公开的组合能够鉴别差异少至单个碱基的靶序列。
[0059]例如，不连续的多核苷酸组合设计(参见图1)通过使固定物多核苷酸(即，“第二多核苷酸”)的第一结构域[Fa]与模板多核苷酸杂交和使引物多核苷酸(即，“第一多核苷酸”)的第二结构域[Pc]与固定物多核苷酸的第二结构域[Fd]杂交，从而产生明显“较长”的引物序列的有效结果，而允许使用短PCR引物区域[Pa]。这种较长且不连续的杂交实际上使引物多核苷酸的第一区域[Pa](即使这个区域小至八个碱基)之间的结合稳定化，从而增加PCR的效率。
[0060]在另一个实施方案中，与引物多核苷酸和固定物多核苷酸的第一结构域互补的模板多核苷酸的区域不必是直接相邻的。本发明涵盖了其中互补区域间隔(即，不连续)多达10个或更多个核苷酸的实施方案，并且涵盖了在固定物与模板多核苷酸杂交后，使间插序列环出从而使靶模板区域扩增成与引物多核苷酸邻近。那么在这个方面，引物组合实际上用或不用环出结构的内部自杂交诱导模板多核苷酸的二级结构。
[0061]I.多核苷酸引物组合
[0062]在一个实施方案中，提供了包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的多核苷酸组合，第一多核苷酸包含与第一靶多核苷酸区域互补的第一结构域[Pa]及包含独特多核苷酸序列的第二结构域[Pc]，并且第二多核苷酸包含与第二靶多核苷酸区域互补的第一结构域[Fb]及第二结构域[Fd]，所述第二结构域[Fd]包含与第一多核苷酸的第二结构域充分互补从而使得第一多核苷酸的第二结构域与第二多核苷酸的第二结构域将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列。基础多核苷酸组合的结构关系在图1中示出。
[0063]A.三向接合点
[0064]在三向接合点多核苷酸组合中，引物多核苷酸和固定物多核苷酸通过第一多核苷酸的第二结构域(方案I中的Pc)与第二多核苷酸的第二结构域(方案I中的Fd)之间的相互作用而相关联，并且引物寡核苷酸的第一结构域(图1中的Pa)和固定物多核苷酸的第一结构域(图1中的Fb)与靶多核苷酸中的相应互补区域杂交，如图2中所示(方案2A)。
[0065]B.多于三向的接合点
[0066]本发明还涵盖了其中引物组合包含两个三向接合点的替代实施方案(参见图2 ；方案2B)。在这些实施方案中的一些中，结构域“e”与结构域[Pc]互补，结构域“f”与结构域[Fd]互补，并且结构域“g”与第三靶多核苷酸区域互补。
[0067]本发明进一步涵盖了包含四向接合点的多核苷酸组合。在四向接合点多核苷酸组合中，引物多核苷酸与固定物多核苷酸通过“卡钉”多核苷酸相关联(方案3A，下文)。卡钉多核苷酸能够与引物多核苷酸和固定物多核苷酸的第二结构域杂交。卡钉多核苷酸的结构包含与引物多核苷酸的第二结构域[Pc]充分互补从而使得该区域可在适当的条件下杂交的第一结构域[e]，及与固定物多核苷酸的第二结构域[Fd]充分互补从而使得该区域可在适当的条件下杂交的第二结构域[f]。在这个实施方案的一些方面，引物多核苷酸的第二结构域Pc不必与固定物多核苷酸中的第二结构域Fd充分互补以允许Pc结构域与Fd结构在典型的条件下杂交。在这个方面，卡钉中的第一结构域[e]与引物多核苷酸的第二结构域Pc充分互补，且卡钉的第二结构域[f]与固定物结构域的第二结构域[Fd]充分互补，允许形成图3中所示的稳定四向接合点(方案3A)。
[0068]如本文所描述的，还涵盖在多核苷酸组合中使用另外的“卡钉”多核苷酸，从而产生多向接合点，这取决于多核苷酸组合中的卡钉多核苷酸的数目。方案3B示出五向接合点并且本领域技术人员将容易理解大于五的接合点是怎样构建的。
[0069]进一步地，“卡钉”多核苷酸可包含如本文所描述的经修饰的核苷酸。在另外的方面，“卡钉”多核苷酸可包含标记和/或淬灭剂。在这些方面，标记或淬灭剂可在“卡钉”多核苷酸的5’或3’端。 [0070]C.包含阻断剂多核苷酸的引物组合
[0071]本发明还涵盖了其中阻断剂多核苷酸与多核苷酸组合一起包括在内的实施方案。阻断剂多核苷酸具有与位于紧靠第一靶多核苷酸区域的5’的靶多核苷酸区域互补的序列。这在图4中出。在一些实施方案中，阻断剂多核苷酸与第一多核苷酸的第一结构域重叠。换言之，第一多核苷酸3’端的一个(多个)核苷酸与阻断剂多核苷酸5’端的一个(多个)核苷酸将与祀多核苷酸的一个(多个)相同核苷酸互补。在各个实施方案中，第一多核苷酸与阻断剂多核苷酸的重叠为I个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸或15个核苷酸。在相关实施方案中,第一多核苷酸3’端的一个(多个)核苷酸与阻断剂多核苷酸5’端的一个(多个)核苷酸不同。在这些实施方案中，当第一多核苷酸3’端的一个(多个)核苷酸与祀多核苷酸在适当的位置处互补时，它们将与靶多核苷酸杂交，从而允许第一多核苷酸在适当的条件下延伸(参见图4a)。在相关实施方案中，当阻断剂多核苷酸5’端的一个(多个)核苷酸与非靶多核苷酸在适当的位置处互补时，它们将与靶多核苷酸杂交，从而阻断第一多核苷酸的延伸(参见图4b)。在各个实施方案中，对阻断剂多核苷酸3’端的核苷酸进行修饰以阻止聚合酶引起的延伸。
[0072]在一些实施方案中，阻断剂多核苷酸与第一多核苷酸的第一结构域(Pa)的重叠序列的差异为至少2个碱基、至少3个碱基、至少4个碱基、至少5个碱基、至少6个碱基、至少7个碱基、至少8个碱基、至少9个碱基或至少10个碱基。不同的碱基可以在重叠位置中的任何位置处。
[0073]D.包含探针多核苷酸的引物组合
[0074]本发明还涵盖了其中探针多核苷酸与以上多核苷酸组合一起包括在内的实施方案。探针多核苷酸具有与位于第一祀多核苷酸区域的5’处的祀多核苷酸区域互补的序列(参见图5a)。在其他实施方案中,探针多核苷酸具有与第一多核苷酸的延伸产物互补的序列(参见图5b)。明显地，这种探针多核苷酸将与靶多核苷酸的互补链互补。在其中阻断剂多核苷酸与探针多核苷酸一起包括在引物组合中的实施方案中，探针多核苷酸与位于互补于阻断剂多核苷酸的靶多核苷酸区域的5’处的靶多核苷酸区域互补。在各个实施方案中，探针多核苷酸在其5’端包含标记。在相关实施方案中，探针多核苷酸进一步在其3’端包含淬灭剂。在更进一步的实施方案中，探针多核苷酸进一步包含内部淬灭剂，例如而非限制性地，Zen淬灭剂。
[0075]E.包含通用淬灭剂的引物组合
[0076]在各个实施方案中，引物多核苷酸组合包括通用淬灭剂多核苷酸。通用淬灭剂多核苷酸与第二多核苷酸的第二结构域互补，使得它与第二多核苷酸的第二结构域杂交。在这些实施方案中，通用淬灭剂多核苷酸与位于与第二多核苷酸的第二结构域杂交的区域的3’处的第二多核苷酸的区域杂交(参见图6)。对通用淬灭剂多核苷酸在其3’端用淬灭剂进行标记。
[0077]F.包含反向引物的引物组合
[0078] 本发明还涵盖了其中反向引物多核苷酸与以上多核苷酸组合一起包括在内的实施方案。反向引物与由第一多核苷酸的延伸产生的多核苷酸中的区域互补(参见图8a)。明显地，在一些实施方案中，当靶多核苷酸为双链多核苷酸的一条链时，反向引物还与靶多核苷酸的互补链互补。在一些实施方案中，反向引物为组合第一多核苷酸/第二多核苷酸，如上文所描述(参见图Sb)。
[0079]I1.多核苷酸
[0080]如本文所使用的，作为包括阻断剂多核苷酸和探针的多核苷酸对组合的组分，或作为靶分子的术语“多核苷酸”与术语寡核苷酸可互换使用。
[0081]如本文所使用的术语“核苷酸”或其复数形式与如本文中所讨论的及以其他方式本领域中已知的经修饰形式可互换使用。在某些情况下，本领域使用术语“核碱基(nucleobase)”，其包括天然存在的核苷酸以及可聚合的核苷酸的修饰形式。
[0082]制备预定序列的多核苷酸的方法是本领域中熟知的。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第 2 版，1989)和 F.Eckstein(编著)Oligonucleotides and Analogues,第 I版(OxfordUniversity Press, New York, 1991)。固相合成方法优选用于寡核糖核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸(熟知的合成DNA的方法也可用于合成RNA)。寡核糖核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸也可以酶促制备。 [0083]在各个方面，所提供的方法包括使用多核苷酸，其为DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸或这两种类型的组合。还涵盖了寡核苷酸的经修饰形式，其包括具有至少一个经修饰的核苷酸间连键的那些。经修饰的多核苷酸或寡核苷酸在本文下文中有详细描述。
[0084]II1.经修饰的多核苷酸
[0085]寡核苷酸的具体实例包括含有经修饰的骨架或非天然的核苷间连键的那些。具有经修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些及骨架中没有磷原子的那些。在它们的核苷间骨架中没有磷原子的经修饰的寡核苷酸被认为在“寡核苷酸”的含义之内。在具体实施方案中，第一多核苷酸包含硫代磷酸酯连键。
[0086]含有磷原子的经修饰的寡核苷酸骨架包括，例如，具有正常3’_5’连键的硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’ -亚烷基膦酸酯、5’ -亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)，亚膦酸酯(phosphinate)，磷酰胺酯(包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯)，硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼代磷酸酯(boranophosphate);它们的2’_5’连接的类似物；以及具有反转的极性的其中一个或多个核苷酸间连键为3’至3’、5’至5’或2’至2’连键的那些。还涵盖了这样的寡核苷酸，其具有反转的极性并且在最靠近3’ -端的核苷酸间连键处包含单个3’至3’连键，即，可为无碱基的单个反转的核苷残基(该核苷酸丢失或在其位置上有羟基)。还涵盖了盐、混合盐和游离酸形式。教导上述含磷连键的制备的代表性美国专利包括，美国专利第3，687，808号、第4，469，863号、第4，476，301号、第5，023，243号、第 5，177，196 号、第 5，188，897 号、第 5，264，423 号、第 5，276，019 号、第 5，278，302 号、第 5，286，717 号、第 5，321，131 号、第 5，399，676 号、第 5，405，939 号、第 5，453，496 号、第 5，455，233 号、第 5，466，677 号、第 5，476，925 号、第 5，519，126 号、第 5，536，821 号、第 5，541，306 号、第 5，550，111 号、第 5，563，253 号、第 5，571，799 号、第 5，587，361 号、第5，194，599 号、第 5，565，555 号、第 5，527,899 号、第 5，721,218 号、第 5,672,697 号和第5,625,050号，其公开内容以引用的方式并入本文。
[0087]在其中不包括磷原子的经修饰的寡核苷酸骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间连键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间连键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连键形成的骨架。这些骨架包括具有吗啉代连键的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；核糖乙酰基(riboacetyl)骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和氨苯磺胺骨架；酰胺骨架；及其他具有混合N、0、S和CH2组成部分的骨架。参见，例如，美国专利第5，034，506号、第5，166，315号、第 5, 185, 444 号、第 5, 214, 134 号、第 5, 216, 141 号、第 5, 235, 033 号、第 5, 264, 562 号、第 5，264，564 号、第 5，405，938 号、第 5，434，257 号、第 5，466，677 号、第 5，470，967 号、第 5，489，677 号、第 5，541，307 号、第 5，561，225 号、第 5，596，086 号、第 5，602，240 号、第 5，610，289 号、第 5，602，240 号、第 5，608，046 号、第 5，610，289 号、第 5，618，704 号、第 5，623，070 号、第 5，663，312 号、第 5，633，360 号、第 5，677，437 号、第 5，792，608 号、第5，646，269号和第5，677，439号，其全部公开内容以引用的方式并入本文。
[0088]在又一些其他实施方案中，还包括寡核苷酸模拟物，其中核苷酸单元的一个或多个糖和/或一个或多个核苷酸间连键被“非天然存在”的基团取代。在一方面，这个实施方案涵盖了肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架替代。参见，例如美国专利第5，539, 082号、第5,714, 331号，及第5,719, 262号，以及Nielsen等人，1991, Science, 254:1497-1500，其公开内容以引用的方式并入本文中。
[0089]在又一些其他实施方案中，提供了具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸及美国专利第5，489，677号和第5，602，240号中描述的具有杂原子骨架并且包括一CH2—NH— 0—CH2—、— CH2— N (CH3) — 0— CH2—、— CH2— 0— N (CH3) — CH2—、— CH2— N (CH3) — N (CH3)—CH2—和一0— N(CH3) —CH2—CH2—的寡核苷。还涵盖了美国专利第5，034，506号中描述的具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸。
[0090]在各种形式中，寡聚体中两个连续单体间的连键由2至4个，期望3个选自以下的基团 / 原子组成:一CH2—、一0—、一S一、一NRh—、>C=0、>C=NRh、>C=S、一Si(R")2—、一S0—、一S(0)2—、一P(0)2—、一Ρ0(ΒΗ3)—、一Ρ(0, S)—、一Ρ(s)2—、一P0(R")—、一P0(0CH3) —，一P0(NHRh ) —，其中RH选自氢和Ci_4-烷基，并且R〃选自(^_6-烷基和苯基。此类连键的不例性实例为一CH2一CH2一CH2一、一CH2一C0一CH2一、一CH2一CH0H一CH2一、一0—CH2一0一、一0一CH2一CH2一、一0一CH2一CH=(当用作与后续单体的连键时包括R5)、一CH2—CH2—ο—、—NRh—CH2—CH2—、—CH2—CH2—nrh—、—CH2—nrh—CH2—、—o—CH2—CH2—NRH—、一NRH—CO—0—、一NRH—CO—NRH—、一NRH—CS—NRH—、一nrh—C(=NRh) —NRh—、一NRH—CO—CH2—NRH—0—CO—0—、一0—CO—CH2—o—、— o—CH —CO—o—、—CH2—CO—nrh—、—o—CO—nrh—、—nrh—CO—CH2—、—0—CH2—CO—NRH—、一0—CH2—CH2—NRH—、一CH=N—0—、一CH2—NRH—0—、一CH2—0—N=(当用作与后续单体的连键时包括R5)、—CH—o—NRH—, 一C0 — NRH — CH2—、— CH—NRH—ο—、—CH2—nrh—CO—、—o—nrh—CH2—、—o—nrh、—0—CH2—s—、—S—CH2—0一、一CH2一CH2一S一、一0一CH2一CH2一S一、一S一CH2一CH=(当用作与后续单体的连键时包括 R5)、—S—CH2—CH2—、—S—CH2—CH2—o—、—S—CH2—CH2—s—、—CH2—s—CH2—、—CH2—SO—CH2—、—CH2—S02—CH2—、—o—so—o—、—o—s (o) 2—o—、—o—s (o) 2—CH2—、—o—s (o) 2—nrh—、—nrh—s (o) 2—CH2— ；—o—s (o) 2—CH2—、—o—P(0)2—0—、— o—P(0, s) — o—、—o—p(s)2—o—, — s—P(0)2—o—, — s—P(0, s) —
0—、— s—P(S)2—o—, —o—p(o)2—s—, 一0— P(0, S) — S—、一0— P(S)2—S—、.....:u.....: ' — s—P(0, s) —s—, — s—p(s)2—s—, 一0—P0(R") — 0—、—Ο-ΡΟ (och3) 一 o—、一 o—po (o ch2ch3) 一 ο—、一 o—po (och2ch2s— R)—ο—、一 ο— ρο (βη3)—0—、一0—P0(NHRn) — 0—、一0—Ρ(0)2—nrh[0091]H—、一NRH—P(0)2—O—、一0—P(0，NRH) —0—、一 CH2—P (0) 2—0—、一0—P(O)2—CH2—和—0—Si (R^) 2—0—;其中涵盖了—CH2—CO—NRh—、—CH2—NRh—0—、—S-CH2-O-, -O-P(O)2-o—o—P (-0, s) —ο—, -O-P(s) 2—ο—, -NRhP (O)—Ο—、—0—P(0, NRh)-O—, —O—PO(R") —O—、— O— PO(CH3) — O-^P-O-PO(NHRn)—O —，其中RH选自氢和Cu-烷基，并且R〃选自CV6-烷基和苯基。进一步的示例性实例在 Mesmaeker 等人，1995，Current Opinion in Structural Biology, 5:343-355 及 SusanM.Freier 和 Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, 25 卷:4429-4443 页中
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[0092]寡核苷酸的又一些其他经修饰的形式详细描述于美国专利申请第20040219565号中，该美国专利申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。
[0093]经修饰的寡核苷酸也可含有一个或多个经取代的糖部分。在某些方面，寡核苷酸在2’位置包含下列基团中的一个:0H ；F ;0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0_、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可为经取代或未经取代的C1至Cltl烷基或 C2 至 C10 烯基和炔基。其他实施方案包括 0[(CH2)n0]mCH3、0(CH2)n0CH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2 和 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中 η 和 m 为 I 至约 10。其他寡核苷酸在 2’位置包含下列基团中的一个=C1至Cltl低级烷基、经取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或 O-芳烷基、SH、SCH3> 0CN、Cl、Br、CN、CF3> OCF3> SOCH3> S02CH3> ONO2, NO2,N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、改善寡核苷酸的药物代谢动力学性质的基团，或改善寡核苷酸的药效动力学性质的基团，及其他具有相似性质的取代基。在一方面，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2，-O-CH2CH2OCH3,也称为 2’ -0-(2-甲氧基乙基)或 2’ -Μ0Ε) (Martin 等人，1995，Helv.Chim.Acta, 78:486-504)即，烷氧基烷氧基基团。其他修饰包括如本文下面的实施例中所描述的2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMA0E，以及也描述于本文下面的实施例中的2’ - 二甲基`氨基乙氧基乙氧基(在本领域中还称为2’ -O-二甲基 _ 氣基 _ 乙氧基 _ 乙基或 2’ _DMAE0E)，即，2’ _0—CH2—O—CH2—N (CH3) 2。
[0094]还有一些其他修饰包括2’ -甲氧基(2’ -O-CH3)、2’ -氨基丙氧基(2’ -OCH2CH2CH2NH2)、2’ -烯丙基(2’ -CH2-CH=CH2)、2’ -O-烯丙基(2’ -O-CH2-CH=CH2)和2’ -氟代(2’ -F)。2’ -修饰可以在阿拉伯糖(arabino)(上方)位置或核糖(ribo)(下方)位置。在一方面，2’ -阿拉伯糖修饰为2’ -F。类似的修饰也可在寡核苷酸上的其他位置，例如，在3’末端核苷酸上糖的3’位置上或在2’-5’连接的寡核苷酸中以及在5’末端核苷酸的5’位置上进行。寡核苷酸也可具有糖模拟物，例如环丁基部分来代替呋喃戊糖。参见，例如，美国专利第 4，981，957 号、第 5，118，800 号、第 5，319，080 号、第 5，359，044 号、第 5，393，878号、第 5, 446, 137 号、第 5, 466, 786 号、第 5, 514, 785 号、第 5, 519, 134 号、第 5, 567, 811 号、第 5，576，427 号、第 5，591，722 号、第 5，597，909 号、第 5，610，300 号、第 5，627，053 号、第5,639,873 号、第 5,646，265 号、第 5,658,873 号、第 5,670,633 号、第 5，792，747 号和第5，700，920号，所述美国专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。
[0095]在各个方面，糖的修饰包括锁核酸(LNA)，其中2’-羟基连接至糖环的3’或4’碳原子，从而形成双环糖部分。该连键在某些方面为桥接2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(一CH2-)n基团，其中η为I或2。LNA及其制备描述于W098/39352和W099/14226中，其全部公开内容以引用的方式并入本文。在各个实施方案中，第一多核苷酸包含锁核酸。在一些实施方案中，第一多核苷酸包含多个锁核酸。在具体实施方案中，第一多核苷酸的第一结构域包含多个锁核酸。在更具体的实施方案中，在第一多核苷酸的3’端的核苷酸包含锁核酸。在各个实施方案中，阻断剂多核苷酸包含锁核酸。在其他实施方案中，阻断剂多核苷酸包含多个锁核酸。在具体实施方案中，在阻断剂多核苷酸的5’端的核苷酸包含锁核酸。[0096]多核苷酸也可包括碱基修饰或取代。如本文所使用的“未经修饰的”或“天然的”碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的碱基包括其他合成和天然的碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代，特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步的经修饰的碱基包括三环嘧啶，例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b] [I, 4]苯并噁嗪-2 (3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4_b][I, 4]苯并噻嗪-2 (3H)-酮)，G-夹(G-clamp)例如经取代的吩噁嗪胞苷(例如9- (2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b] [I, 4]苯并噁嗪-2(3H)_酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5_b]叼丨哚-2-酮)、吡啶吲哚胞苷(H-吡啶并[3，，2’:4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶_2_酮)。修饰的碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的碱基，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤，2-氨基吡啶和2-吡啶酮。进一步的碱基包括在美国专利第3，687，808号中公开的喊基、在 TheConcise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,第858-859 页，Kroschwitz, J.1.编著，John ffiley&Sons, 1990 中公开的喊基、由 Englisch等人，1991, Angewandte Chemie,国际版，30:613 公开的碱基，及由 Sanghvi, Y.S.,第 15章，Antisense Research and Applications,第 289-302 页，Crooke, S.Τ.和 Lebleu, B.编著，CRC Press，1993公开的碱基。这些碱基中的某些可用于增加结合亲和力并且包括
5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已被证明能使核酸双链体的稳定性增加0.6-1.2°C，并且在某些方面，与2’ -O-甲氧基乙基糖修饰组合。参见，美国专利第3，687，808 号、美国专利第 4，845，205 号、第 5，130，302 号、第 5，134，066 号、第 5，175，273号、第 5，367，066 号、第 5，432，272 号、第 5，457，187 号、第 5，459，255 号、第 5，484，908 号、第 5，502，177 号、第 5，525，711 号、第 5，552，540 号、第 5，587，469 号、第 5，594，121 号、第 5, 596, 091 号、第 5, 614, 617 号、第 5, 645, 985 号、第 5, 830, 653 号、第 5, 763, 588 号、第6，005，096号、第5，750, 692号和第5，681，941号，所述美国专利的公开内容以引用的方式并入本文。
[0097]“经修饰的碱基”或其他类似术语是指可与天然碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配对和/或可与非天然存在的碱基配对的组合物。在某些方面，经修饰的碱基提供15、12、10、8、6、4，或21:或更低的Tni差异。示例性的经修饰的碱基描述于 EP1072679 和 W097/12896 中。
[0098]所谓“核碱基”意指天然存在的核碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及非天然存在的核碱基，例如黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N4，N4-乙醇胞嘧啶、N’，N’ -乙醇-2，6- 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷，以及在Benner等人，美国专利第 5, 432, 272 号和 Susan M.Freier 与 Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic AcidsResearch，25卷:4429-4443页中描述的“非天然存在的”核碱基。因此，术语“核碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环化合物，而且包括杂环类似物及它们的互变异构体。进一步的天然和非天然存在的核碱基包括在美国专利第3，687，808号(Merigan等人)，Sanghvi,第 15 章，Antisense Research and Application, S.T.Crooke 和 B.Lebleu 编著,CRCPress, 1993, Englisch 等人，1991，AngewandteChemie,国际版，30:613-722 (参见特别是622 和 623 页),以及在 ConciseEncyclopedia of Polymer Science and Engineering, J.1.Kroschwitz 编著，John ffiley&Sons, 1990,858-859 页，Cook, Ant1-Cancer DrugDesignl991, 6, 585-607中公开的核碱基，每篇上述文献的全文均据此以引用的方式并入)。术语“核苷碱基”或“碱基单元”进一步意欲包括可起到类似核碱基作用的化合物，例如杂环化合物，包括在最经典的意义上不是核苷碱基但起到核苷碱基作用的某些“通用碱基”。特别提及作为通用碱基的是3-硝基吡咯、任选地经取代的吲哚类(例如，5-硝基吲哚)，和任选地经取代的次黄嘌呤。其他理想的通用碱基包括，吡咯、二唑或三唑衍生物，包括本领域中已知的那些通用碱基。
[0099]IV.多核苷酸结构-长度
[0100]在一方面，第一多核苷酸的第一结构域为与靶多核苷酸区域互补的5个核苷酸。在各个方面，第一多核苷酸的第一结构域为与靶多核苷酸区域互补的至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸或更多个核苷酸。在相关方面， 第一多核苷酸的第二结构域包含与第二多核苷酸的第二结构域充分互补的独特DNA序列中的10个或更多个核苷酸，以便允许这两个互补序列在适当条件下杂交。在各个方面，第一多核苷酸的第二结构域包含与第二多核苷酸的第二结构域充分互补的独特DNA序列的至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个核苷酸、至少25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约60个、至少约70个、至少约80个、至少约90个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个、至少约200个、至少约220个、至少约240个、至少约260个、至少约280个、至少约300个、至少约320个、至少约340个、至少约360个、至少约380个、至少约400个、至少约420个、至少约440个、至少约460个、至少约480个、至少约500或更多个核苷酸，以便允许这两个互补序列在适当条件下杂交。[0101]在另一个实施方案中，第二多核苷酸包含含有约10个核苷酸的第一结构域，第二多核苷酸的这个第一结构域互补于与由第一多核苷酸的第一结构域识别的靶区域不同的靶DNA区域。在各个方面，第二多核苷酸包含含有至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个、至少48个、至少49个、至少50个、至少约100个、至少约150个、至少约200个、至少约250个、至少约300个、至少约350个、至少约400个、至少约450个、至少约500个、至少约550个、至少约600个、至少约650个、至少约700个、至少约750个、至少约800个、至少约850个、至少约900个、至少约950个、至少约1000个、至少约1100个、至少约1200个、至少约1300个、至少约1400个、至少约1500个、至少约1600个、至少约1700个、至少约1800个、至少约1900个、至少约2000个、至少约2100个、至少约2200个、至少约2300个、至少约2400个、至少约2500个、至少约2600个、至少约2700个、至少约2800个、至少约2900个、至少约3000个、至少约3100个、至少约3200个、至少约3300个、至少约3400个、至少约3500个、至少约3600个、至少约3700个、至少约3800个、至少约3900个、至少约4000个、至少约4100个、至少约4200个、至少约4300个、至少约4400个、至少约4500个、至少约4600个、至少约4700个、至少约4800个、至少约4900个、至少约5000个或更多个核苷酸的第一结构域，该第二多核苷酸的第一结构域是互补的，或充分互补的，以便识别并结合至与由第一多核苷酸的第一结构域识别的靶区域不同的靶DNA区域。
[0102]在相关方面，第二多核苷酸的第二结构域包含与第一多核苷酸的第二结构域充分互补的独特DNA序列的10个核苷酸以便允许在适当条件下杂交。在各个方面，第二多核苷酸的第二结构域包含与第一多核苷酸的第二结构域充分互补的独特DNA序列的至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少约30个、至少约35个、至少40个、至少约45个、至少约5`0个、至少约60个、至少约70个、至少约80个、至少约90个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个、至少约200个、至少约220个、至少约240个、至少约260个、至少约280个、至少约300个、至少约320个、至少约340个、至少约360个、至少约380个、至少约400个、或至少约420个、或至少约440个、至少约460个、至少约480个、至少约500或更多个核苷酸，以便允许这两个充分互补的序列在适当的条件下杂交。
[0103]在一些实施方案中，本文所描述的组合物和方法包括具有上面针对第一和第二多核苷酸描述的特征的第二组多核苷酸。在一些实施方案中，涵盖了多个组。这些另外的组的第一和第二多核苷酸可具有针对第一和第二多核苷酸描述的任何特征。
[0104]如图3 (方案3A和3B)中描述的“卡钉”多核苷酸在一方面被涵盖为包含至少20个核苷酸。在其他方面，“卡钉”多核苷酸可包含至少21个核苷酸，或至少22个核苷酸，或至少23个核苷酸，或至少24个核苷酸，或至少25个核苷酸，或至少26个核苷酸，或至少27个核苷酸，或至少28个核苷酸，或至少29个核苷酸，或至少30个核苷酸，或至少约35个核苷酸，或至少约40个核苷酸，或至少约45个核苷酸，或至少约50个核苷酸，或至少约55个核苷酸，或至少约60个核苷酸，或至少约65个核苷酸，或至少约70个核苷酸，或至少约75个核苷酸，或至少约80个核苷酸，或至少约85个核苷酸，或至少约90个核苷酸，或至少约95个核苷酸，或至少约100个核苷酸，或至少约150个核苷酸，或至少约200个核苷酸，或至少约250个核苷酸，或至少约300个核苷酸，或至少约350个核苷酸，或至少约400个核苷酸，或至少约450个核苷酸，或至少500个核苷酸或更多个核苷酸。
[0105]在一些实施方案中,通用淬灭剂多核苷酸的长度为约5个核苷酸至约100个碱基。在各个方面，通用淬灭剂多核苷酸包含与第二多核苷酸的第二结构域充分互补的独特DNA序列的至少5个核苷酸,或至少6个核苷酸,或至少7个核苷酸,或至少8个核苷酸,或至少9个核苷酸，或至少10个核苷酸，或至少11个核苷酸，或至少12个核苷酸，或至少13个核苷酸，或至少14个核苷酸，或至少15个核苷酸，或至少16个核苷酸，或至少17个核苷酸，或至少18个核苷酸，或至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸，或至少21个核苷酸，或至少22个核苷酸，或至少23个核苷酸，或至少24个核苷酸，或至少25个核苷酸，或至少26个核苷酸，或至少27个核苷酸，或至少28个核苷酸，或至少29个核苷酸，或至少30个核苷酸，或至少约35个核苷酸，或至少约40个核苷酸，或至少约45个核苷酸，或至少约50个核苷酸，或至少约55个核苷酸，或至少约60个核苷酸，或至少约65个核苷酸，或至少约70个核苷酸，或至少约75个核苷酸，或至少约80个核苷酸，或至少约85个核苷酸，或至少约90个核苷酸，或至少约95个核苷酸，或至少约100个核苷酸，以便允许在适当的条件下杂交。
[0106] 在一些实施方案中，探针多核苷酸的长度为约5个核苷酸至约100个碱基。在各个方面，探针多核苷酸包含与靶多核苷酸区域充分互补的DNA序列的至少5个核苷酸，或至少6个核苷酸，或至少7个核苷酸，或至少8个核苷酸，或至少9个核苷酸，或至少10个核苷酸，或至少11个核苷酸，或至少12个核苷酸，或至少13个核苷酸，或至少14个核苷酸，或至少15个核苷酸,或至少16个核苷酸,或至少17个核苷酸,或至少18个核苷酸,或至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸，或至少21个核苷酸，或至少22个核苷酸，或至少23个核苷酸，或至少24个核苷酸，或至少25个核苷酸，或至少26个核苷酸，或至少27个核苷酸，或至少28个核苷酸，或至少29个核苷酸，或至少30个核苷酸，或至少31个核苷酸，或至少32个核苷酸，或至少33个核苷酸，或至少34个核苷酸，或至少35个核苷酸，或至少36个核苷酸，或至少37个核苷酸，或至少38个核苷酸，或至少39个核苷酸，或至少40个核苷酸，或至少约45个核苷酸，或至少约50个核苷酸，或至少约55个核苷酸，或至少约60个核苷酸，或至少约65个核苷酸，或至少约70个核苷酸，或至少约75个核苷酸，或至少约80个核苷酸，或至少约85个核苷酸，或至少约90个核苷酸，或至少约95个核苷酸，或至少约100个核苷酸，以便允许在适当的条件下杂交。
[0107]在一些实施方案中，阻断剂多核苷酸的长度为约5个核苷酸至约100个碱基。在各个方面，阻断剂多核苷酸包含与祀多核苷酸区域充分互补的多核苷酸序列的至少5个核苷酸，或至少6个核苷酸,或至少7个核苷酸,或至少8个核苷酸,或至少9个核苷酸,或至少10个核苷酸，或至少11个核苷酸，或至少12个核苷酸，或至少13个核苷酸，或至少14个核苷酸，或至少15个核苷酸，或至少16个核苷酸，或至少17个核苷酸，或至少18个核苷酸，或至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸，或至少21个核苷酸，或至少22个核苷酸，或至少23个核苷酸，或至少24个核苷酸，或至少25个核苷酸，或至少26个核苷酸，或至少27个核苷酸，或至少28个核苷酸，或至少29个核苷酸，或至少30个核苷酸，或至少31个核苷酸，或至少32个核苷酸，或至少33个核苷酸，或至少34个核苷酸，或至少35个核苷酸，或至少36个核苷酸，或至少37个核苷酸，或至少38个核苷酸，或至少39个核苷酸，或至少40个核苷酸，或至少约45个核苷酸，或至少约50个核苷酸，或至少约55个核苷酸，或至少约60个核苷酸，或至少约65个核苷酸，或至少约70个核苷酸，或至少约75个核苷酸，或至少约80个核苷酸，或至少约85个核苷酸，或至少约90个核苷酸，或至少约95个核苷酸，或至少约100个核苷酸，以便允许在适当条件下杂交。在各个实施方案中，阻断剂多核苷酸进一步在其5’端包含作为核苷酸的经修饰的核酸。在各个实施方案中，经修饰的核酸为锁核酸。在一些实施方案中，阻断剂多核苷酸进一步在3’端包含阻断基团以阻止聚合酶引起的延伸。
[0108]在一些实施方案中，反向引物多核苷酸的长度为约5个核苷酸至约100个碱基。在各个方面，反向引物多核苷酸包含与聚合酶延伸的第一多核苷酸的区域充分互补的多核苷酸序列的至少5个核苷酸，或至少6个核苷酸，或至少7个核苷酸，或至少8个核苷酸，或至少9个核苷酸，或至少10个核苷酸，或至少11个核苷酸，或至少12个核苷酸，或至少13个核苷酸，或至少14个核苷酸,或至少15个核苷酸,或至少16个核苷酸,或至少17个核苷酸，或至少18个核苷酸，或至少19个核苷酸，或至少20个核苷酸，或至少21个核苷酸，或至少22个核苷酸，或至少23个核苷酸，或至少24个核苷酸，或至少25个核苷酸，或至少26个核苷酸，或至少27个核苷酸，或至少28个核苷酸，或至少29个核苷酸，或至少30个核苷酸，或至少31个核苷酸，或至少32个核苷酸，或至少33个核苷酸，或至少34个核苷酸，或至少35个核苷酸，或至少36个核苷酸，或至少37个核苷酸，或至少38个核苷酸，或至少39个核苷酸，或至少40个核苷酸，或至少约45个核苷酸，或至少约50个核苷酸，或至少约55个核苷酸，或至少约60个核苷酸，或至少约65个核苷酸，或至少约70个核苷酸，或至少约75个核苷酸，或至少约80个核苷酸，或至少约85个核苷酸，或至少约90个核苷酸，或至少约95个核苷酸，或至少约100个核苷酸，以便允许在适当的条件下杂交。在一些实施方案中，当靶多核苷酸为双链多核苷酸时，反向引物与靶多核苷酸的互补链互补。在一些实施方案中，反向引物为如本文所定义的第一和第二多核苷酸的组合。
[0109]V.多核苷酸碱基结构
[0110]在一些实施方案中，第一多核苷酸由DNA、经修饰的DNA、RNA、经修饰的RNA、PNA或它们的组合构成。在其他实施方案`中`，第二多核苷酸由DNA、经修饰的DNA、RNA、经修饰的RNA、PNA或它们的组合构成。
[0111]V1.多核苷酸结构-阻断基团
[0112]当不期望来自多核苷酸的3’区域的聚合酶延伸时，根据需要掺入阻断基团。例如，第二多核苷酸的第二结构域在另一方面进一步在第二结构域的3’端包含阻断基团(图1中的“R”)以阻止能够合成核酸的酶引起的延伸。在另外的方面，通用淬灭剂在其3’端包含阻断基团。在进一步的方面，阻断剂多核苷酸在其3’端包含阻断基团。可用在所述方法的实践中的阻断基团包括但不限于3’磷酸酯团、3’氨基、双脱氧核苷酸、六碳二醇间隔物(及在一方面，六碳二醇间隔物为己二醇)和反转脱氧胸苷(dT)。
[0113]VI1.多核苷酸结构-互补性
[0114]在一些方面，第二多核苷酸的第二结构域与第一多核苷酸的第二结构域至少约70%互补。在相关方面，第二多核苷酸的第二结构域与第一多核苷酸的第二结构域至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或约100%互补。[0115]在一方面，第三多核苷酸的第二结构域与第四多核苷酸的第二结构域至少约70%互补。在相关方面，第三多核苷酸的第二结构域与第四多核苷酸的第二结构域至少约75%，或至少约80%，或至少约85%，或至少约90%，或至少约95%或约100%互补。
[0116]在另一方面，阻断剂多核苷酸与靶多核苷酸中的序列至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或约100%互补，并且在又一个方面，探针多核苷酸与靶多核苷酸中的序列至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或约100%互补。
[0117]VI I1.杂交条件
[0118]在一些实施方案中，在不存在模板多核苷酸的情况下第一和第二多核苷酸在严格条件下彼此杂交。在一些实施方案中，在不存在模板多核苷酸的情况下第一和第二多核苷酸在严格条件下不彼此杂交。如本文所使用的“严格条件”可由本领域普通技术人员凭经验确定，并且将根据以下而变化，例如，引物的长度、引物的互补性、引物的浓度、杂交缓冲液中的盐浓度(即，离子强度)、进行杂交的温度、进行杂交的持续时间，及影响多核苷酸表面电荷的因素的存在。一般而言，严格条件为这样的条件，其中多核苷酸能够优先并且以相对于靶上的任何其他区域较高的亲和力与其互补序列结合。对于与其具有20个碱基的多核苷酸序列的互补体的杂交而言，不例性严格条件包括而不限于，约50%G+C含量、50mM盐(Na+)，及60°C的退火温度。对于较长的序列，特异性杂交在较高的温度下实现。一般而言，严格条件为确保退火在比多核苷酸的解链温度低约5°C的温度下进行的条件。“解链温度”为在一定的离子强度、pH和多核苷酸浓度下在平衡时50%的多核苷酸与祀多核苷酸互补时的温度。
[0119]IX.使用方法
[0120]A.PCR
[0121]在本文所描述的靶多核苷酸扩增方法中，考虑将第三多核苷酸和第四多核苷酸与上述多核苷酸组合结合使用，第三多核苷酸包含在第一祀互补体多核苷酸区域处与祀多核苷酸的互补链[相对于与第一多核苷酸的第一结构域互补的链而言]互补的第一结构域[Pa]，及包含独特多核苷酸序列的第二结构域[Pc]，并且第四多核苷酸包含在第二互补体靶多核苷酸区域处与靶多核苷酸的互补链[相对于与第二多核苷酸互补的链而言]互补的第一结构域[Fb]，及第二结构域[Fd]，所述第二结构域[Fd]包含与第三多核苷酸的第二结构域充分互补从而使得第三多核苷酸的第二结构域与第四多核苷酸的第二结构域将在适当条件下杂交的多核苷酸序列。在这些方面的一些中，所述方法进一步包括使靶多核苷酸和靶多核苷酸的互补体与第一多核苷酸和第二多核苷酸和第三多核苷酸和第四多核苷酸在足以允许第一多核苷酸的第一结构域与靶多核苷酸的第一靶多核苷酸区域杂交，第二多核苷酸的第一结构域与靶多核苷酸的第二靶多核苷酸区域杂交，第三多核苷酸的第一结构域与靶多核苷酸的互补链的第一靶结构域杂交，及第四多核苷酸的第一结构域与第二补体靶多核苷酸区域杂交的条件下接触，以及在允许第一多核苷酸和第三多核苷酸延伸的条件下用DNA聚合酶延伸第一和第四多核苷酸的第一结构域(即，引发结构域)。
[0122]在一些方面，如本文上面描述的阻断基团连接至第二多核苷酸和/或第四多核苷酸的3’端，其阻断能够合成核酸的酶引起的延伸。可用于所述方法的实践中的阻断基团包括但不限于3’磷酸基团、3’氨基、双脱氧核苷酸，及反转脱氧胸苷(dT)。[0123]在各个实施方案中，靶多核苷酸、靶多核苷酸的互补体或这二者具有被第二多核苷酸的第一结构域和/或第四多核苷酸的第一结构域与靶多核苷酸的杂交而变性的二级结构。
[0124]在一个实施方案中，考虑将多核苷酸组合用于PCR中，如图7a_f (方案4-9)中所示。在方案4中，在描绘成W-(沃森(Watson))和C-(克里克(Crick))链的靶多核苷酸的相反链上使用引物A ( 即，如本文所描述的第一多核苷酸)和B ( 即，如本文所描述的第三多核苷酸)。如图7f (方案9)中所示，在步骤12之后，靶多核苷酸的扩增仅需要引物A和B。
[0125]本领域普通技术人员将会意识到，本发明的多核苷酸组合可用于引发给定PCR扩增子的一端或两端。如本文所使用的，“扩增子”应被理解为意指已使用扩增技术合成的多核苷酸的一部分。可以预见的是，包含一种以上多核苷酸组合的本发明任何方法可利用标准引物和多核苷酸组合的任何组合，条件是所述引物中的至少一种为如本文所描述的多核苷酸组合。
[0126]B.简单的第二链合成
[0127]在另一个实施方案中，提供了使用第一和第二多核苷酸扩增靶多核苷酸的方法，其包括使靶多核苷酸与本文所公开的第一和第二多核苷酸在足以允许第一多核苷酸的第一结构域与靶多核苷酸的第一靶多核苷酸区域杂交及第二多核苷酸的第一结构域与靶多核苷酸的第二靶多核苷酸区域杂交的条件下接触，以及在允许第一多核苷酸的第一结构域延伸的条件下用DNA聚合酶延伸第一多核苷酸的第一结构域(即，引发结构域)。在一些方面，然后将第一多核苷酸(及从其延伸的相关多核苷酸产物)和第二多核苷酸从靶多核苷酸上变性，并使另一组第一和 第二多核苷酸与靶多核苷酸杂交。
[0128]在一方面，第一多核苷酸和第二多核苷酸相继与祀多核苷酸杂交。在另一方面，第一多核苷酸的第一结构域与靶杂交，之后第二多核苷酸的第一结构域才与靶多核苷酸杂交。在又一方面，第二多核苷酸的第一结构域与靶多核苷酸杂交，之后第一多核苷酸的第一结构域才与靶多核苷酸杂交。在另一方面，第一多核苷酸的第一结构域和第二多核苷酸的第一结构域同时与靶多核苷酸杂交。
[0129]在各个实施方案中，靶多核苷酸包括但不限于染色体DNA、基因组DNA、质粒DNA、cDNA、RNA、合成多核苷酸、单链多核苷酸或双链多核苷酸。在一方面,祀为双链多核苷酸并且第一多核苷酸的第一结构域和第二多核苷酸的第一结构域与双链靶多核苷酸的同一链杂交。在另一方面，在第一多核苷酸和第二多核苷酸与祀多核苷酸杂交之前，第一多核苷酸的第二结构域与第二多核苷酸的第二结构域杂交。
[0130]在一个实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸同时与祀多核苷酸杂交，并且第三多核苷酸和第四多核苷酸同时与祀多核苷酸的互补体杂交，在第一多核苷酸和第二多核苷酸与祀多核苷酸杂交的同时，第三多核苷酸和第四多核苷酸与祀多核苷酸的互补体杂交。
[0131]在另一个实施方案中，第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和第四多核苷酸不在同一时间与祀多核苷酸和祀多核苷酸的互补体杂交。
[0132]在又一个实施方案中，第一多核苷酸的第二结构域和第二多核苷酸的第二结构域在与靶多核苷酸杂交之前杂交。在另一个实施方案中，第三多核苷酸的第二结构域和第四多核苷酸的第二结构域在与靶多核苷酸的互补体杂交之前杂交。[0133]在一个实施方案中，第一多核苷酸的第二结构域和第二多核苷酸的第二结构域在与靶多核苷酸杂交之前杂交，并且第三多核苷酸的第二结构域和第四多核苷酸的第二结构域在与靶多核苷酸的互补体杂交之前杂交。
[0134]在另一个实施方案中，靶多核苷酸在第一多核苷酸的第一结构域与靶多核苷酸杂交的区域中含有突变。在一些实施方案中，靶多核苷酸在第一多核苷酸的第一结构域与靶多核苷酸杂交的区域中完全互补。在一些实施方案中，非靶多核苷酸在第一多核苷酸的第一结构域与非靶多核苷酸杂交的区域中不完全互补。在另一个实施方案中，靶多核苷酸在第三多核苷酸的第一结构域与靶多核苷酸杂交的区域中含有突变。在一些实施方案中，靶多核苷酸在第一多核苷酸的第三结构域与靶多核苷酸杂交的区域中完全互补。在一些实施方案中，非靶多核苷酸在第一多核苷酸的第三结构域与非靶多核苷酸杂交的区域中不完全互补。在一些方面，突变为去稳定突变。在相关方面，去稳定突变阻止第一多核苷酸，或第三多核苷酸，或这二者的延伸。
[0135]C.多重检测(Multiplexing)
[0136]在一个实施方案中，由能够合成核酸的酶引起的延伸为多重延伸(multiplexextension),第一多核苷酸的第一结构域具有与祀多核苷酸中一个以上区域杂交的性质。在相关实施方案中，由能够合成核酸的酶引起的延伸为多重 延伸，第三多核苷酸的第一结构域具有与祀多核苷酸中一个以上基因座杂交的性质。
[0137]在相关实施方案中，使用至少两种多核苷酸引物执行多重PCR以扩增一种以上的多核苷酸产物。在这些实施方案的一些方面，用于多重PCR的每种多核苷酸引物均为如本文所公开的多核苷酸组合。在其他方面，用于多重PCR的至少一种多核苷酸引物为如本文所公开的多核苷酸组合。
[0138]在另一个实施方案中，多重PCR使用多种固定物多核苷酸执行并且是针对基因组重复序列。在另一个实施方案中，固定物多核苷酸由随机序列构成。在这些方面的一些中，多种固定物多核苷酸是指约10个多核苷酸序列。在其他方面，多种固定物多核苷酸是指约
15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约
85、约 90、约 95、约 100、约 150、约 200、约 250、约 300、约 350、约 400、约 450、约 500、约 550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000或更多个多核苷酸序列。这些固定物多核苷酸序列将利用存在于如本文所描述的引物和固定物多核苷酸中的独特的互补多核苷酸序列，在许多引物多核苷酸然后可与其结合的基因组中提供许多“固定”位置。
[0139]D.实时 PCR
[0140]具有标准三向接合点的引物组合可用于实时PCR。罕见转录本的分析和定量、病原体的检测、具有突变的罕见癌细胞的诊断，或癌症患者中的异常基因甲基化水平低是可通过改进的实时PCR测定解决的问题，所述改进的实时PCR测定结合了靶扩增的高敏感性和特异性、靶检测的高特异性、在存在成千上万拷贝的正常DNA的情况下选择性地扩增和检测少量癌症特异性突变等位基因或异常甲基化启动子的能力，及低拷贝数RNA转录本的分析和定量，检测荧光来追踪在一个测定中多重检测4-5个不同靶的能力以最大程度地利用当前的实时热循环仪的功能。将荧光团定位在引物多核苷酸的5’端，并将淬灭剂定位在固定物多核苷酸的3’端。在这种构造中，当引物与固定物多核苷酸杂交时没有检测到荧光(因为荧光团邻近淬灭剂定位)。然而，在PCR期间在引物多核苷酸延伸后，引物多核苷酸与固定物多核苷酸在PCR的变性阶段将会分离，从而在荧光团与淬灭剂之间产生距离并导致可检测的荧光信号。
[0141]具有四向接合点的引物组合也可用于实时PCR。在引物多核苷酸的5’端用荧光团进行标记，并在卡钉的3’端用淬灭剂进行标记。固定物多核苷酸未被标记。因为引物和固定物多核苷酸的第二结构域区域都是独特的，所以卡钉多核苷酸可用作“通用”多核苷酸(图10 ;方案10)。
[0142]具有两向接合点的引物组合和探针多核苷酸也可用于实时PCR。在探针多核苷酸的5’端用荧光团进行标记，在其3’端用淬灭剂进行标记，并且在一些实施方案中，用另外的内部淬灭剂进行标记。当第一多核苷酸被具有5’至3’核酸外切酶活性的聚合酶，例如，Taq聚合酶延伸时，标记被切割并且不再被淬灭，从而导致来自标记的信号增加。在一些实施方案中，探针多核苷酸是分子信标探针。简言之，分子信标探针由5’和3’端具有互补碱基的核苷酸序列构成，并且在不存在靶多核苷酸的情况下形成发夹结构。分子信标探针也包含在其3’端(或5’端)的淬灭剂及在其5’端(或3’端)的荧光标记，使得当靶多核苷酸不存在时不存在来自标记的可检出信号。分子信标探针还包含与靶多核苷酸互补的序列，使得在靶的存在下，探针与靶多核苷酸的杂交导致发夹结构解离和淬灭减少，从而产生可检出的突光信号。
[0143]具有两向接合点的引物组合和阻断剂多核苷酸也可组合用于实时PCR。在引物多核苷酸(即，“第一多核苷酸”)的5’端用荧光团进行标记，并在固定物多核苷酸(即，“第二多核苷酸”)的3’端用淬灭剂进行标记。阻断剂多核苷酸与紧靠第一靶多核苷酸区域的5’定位的靶多核苷酸区域互补(在图4中示出)。在一些实施方案中，阻断剂多核苷酸与第一多核苷酸的第一结构域重叠。换言之，第一多核苷酸3’端的一个(多个)核苷酸和阻断剂多核苷酸5’端的一个(多个)核苷酸将与祀多核苷酸的一个(多个)相同核苷酸互补。在相关实施方案中，第一多核苷酸3’端的一个(多个)核苷酸和阻断剂多核苷酸5’端的一个(多个)核苷酸不同。在这些实施方案中，当第一多核苷酸3’端的一个(多个)核苷酸与靶多核苷酸在一个(多个)适当的位置处互补时它将与靶多核苷酸杂交，从而允许第一多核苷酸在适当的条件下延伸`(参见图4a)。在PCR期间在引物多核苷酸延伸后，弓丨物多核苷酸与固定物多核苷酸将会在PCR的变性阶段期间分离，从而在荧光团与淬灭剂之间产生距离并导致可检测的荧光信号。在相关实施方案中，当阻断剂多核苷酸5’端的核苷酸与非靶多核苷酸在适当的位置处互补时，它将与非靶多核苷酸杂交，从而阻断第一多核苷酸的延伸。(参见图4b)。在这种构造中，当引物与固定物多核苷酸杂交时没有检测到荧光(因为荧光团邻近淬灭剂定位)。在各个实施方案中，对阻断剂多核苷酸3’端的核苷酸进行修饰以阻止聚合酶引起的延伸。这种系统允许以极高的敏感性和特异性检测例如单核苷酸多态性。
[0144]具有两向接合点的引物组合、阻断剂多核苷酸和探针多核苷酸也组合用于实时PCR。在相关实施方案中，这个组合中使用的第一多核苷酸在其3’端包含作为核苷酸的经修饰的核酸，并且阻断剂多核苷酸在其5’端包含作为核苷酸的经修饰的核酸。在一些实施方案中，经修饰核酸为锁核酸。
[0145]在一些方面，以上实施方案进一步包含反向引物多核苷酸。反向引物与由第一多核苷酸的延伸而创建的多核苷酸中的区域互补。参见图8。明显地，在一些实施方案中，当靶多核苷酸为双链多核苷酸的的一条链时，反向引物还与靶多核苷酸的互补链互补。反向引物的纳入允许靶多核苷酸的扩增。在各个方面，反向引物为“简单的”的引物，其中反向引物的序列经设计而在其整个长度上充分互补从而在引物的整个长度上与靶序列杂交。这种类型的简单引物在一方面与靶序列100%互补，然而，应理解，具有小于100%的互补性的简单引物在某些情况和条件下是有用的。
[0146]在其他方面，反向引物为独立的多核苷酸引物组合，其特异性地与由来自第一反应中使用的引物对组合中的第一多核苷酸第一结构域的多核苷酸延伸产生的序列中的区域结合。
[0147]在各个方面，本文所描述的方法提供了具有非靶多核苷酸的样本的序列检测与具有靶多核苷酸的样本的序列检测相比的变化。在一些方面，该变化为与具有非靶多核苷酸的样本的序列检测相比较，样本中的靶多核苷酸的检测增加。在一些方面，该变化为与具有非靶多核苷酸的样本的序列检测相比较，样本中的靶多核苷酸的检测减少。
[0148]由于本文所描述的多核苷酸的特异性增加，因此可在SYBR green染料的存在下进行实时PCR从而以大大降低的成本获得与使用TaqMan，分子信标探针或蝎形(Scorpion)引物获得的特异性相当的特异性。
[0149]在一个实施方案中，5 ’端用突光分子进行标记的引物多核苷酸(即第一多核苷酸”)和3’端用淬灭剂进行标记的第二淬灭多核苷酸(即，“通用淬灭剂多核苷酸”)都与固定物多核苷酸(即，“第二多核苷酸”)的第二结构域杂交，所述固定物多核苷酸在其3’端包含阻断基团以阻止DNA聚合酶引起的延伸。这种复合物在这种状态下无荧光，但是当在DNA聚合酶使引物多核苷酸延伸后复合物被置换(变性)时该复合物将发出荧光。
[0150]在另一个实施方案中，5’端包含突光团的引物多核苷酸(即，“第一多核苷酸”)与3’端包含淬灭剂的固定物多核苷酸(即，“第二多核苷酸”)杂交。复合物在杂交时无荧光，但是当由DNA聚合酶引起的引物多核苷酸的延伸后复合物被置换(变性)时该复合物将发出荧光。在所述方法的另一方面，使用两组多核苷酸组合执行多重实时PCR，其中在每个引物组中的一种多核苷酸用荧光团进行标记，并且两个荧光团可互相区别。
[0151]在另一个实施方案中，引物多核苷酸(即，“第一多核苷酸”)在其3’端包含荧光团、淬灭剂，并且这两种标记被一段RNA或RNA/DNA寡核苷酸(即，“探针多核苷酸”)隔开(参见图9)。在一些方面，探针多核苷酸进一步包含内部Zen淬灭剂。在一些方面，在RNA/DNA杂交体产生并被热稳定的RNA酶H降解并且游离荧光团(或淬灭剂)释放到溶液中后，产生突光信号。
[0152]图9A示出具有非特异性RNA接头的荧光团-淬灭剂标记的第一多核苷酸(引物A)和典型第二多核苷酸(固定物A)。在某些实施方案中,第一多核苷酸(P)包含5’标记，其后面是RNA序列，然后是淬灭剂，然后是本文所描述的第一多核苷酸(P)特有的序列。在其他实施方案中，第一多核苷酸(P)包含5’淬灭剂，其后面是RNA序列，然后是标记，然后是本文所描述的第一多核苷酸(P)特有的序列。图9B示出图9A中所示的组合在PCR中的使用。当产生与P相反的链时，RNA-DNA杂交体被RNA酶H切割释放荧光团(或淬灭剂，并检测突光信号。
[0153]图9C示出具有位点特异性RNA-DNA接头的荧光团-淬灭剂标记的第一多核苷酸(引物A)和典型的第二多核苷酸(固定物A)。在某些实施方案中，第一多核苷酸(P)包含5’标记，其后面是与P下游序列互补的RNA序列，然后是淬灭剂，然后是本文所描述的第一多核苷酸(P)特有的序列。在某些实施方案中，第一多核苷酸(P)包含5’淬灭剂，其后面是与P下游序列互补的RNA序列，然后是标记，然后是本文所描述的第一多核苷酸(P)特有的序列。图9D示出图9C中所示的组合在PCR中的使用。当包含引物A的PCR产物被变性时，RNA-DNA接头与引物A下游的区域杂交，RNA酶H切割RNA-DNA杂交体并释放出荧光团，并检测荧光信号。
[0154]在一些实施方案中，一种固定物多核苷酸(即，“第二多核苷酸”)可与2、3、4、5或更多种引物多核苷酸(即，“第一多核苷酸”)结合使用，以便在一个实时PCR测定中同时多重检测数个突变。
[0155]在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含例如，包装说明书、一组四种荧光标记的通用多核苷酸分子、3’端包含淬灭剂的通用多核苷酸分子，及具有用于装配荧光标记的引物多核苷酸的合适缓冲液的DNA连接酶。该试剂盒任选地进一步包含T4多核苷酸激酶和合适的缓冲液。
[0156]该试剂盒用于通过连接来突光标记多核苷酸。在一个实施方案中，用T4多核苷酸激酶对引物多核苷酸进行磷酸化，并随后使其与固定物多核苷酸杂交。同样使5’端包含荧光团的第三多核苷酸(即，荧光标记的通用多核苷酸，见上文)与固定物多核苷酸杂交。然后使第三多核苷酸的3’端连接至引物多核苷酸的磷酸化5’端，从而产生荧光标记的引物多核苷酸。最后，使3 ’端包含淬灭剂的通用多核苷酸与固定物多核苷酸杂交，从而产生多核苷酸复合物，其无突光并且待用于例如实时PCR分析。
[0157]E.引物延伸
[0158]本文所公开的引物组合物可用在需要或利用引物延伸的任何方法中。例如，引物延伸可用于确定已知基因的RNA转录的起始位点。这种技术需要与该基因3’端附近的区域互补的如本文所描述的标记的引物多核苷酸组合(通常长度为20-50个核苷酸)。使多核苷酸组合与RNA退火，并使用逆转录酶合成RNA的互补(cDNA)直至它到达RNA的5’端。通过分析聚丙烯酰胺凝胶上的产物，可以确定转录起始位点，因为凝胶上序列的长度代表从起始位点到标记的引物之间的距离。
[0159]本文所描述的先进多核苷酸技术将克服并分解在RNA中遇到的潜在二级结构。
[0160]F.等温DNA扩增
[0161]可如美国专利7，579，153中教导的那样使用本文所描述的先进多核苷酸技术执行等温DNA扩增。简单地说，等温DNA扩增包括下列步骤:(i)提供一端具有发夹、另一端具有多核苷酸，并且具有设置在这两端之间的启动子序列的双链DNA，所述启动子序列的取向使得由识别启动子序列的RNA聚合酶进行的合成在发夹方向进行；(ii)用识别启动子序列的RNA聚合酶转录双链DNA以形成包含启动子序列和多核苷酸的拷贝的RNA转录本；(iii)从RNA转录本生成互补DNA ； (iv)将RNA转录本的5'端从互补DNA上置换掉，使得重新构成发夹；以及(V)延伸发夹从而生成含有重新构成的启动子序列的双链DNA，RNA聚合酶识别重新构成的序列并合成RNA转录本。在优选的实施方案中，生成步骤包括形成所述互补DNA和所述RNA转录本的异源双链体，并且其中所述置换步骤包括用解旋酶处理异源双链体。[0162]G.荧光原位杂交(FISH)
[0163]本文所描述的先进多核苷酸技术也可用于实践FISH。FISH是用于检测并定位染色体上特异性DNA序列的存在或不存在的细胞遗传学技术。FISH使用的荧光探针仅与染色体的那些与它们表现出高度的序列相似性的部分结合。荧光显微术可用于找出荧光探针与染色体是在哪里结合的。FISH经常用来找出用于遗传咨询、医学和物种鉴定的DNA的具体特征。FISH也可用来检测和定位组织样本中的特定mRNA。在这种情况下，它可帮助定义细胞和组织内的基因表达的时空模式(spatial-temporal pattern)。
[0164]H.连接探针
[0165]本文所描述的先进多核苷酸技术也可用于使用连接探针实践多重PCR。连接探针方法是本领域技术人员已知的。简单地说，连接探针由两种独立的寡核苷酸组成，每种均含有PCR引物序列。只有当这两个半探针都与它们的它们可连接的邻近靶杂交时，它们才可以被连接。只有连接的探针将会在PCR中呈指数式地扩增。探针连接产物的数量因此取决于样本中靶序列的数量。
[0166]在一些实施方案中，两个连接探针间隔约I至约500个核苷酸，并且在连接之前，第一探针被缺乏链置换活性的DNA热稳定聚合酶延伸。缺乏链置换活性的DNA热稳定聚合酶包括但不限于，Pfu聚合酶。当延伸的链到达第二连接探针的5’ -磷酸基团时，聚合停止并且产生切口。这个切口可被反应混合物中存在的热稳定连接酶密封，从而允许整个反应以单一反应形式进行。
[0167]1.下一代测序(NGS)
[0168]本发明的多核苷酸组合也可用在NGS应用中。代替通过DNA探针的顺序连接进行测序，可将本文所公开的引物组合用在没有连接的顺序杂交中，如图15中所示。对于NGS技术的回顾，参见Morozova等人，Genomics92 (5):255-64, 2008，其全文以引用的方式并入本文。NGS容易被本领域普通技术`人员理解和实践，并且例示在如下文实施例2中陈述的一个实施方案中。
[0169]J.特异性序列检测
[0170]本文所公开的多核苷酸组合也可用来检测、评估和管理包括但不限于突变和癌症的各种疾病状态。在各个实施方案中，提供了用于检测受试者中的一个或多个基因座的方法。可使用本公开的多核苷酸组合检测的突变类型包括但不限于碱基取代、插入/缺失(indel)、扩增、重排(倒置/易位)、体细胞突变、种系突变、内源突变、外源(包括但不限于宿主样本中的病原体特异性的(病毒、细菌、真菌、原生动物、昆虫)和/或母体样本中胎儿特异性的)突变、非编码(包括但不限于调节序列，例如启动子和/或增强子)的突变。
[0171]感兴趣的基因座包括但不限于v-K1-raS2KirSten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)、KRAS密码子12、KRAS密码子13、NRAS、v_raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物BI (BRAF)、表皮生长因子受体(EGFR)、PIK3CA、TP53、BCR-ABL、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、KIT、血小板衍生生长因子受体、α多肽0^6?狀)、把皿8激酶2(从1(2)、连环蛋白(钙粘着蛋白相关蛋白)β I (CTNNBl)、ALK 及 AKT。
[0172]可使用本公开的多核苷酸组合检测的具体的KRAS突变包括而不限于，G12V、G12D、G12R、G12S、G13D、G12C和G12A。可使用本公开的多核苷酸组合检测的具体的BRAF突变包括而不限于V600E/K。[0173]本公开的多核苷酸组合可用于利用大量模板的突变检测测定，所述模板包括但不限于宿主中的基因组DNA、线粒体DNA、mRNA、小RNA、微小RNA、游离循环核酸及外源RNA或DNA。
[0174]在一些实施方案中，本公开的多核苷酸组合用于检测指示特异性(indication-specific) RNA。此类RNA的实例包括但不限于HER2、EGFR>细胞角蛋白19(CK19)、CD24、CD44、NOTCHU TWIST1、乳腺珠蛋白(MGBl)、胆色素原脱氨酶(PB⑶)、激肽释放酶2/3 (KLK2/3)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、小RNA、微小RNA和病原体特异性RNA。
[0175]在进一步的实施方案中，本公开的多核苷酸组合用于检测指示特异性DNA。此类DNA的实例包括但不限于物种特异性DNA、菌株特异性DNA、病原体特异性DNA和个人识别特异性(personal identification-specific) DNA。在另一方面,本公开的多核苷酸组合用于检测指示特异性DNA甲基化状态，其在一些方面由非甲基-C到T的重亚硫酸盐转化衡量。
[0176]考虑使用从受试者获取的生物样本进行研究型或临床诊断性质的测定。适合于使用的生物样本包括而不限于，新鲜、冷冻或固定的身体组织；肿瘤、活检样本、淋巴结样本、骨髓样本、全血样本(新鲜或保存/干燥)、血清或血浆样本(新鲜或保存/干燥)、循环肿瘤细胞(CTC)样本、循环蛋白质样本、无循环细胞的核酸样本、尿液样本、痰液样本、颊拭子样本、环境拭子样本、商业/农业样本及唾液样本。 [0177]X.酶
[0178]在任何所述方法的一些方面，延伸由能够合成实时量化的核酸的酶执行。可用在本发明的实践中的酶包括但不限于，DNA聚合酶(其可包括热稳定DNA聚合酶，例如，Taq DNA聚合酶)、RNA聚合酶和逆转录酶。可用于实践本发明的酶的非-限制性实例包括但不限于，Deep VentR?DNA聚合酶、LongAmp?Taq DNA聚合酶、Phusion?高保真DNA聚合酶、Phusion?Hot Start 高保真 DNA 聚合酶、VentR? DNA 聚合酶、DyNAzyme?II HotStart DNA 聚合酶、Phire?Hot Start DNA 聚合酶、Phusion?Hot Start 高保真 DNA 聚合酶、Crimson LongAmp?Taq DNA 聚合酶、DyNAzyme?EXT DNA 聚合酶、LongAmp?Taq DNA 聚合酶、Phusion?高保真DNA聚合酶、Phusion?Hot Start高保真DNA聚合酶、配有标准Taq (不含Mg)缓冲液的Taq DNA聚合酶、配有标准Taq缓冲液的Taq DNA聚合酶、配有ThermoPol
II(不含Mg)缓冲液的Taq DNA聚合酶、配有ThermoPol缓冲液的Taq DNA聚合酶、CrimsonTaq?DNA聚合酶、配有(不含Mg)缓冲液的Crimson Taq?DNA聚合酶、Phire?Hot StartDNA聚合酶、Phusion?高保真DNA聚合酶、VentR? DNA聚合酶、VentR? (外切)DNA聚合酶、Phire?Hot Start DNA 聚合酶、Phusion? 高保真 DNA 聚合酶、Phusion?Hot Start 高保真 DNA 聚合酶、Hemo KlenTaq?、Deep VentR?(外切)DNA 聚合酶、De印 VentR?DNA 聚合酶、DyNAzyme?EXT DNA 聚合酶、Hemo KlenTaq?、LongAmp?Taq DNA 聚合酶、Phusion? 高
保真 DNA 聚合酶、ProtoScript? AMV 第一链 cDNA 合成试剂盒、ProtoScript? M-MuLV 第
一链cDNA合成试剂盒、Bst DNA聚合酶、全长Bst DNA聚合酶大片段、配有ThermoPol缓冲液的Taq DNA聚合酶、9° Nm DNA聚合酶、Crimson Taq?DNA聚合酶、配有(不含Mg)缓冲液的 Crimson Taq?DNA 聚合酶、Deep VentR?(外切)DNA 聚合酶、Deep VentR?DNA 聚合酶、DyNAzyme?EXT DNA 聚合酶、DyNAzyme?II Hot Start DNA 聚合酶、Hemo KlenTaq?、Phusion? 高保真 DNA 聚合酶、Phusion?Hot Start 高保真 DNA 聚合酶、Sulfolobus DNA 聚合酶 IV、Therminator? Y DNA 聚合酶、Therminator?DNA 聚合酶、Therminator?II DNA 聚合酶、TherminatorTMIII DNA 聚合酶、VentR? DNA 聚合酶、VentR? (外切)DNA 聚合酶、BsuDNA聚合酶大片段、DNA聚合酶I (大肠杆菌)、DNA聚合酶1、大(Klenow)片段、Klenow片段(3' — 5'外切-)、phi29DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶(未经修饰)、末端转移酶、逆转录酶和RNA聚合酶、大肠杆菌多聚腺苷酸聚合酶、AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶、phi6RNA聚合酶(RdRP)、多聚鸟苷酸聚合酶、SP6RNA聚合酶及T7RNA聚合酶。
[0179]X1.标记
[0180]在一些方面，第一多核苷酸包含标记。在其他方面，本文描述的方法中使用的任何多核苷酸均包含标记。在这些方面的一些中，标记为突光的。用突光分子标记寡核苷酸的方法和测量荧光的方法在本领域中是熟知的。可用在本发明的实践中的荧光标记包括但不限于，I, 8-ANS (1-苯胺基萘-8-磺酸)、1-苯胺基萘-8-磺酸(1，8-ANS)、5_ (和-6)-羧基-2’，7’ - 二氯荧光素(ρΗ9.0)、5-FAM(pH9.0)、56_FAM、5_R0X(5-羧基-X-罗丹明、三乙基铵盐)、5-R0X(pH7.0)、5-TAMRA、5-TAMRA(pH7.0)、5-TAMRA_Me0H、6J0E、6，8- 二氟-7-羟基-4-甲基香豆素(pH9.0)、6-羧基罗丹明6G(pH7.0)、6-羧基罗丹明6G、盐酸化物、
6-HEX、SE (pH9.0)、6_TET、SE (pH9.0)、7_ 氨基-4-甲基香豆素(ρΗ7.0)、7_ 羟基-4-甲基香?素、7_ 羟基-4-甲基香?素(ρΗ9.0)、Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa Fluor430 抗体缀合物(pH7.2)、Alexa Fluor488 抗体缀合物(pH8.0)、Alexa Fluor488 酸餅-水、Alexa Fluor532 抗体缀合物(ρΗ7.2)、Alexa Fluor555 抗体缀合物(ρΗ7.2)、Alexa Fluor568 抗体缀合物(ρΗ7.2)、Alexa Fluor610R-藻红蛋白链霉亲和素(pH7.2)、Alexa Fluor647 抗体缀合物(pH7.2)、Alexa Fluor647R-藻红蛋白链霉亲和素(pH7.2)、Alexa Fluor660抗体缀合物(pH7.2)、Alexa Fluor680抗体缀合物(ρΗ7.2)、Alexa Fluor700抗体缀合物(ρΗ7.2)、别藻蓝蛋白(ρΗ7.5)、AMCA缀合物、氨基香豆素、APC(别藻蓝蛋白)、Atto647、BCECF(pH5.5)、BCECF(pH9.0)、BFP (蓝色荧光蛋白)、B0-PR0-1-DNA、B0-PR0-3-DNA、BOBO-1-DNA, B0B0-3-DNA、B0DIPY650/665-X、MeOH,BODIPY FL 缀合物、BODIPY FL、MeOH, Bodipy R6G SE、BODIPY R6G、MeOH, B0DIPYTMR-X 抗体缀合物(pH7.2)、Bodipy TMR-X 缀合物、BODIPY TMR-X、MeOH、BODIPY TMR-X、SE、BODIPYTR-X 类鬼笔环肽(ρΗ7.0)、BODIPY TR-X, MeOH、BODIPY TR-X, SE、BOPRO-U B0PR0-3、钙黄绿素、1丐黄绿素(ρΗ9.0)、|丐深红(Calcium Crimson)、钙深红 Ca2+、钙绿(Calcium Green)、钙绿-lCa2+、钙橙(Calcium Orange)、钙橙Ca2+、羧基萘并荧光素(ρΗ10.0)、级联蓝(Cascade Blue)、级联蓝BSA (pH7.0)、级联黄、级联黄抗体缀合物(pH8.0)、CFDA, CFP (青色荧光蛋白)、C1-NERF(pH2.5)、C1-NERF(pH6.0)、柠檬黄、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、CyQUANT GR-DNA、丹酰尸胺、丹酰尸胺、MeOH、DAP1、DAP 1-DNA, Dapoxyl (2-氨基乙基)磺酰胺、DDAO(pH9.0)、二 -8ANEPPS、二 -8-ANEPPS-脂质、DiI, DiO, DM-NERF(pH4.0)、DM-NERF (pH7.0)、DsRecU DTAF, dTomato、eCFP (增强的青色荧光蛋白)、eGFP (增强的绿色荧光蛋白)、伊红(Eosin)、伊红抗体缀合物(pH8.0)、赤藓红_5_异硫氰酸酯(pH9.0)、溴化乙锭、乙锭均二聚物、乙锭均二聚物-1-DNA、eYFP(增强的黄色荧光蛋白)、FDA、FITC、FITC 抗体缀合物(ρΗ8.0)、FlAsH, Fluo-3、Fluo_3Ca2+、Fluo-4、Fluor-Ruby、荧光素、荧光素0.1M NaOH、突光素抗体缀合物(pH8.0)、突光素葡聚糖(pH8.0)、突光素(pH9.0)、Fluoro-EmeralcU FM1-43、FM1-43 脂质、FM4-64、FM4_64、2%CHAPS、Fura Red Ca2+、FuraRed、高 Ca、Fura Red、低 Ca、Fura_2Ca2+、Fura-2、高 Ca、Fura-2、无 Ca、GFP (S65T)、HcRecUHoechst33258、Hoechst33258_DNA、Hoechst33342、Indo_lCa2+、Indo-l> 无 Ca、Indo-l>Ca 饱和、JC-1 > JC-1 (ρΗ8.2)、_ 丝胺罗丹明(Lissamine rhodamine)、LOLO-1-DNA、突光黄(Lucifer Yellow)、CH、LysoSensor Blue、LysoSensor Blue (pH5.0) > LysoSensor Green、LysoSensor Green(pH5.0)、LysoSensor Yellow(pH3.0)、LysoSensor Yellow(pH9.0)、LysoTracker Blue>LysoTracker Green>LysoTracker Red、续绿(Magnesium Green)、续绿Mg2+、续澄(Magnesium Orange)、MarinaBlue、mBanana、mCherry、mHoneydew、MitoTrackerGreen、MitoTracker Green FM、MeOH、MitoTracker Orange、MitoTracker Orange、MeOH、MitoTracker Red、MitoTracker Red、MeOH、mOrange、mPlum、mRFP、mStrawberry、mTangerine、NBD-X, NBD-X, MeOH、NeuroTrace500/525、绿色荧光 Nissl 染色的 RNA、NileBlue、EtOH、Nile Red、Nile Red-脂质、Nissl、Oregon Green488、Oregon Green488 抗体缀合物(ρΗ8.0)、Oregon Green514、Oregon Green514 抗体缀合物(ρΗ8.0)、PacificBlue、Pacific Blue 抗体缀合物(ρΗ8.0)、藻红蛋白、PO-PRO-l、PO-PRO-1-DNA, PO-PRO-3、P0-PR0-3-DNA、POPO-1、POPO-1-DNA、POPO-3、碘化丙啶、碘化丙啶-DNA、R-藻红蛋白(pH7.5)、ReAsH,试卤灵(Resorufin)、试卤灵(ρΗ9.0)、Rhod-2、Rhod_2Ca2+、罗丹明、罗丹明110、罗丹明110(pH7.0)、罗丹明123、MeOH、罗丹明绿、罗丹明鬼笔环肽(pH7.0)、罗丹明红-X抗体缀合物(pH8.0)、罗丹明绿(pH7.0)、Rhodol绿抗体缀合物(pH8.0)、Sapphire、SBF1-Na+、钠绿(Sodium Green)Na+、横基罗丹明 101、SYBR Green 1、SYPRORuby、SYT013-DNA、SYT045-DNA、SYTOX Blue-DNA、四甲基罗丹明抗体缀合物(pH8.0)、四甲基罗丹明葡聚糖(PH7.0)、德克萨斯(Texas)红-X抗体缀合物(pH7.2)、TO-PRO-1-DNA、T0-PR0-3-DNA、TOTO-l-DNA、T0T0-3-DNA、TRITC、X-Rhod_lCa2 +、YO-PRO-卜DNA、Y0-PR0-3-DNA、YOYO-1-DNA 及 Y0Y0-3-DNA。
[0181]可使用除 荧光分子以外的其他标记，例如将会在杂交后产生可检测信号或可检测信号变化的化学发光分子，及放射性分子。
[0182]在一些实施方案中，第二多核苷酸包含减弱标记的突光信号的淬灭剂。在其他实施方案中，第四多核苷酸包含减弱标记的荧光信号的淬灭剂。考虑用在本发明方法的实践中的淬灭剂包括但不限于BlackHole QuencherKBlack Hole Quencher-2>1wa Black FQ、1wa BlackRQ、Zen 淬灭剂及 Dabcyl.G-base?
[0183]XI1.经修饰多核苷酸组合
[0184]具有经修饰性质的部分双链引物组合可:(1)由两种多核苷酸，例如基础引物多核苷酸和基础固定物多核苷酸形成；(2)由两种多核苷酸，例如经修饰的引物多核苷酸和基础固定物多核苷酸形成；(3)由两种多核苷酸，例如经修饰的引物多核苷酸和经修饰的固定物多核苷酸形成；(4)由三种多核苷酸，例如基础引物多核苷酸、基础固定物多核苷酸和反引物多核苷酸形成；(5)由三种多核苷酸，例如经修饰的引物多核苷酸、基础固定物多核苷酸和反引物多核苷酸形成。
[0185]部分双链多核苷酸可仅通过它的位于多核苷酸的线性部分内或位于环区域内的单链区域来启动与基因组DNA的杂交。
[0186]多核苷酸的单链区域内的不完全序列互补性(包括单个核苷酸错配)通过减慢杂交的启动而显著降低杂交的效率。
[0187]多核苷酸的双链区域内的不完全序列互补性将会干扰链置换杂交及多核苷酸与模板多核苷酸的结合。
[0188]与基础多核苷酸相比对模板多核苷酸序列的变化更敏感的经修饰的多核苷酸可用于更具特异性的基于PCR的诊断测定的开发及用于例如癌症组织中的罕见DNA突变的更敏感的PCR检测。
[0189]图11 (方案11)示出利用基础引物和固定物多核苷酸与非共价连接的反引物(AP)的三个实例。
[0190]在另一个实施方案中，多核苷酸可利用基础引物多核苷酸("PO")和经修饰的固定物多核苷酸结构("Fl至F4")构建(参见图12 ;方案12)。经修饰的固定物在左侧示出，其中完整的多核苷酸组合(基础引物和经修饰的固定物多核苷酸)在右侧示出。
[0191]当与模板多核苷酸结合时，包含茎环结构的经修饰多核苷酸组合(I至4，方案12)可用来提供增加的特异性水平。在这些方面，单链区域(例如，在茎环结构中)与模板多核苷酸杂交。这种杂交，如果在序列上100%互补，将有效地置换到固定物多核苷酸的完全互补的茎部分中。在相关方面，引物多核苷酸然后可与完全杂交的固定物多核苷酸杂交。经修饰的固定物多核苷酸的单链环或双链茎区域内的任何突变都将降低它的杂交效率，并因而降低多核苷酸组合的引发效率。在另一个实施方案中，多核苷酸组合可用经修饰的引物多核苷酸("P1")和基础固定物多核苷酸("F")构建(参见图13a ;方案13)。在方案13中，经修饰的引物多 核苷酸在左侧示出，其中完整的多核苷酸组合(经修饰的引物多核苷酸和基础固定物多核苷酸)在右侧示出。在这个实施方案中，单链DNA接头(由例如多聚dT构成)应当具有足以允许引物I的5’节段与它的3’节段杂交的长度。
[0192]在另一个实施方案中，多核苷酸组合可用经修饰的引物多核苷酸(引物1，Pl)和经修饰的固定物多核苷酸构建(参见方案14)。图13b (方案14)中示出两个此类实例，其被示出具有来自图12 (方案12)的经修饰的固定物多核苷酸Fl和F4。
[0193]在另一个实施方案中，具有经修饰的引物结构的多核苷酸组合进一步包含非共价连接的反引物。在一方面，可形成包含经修饰的引物多核苷酸、基础固定物多核苷酸和反引物的多核苷酸组合。在各个方面，可使反引物与多核苷酸组合的不同区域杂交(参见图13c ;方案 15)。
[0194]反引物多核苷酸起到的作用是进一步增加固定物多核苷酸的第一结构域与模板多核苷酸的结合的特异性。这里，仅100%互补的模板多核苷酸区域将与被反引物掩盖的短多核苷酸区域有效地杂交。因为固定物多核苷酸的第一结构域与模板多核苷酸杂交，因此如果模板区域与固定物多核苷酸100%互补，那么它将置换反引物。这与单独的固定物多核苷酸相比提供了额外水平的特异性。
[0195]本文全文中引用的参考文献全部以引用的方式具体地并入本文，并入程度为它们为本文所陈述的内容提供示例性程序或其他细节的补充。
实施例
[0196]本领域技术人员将会理解，当引物或引物组合被称为处于“正向”或“反向”定向时，这些命名是在描述PCR反应和引物与模板的结构关系时使用的任意约定。因而，如对于本领域技术人员而言明显的，通过翻转PCR示意图180°来重新定向PCR示意图将导致“正向”引物变成“反向”引物，且“反向”引物变成“正向”引物“，并且因此，例如，一种引物组合被命名成正向引物或反向引物，这不是对所述特定引物组合的结构或使用的限制。
[0197]实施例1
[0198]使用本发明多核苷酸组合的基础单个碱基突变检测PCR.在它的大多数基本形式中的一种中，PCR使用两个多核苷酸组合执行。一个多核苷酸组合为“正向”复合物，另一个为“反向”复合物。每个多核苷酸组合均由两种多核苷酸，即引物和固定物构成。引物和固定物多核苷酸能够彼此之间以及与模板DNA多核苷酸杂交，如方案2(图2)中所示。
[0199]在突变检测的情况下，正向和/或反向引物多核苷酸含有能够区分靶DNA多核苷酸中的突变与野生型序列的序列。如果引物多核苷酸序列是针对野生型序列，那么引物多核苷酸将仅与野生型模板有效地结合，反之亦然。这个结果是因为突变序列与野生型序列仅有单个碱基位置不同，而本文描述的多核苷酸组合的方面为与模板多核苷酸杂交的引物多核苷酸的第一结构域短(5至30个核苷酸)。这个长度允许鉴别突变与野生型序列，因为如果存在错配，引物寡核苷酸结合将是不稳定的并且因而不能引发DNA合成。
[0200]第一步为将试剂装配在反应容器中。试剂包含正向和反向多核苷酸组合复合物、模板DNA多核苷酸、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷酸底物和合适的缓冲液。根据本领域中熟知的方法，使用本领域技术人员容易确定的优化条件执行PCR。
[0201]根据引物多核苷酸是如何设计的(即，是否它们被设计用于检测突变或野生型等位基因)，由此产生的PCR产物提供有关样本是否含有突变或野生型等位基团(或二者)的信息。
[0202]图14(方案16)示出两种情况。在顶部的情况下，引物多核苷酸的第一结构域与模板DNA多核苷酸100%互补，并且延伸发生，产生产物。
[0203]在底部的情况下，引物多核苷酸的第一结构域含有相对于模板DNA多核苷酸的错配，并且由于引物多核苷酸的短第一结构域不稳定，延伸被阻断。这种不稳定性将导致PCR的效率非常低，并且将产生非常少或没有可检出的产物。
[0204]实施例2
[0205]下一代测序.在不使用探针连接或聚合酶延伸的情况下使用多核苷酸组合执行下一代测序(NGS)(图15 ;方案17)。
[0206]首先,使第一固定物多核苷酸及四种突光标记的多核苷酸的混合物与多核苷酸模板杂交。然后洗涤具有结合的多核苷酸的模板，并读取信号。
[0207]接下来，切割荧光标记，并再次洗涤混合物。然后，使四种荧光标记的多核苷酸的混合物与模板多核苷酸杂交，洗涤混合物并再次读取信号。
[0208]重复前两个步骤直至到达模板的终点。然后将第一固定物多核苷酸和所有杂交的多核苷酸从模板多核苷酸上剥离。在这个步骤之后是和与第一固定物多核苷酸上游的单个碱基杂交的第二固定物多核苷酸杂交。
[0209]如前面一样， 使四种荧光标记的多核苷酸的混合物与模板多核苷酸杂交，洗涤混合物，并读取信号。然后切割荧光标记，洗涤混合物，并再次让这四种荧光标记的多核苷酸杂交。然后洗涤混合物并读取信号。
[0210]重复这些步骤，直至到达模板多核苷酸的终点。以这种方式，在不使用DNA聚合酶的情况下获得DNA序列。
[0211]实施例3
[0212]在存在染色染料SYT09的情况下的定量PCR
[0213]材料:
[0214]底物:λDNA New England Biolabs#N3011S
[0215]P10-35(SEQ ID NO:4)(即，“第一多核苷酸”)
[0216]F10-23(SEQ ID NO:3)(即，“第二多核苷酸”)
[0217]正向引物10_15(SEQ ID NO:1)
[0218]反向引物10_17(SEQ ID NO:2)
[0219]Taq DNA 聚合酶 New England Biolabs#M0320L
[0220]Taq DNA 聚合酶缓冲液:10mM Tris-HCl, 50mM KCl pH8.3i25°C
[0221]dNTP:Invitrogen#10297018
[0222]SYTO? 9 绿色荧光核酸染剂 Invitrogen#S34854
[0223]方法:
[0224]一式三份地在25 μ I体积的等分`试样中进行扩增。
[0225]正常扩增反应液由以下组成:12.5μ 12x Taq DNA聚合酶缓冲液、3mM MgCl2、200nM常规正向引物 10-15 (SEQ ID NO:1)、常规反向引物 10-17 (SEQ ID NO: 2)、200 μ M dNTP、I 单位的Taq聚合酶、0.1ng λ DNA和2uM SYTO? 9。在BioRad CFX96实时系统中使用以下热循环分布进行扩增:94°C下2分钟的I个循环，接着是94°C下15秒及66°C下I分钟20秒的50个循环。
[0226]引物组合P10-35和F10-23扩增混合物由以下组成:12.5 μ 12x TaqDNA聚合酶缓冲液、3mM MgCl2、200nM 常规正向引物 10-15 (SEQ ID N0:l)、200nM P10_35(SEQ ID NO: 4)、400 μ M F10-23(SEQ ID NO: 3),200 μ M dNTP、I 单位的 Taq 聚合酶、0.1ng λ DNA 和 2uMSYTOli 9。扩增参数与正常引物扩增的参数相同。
[0227]结果:
[0228]用两种常规引物，10-15 (SEQ ID NO:1)和10-17 (SEQ ID NO: 2)的反应，及用正向常规引物 10-15 (SEQ ID N0:1)、P10-35(SEQ ID NO:4)和 F10_23(SEQ ID NO:3)的反应的平均扩增曲线在图16中示出。该结果表明，含有P10-35/F10-23对的测定与含有常规引物的测定表现得一样好。
[0229]实施例4
[0230]用荧光体标记的引物组合和淬灭剂标记的固定物的定量PCR测定
[0231]材料:
[0232]底物:λDNA New England Biolabs#N3011S
[0233]5’ -荧光素-标记的P10_74(SEQ ID NO: 10)(即，“包含标记的第一多核苷酸”)
[0234]3’ -1owa Black淬灭剂-标记的F10-73 (SEQ ID NO: 9)(即，“包含淬灭剂的第二多核苷酸”)
[0235]正向引物10_15(SEQ ID NO:1)
[0236]Taq DNA 聚合酶 New England Biolabs#M0320L
[0237]Taq DNA 聚合酶缓冲液:10mM Tris-HCl, 50mM KCl pH8.3i25°C[0238]Vent (外切)DNA 聚合酶 New England Biolabs#M0257L
[0239]dNTP:Invitrogen#10297018
[0240]方法:
[0241]用P10-74的扩增反应含有12.5μ 12x Taq DNA聚合酶缓冲液、3mM MgCl2、200nM常规正向引物 10-15 (SEQ ID N0:l)、200nMP10-74(SEQ ID NO: 10)，和 400nM F10_73(SEQID N0:9)、200yMdNTP、l 单位的 Taq 聚合酶和 0.1ngXDNA。在 BioRad CFX96 实时系统中使用以下热循环分布进行扩增:94°C下2分钟的1个循环，接着是94°C下15秒及66°C下1分钟20秒的50个循环以及60°C下10秒的“读取”循环。还给一些反应提供了 0.2单位的Vent (外切)聚合酶。
[0242]结果:
[0243]扩增实时PCR曲线在图17中示出。用荧光体标记的P10-74的测定产生相当强的信号，通过添加Vent (外切)聚合酶该信号略有增强。
[0244]结论: [0245]用分别具有标记和淬灭剂的P10-74/F10-73对的qPCR测定代表了一种用于诊断应用的新工具。
[0246]实施例5
[0247]用荧光体标记的弓|物组合和通用淬灭剂的qPCR测定
[0248]材料:
[0249]底物:λDNA New England Biolabs#N3011S
[0250]具有3’荧光团-标记和受保护的键的P10_104(SEQ ID NO: 13)(即，“包含标记的
第一多核苷酸”)，
[0251]F10-79(SEQ ID NO: 11)(即，“第二多核苷酸”)，
[0252]淬灭剂寡核苷酸10-80 (SEQ ID NO: 12)(即，“通用淬灭剂多核苷酸”)，
[0253]正向引物10-15 (SEQ ID N0:1),
[0254]Taq DNA 聚合酶 New England Biolabs#M0320L
[0255]Taq DNA 聚合酶缓冲液:10mM Tris-HCl, 50mM KC1 pH8.3i25°C
[0256]Vent (外切)DNA 聚合酶 New England Biolabs#M0257L
[0257]dNTP:Invitrogen#10297018
[0258]方法:
[0259]一式三份地用25 μ 1体积的等分试样进行扩增，所述等分试样含有12.5 μ 12xTaqDNA 聚合酶缓冲液、3mM MgCl2、200nM 常规正向引物 10_15(SEQ ID N0:l)、200nMP10-104(SEQ ID NO:13)、400nMF10_79(SEQ ID NO:11)、600nM 淬灭剂 10-80(SEQ IDNO: 12),200 μ M dNTP、1 单位的 Taq 聚合酶和 0.lng λ DNA。在 BioRad CFX96 实时系统中使用以下热循环分布进行扩增:94°C下2分钟的1个循环，接着是94°C下15秒及66°C下1分钟20秒的50个循环以及60°C下10秒的“读取”循环。还给一些反应提供0.2单位的Vent (外切)聚合酶。
[0260]结果:
[0261]平均扩增实时PCR曲线在图18中示出。用荧光体标记的P10-104和通用淬灭剂寡核苷酸10-80的测定产生强信号，通过添加Vent (外切)聚合酶时该信号显著增强。[0262]结论:
[0263]用荧光体标记的P10-104和通用淬灭剂的qPCR测定代表一种用于诊断应用的新qPCR工具。因为通用淬灭剂分子的使用，所以设计多个测定的费用比实施例4中描述的方法的费用低。
[0264]实施例6
[0265]用SybrGreen染料的KRAS G12V突变测定.[0266]材料:
[0267]0.1x TE 缓冲液:10mM Tris, 0.1mM EDTA pH=8.0
[0268]基因组DNA 分离试剂盒:Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit#69504
[0269]野生型人基因组DNA模板:Promega人基因组DNA#G1471
[0270]突变模板:从新收获的SW480结肠直肠腺癌细胞(ATCC#CCL_228)分离的(G12V)基因组DNA
[0271]寡核苷酸:
[0272]Kras 常规正向引物 10-53 (SEQ ID NO: 6),
[0273]kras G12V 常规反向引物 10-48 (SEQ ID NO: 5),
[0274]kras P10_56(SEQ ID NO:8)(即，“第一多核苷酸”)，
[0275]kras F10_54(SEQ ID NO:7)(即，“第二多核苷酸”)，
[0276]实时SYBR Green q`PCR 混合物:BioRad IQ SYBR Green Supermix#170-8882
[0277]方法:
[0278]基因组DNA分离:使用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit根据制造商方案从新收获的SW480细胞中分离Kras G12V人基因组DNA，将其以IOOng/μ I的浓度重悬在0.1x TE缓冲液中，进行等分并在使用前储存在_20°C。
[0279]模板制备:为了产生用于实时PCR反应的基因组DNA模板，在Promega WT基因组DNA中掺入指定量的kras G12V基因组DNA，使得突变kras拷贝的数目在每50ng总DNAl至14，000个拷贝之间变化，然后将模板DNA等分并在使用前储存在_20°C。
[0280]实时扩增反应:使用BioRad CFX96实时系统一式三份地在25 μ I等分试样中进行扩增，所述等分试样由以下组成:12.5 μ 12x BioRad IQ SYBR Green Supermix、200nM正向引物10-53(SEQ ID NO: 6)、用于常规PCR反应的200nM常规反向引物10-48 (SEQ ID NO:5)或用于引物组合扩增反应的 200nM kras P10_56(SEQ ID NO:8)和 400nM krasF10-54(SEQID NO: 7)，及50ng模板DNA。使用以下热循环分布进行扩增:94°C下3分钟的I个循环，接着是94°C下15秒及66°C下I分钟20秒的60个循环。
[0281]结果:
[0282]含有50% (7，000个突变DNA拷贝)、10% (1，400个突变DNA拷贝)、1%(140个突变DNA拷贝)、0.1%(14个突变DNA拷贝)、0.01%(I个突变DNA拷贝)和0%突变等位基因G12V的正常50ng DNA样本的平均引物组合qPCR曲线在图19a中示出。图19b示出使用常规引物对相同DNA样本进行的分析。在这两种情况下，引物都被设计为根据位于krasPlO-56或常规引物的3’端的碱基鉴别错配。
[0283]结论:
[0284]引物组合KRAS G12V突变测定能够检测具有14，000个正常DNA序列的混合物中存在的单拷贝的突变等位基因(0.01%)，而用常规引物的测定被限制于140拷贝的突变DNA(1%)的检测。与常规引物相比较，当使用引物组合进行罕见突变检测时，敏感性提高了100倍。源自单个突变等位基因的信号可与背景区别开来(相差2-3个循环)。
[0285]实施例7
[0286]用固定样本使用引物组合和SybrGreen的突变检测.[0287]材料:
[0288]WT kras HT29 结肠直肠腺癌细胞 ATCC#HTB_38
[0289]从新收获的SW480结肠直肠腺癌细胞(ATCC#CCL_228)中分离G12V基因组DNA。
[0290]方法:
[0291]细胞固定:将HT29细胞(kras WT DNA的来源)或SW480细胞(kras G12V DNA的来源)胰蛋白酶化，在冰冷的PBS中洗涤3次，于室温下在4%甲醛中固定10分钟，并再次用PBS洗涤4次。在最后一次洗涤后，根据实施例5中描述的方案，使用细胞沉淀分离DNA。
[0292]模板制备和DNA扩增:与实施例5中描述的相同。
[0293]结果:
[0294]含有100%(14, 000 个突变 DNA 拷贝),50%(7, 000 个突变 DNA 拷贝)、10%(1，400 个突变DNA拷贝)、1% (140个突变DNA拷贝)、0.1% (14个突变DNA拷贝)、0.01% (I个突变DNA拷贝)和0%突变等位基因G12V的固定DNA样本的平均引物组合qPCR曲线在图20中示出。与利用非固定样本的结 果相似，检测限为0.01%或I个突变DNA分子。
[0295]结论:
[0296]引物组合KRAS G12V突变qPCR测定敏感性和选择性不受细胞固定影响，表明这个测定对于真正临床样本的实用性。源自单个突变等位基因的信号可与背景区别开来(相差3个循环)。
[0297]实施例8
[0298]用引物组合和探针多核苷酸的KRAS G12V测定
[0299]材料:
[0300]模板DNA:
[0301]野生型人基因组DNA得自Promega#G1471，突变G12V DNA分离自SW480细胞(参见实施例6)。
[0302]寡核苷酸:
[0303]Kras 常规正向引物 10-178 (SEQ ID NO: 16),
[0304]kras G12V P10_171(SEQ ID NO: 14)(即，“第一多核苷酸”)，
[0305]kras F10_174(SEQ ID NO: 15)(即，“第二多核苷酸”)，
[0306]kras特异性Zen双淬灭探针10-185 (SEQ ID NO: 19)(即，“包含标记和淬灭剂的探针多核苷酸”)。
[0307]实时qPCR 混合物:BioRad IQ Supermix#170_8862。
[0308]方法:
[0309]实时扩增反应:使用BioRad CFX96实时系统一式三份地利用25 μ I等分试样进行扩增，所述等分试样由以下组成:12.5 μ 12x BioRad IQ Supermix、200ηΜ正向引物 10-178(SEQ ID N0:16)、200nM kras G12VP10-171(SEQ ID N0:14)、400nM krasF10-174(SEQ ID NO: 15)、250nM 探针 10-185 (SEQ ID NO: 19)和 50ng 模板 DNA。使用以下热循环分布进行扩增:94°C下3分钟的1个循环，接着是94°C下10秒及66.5°C下1分钟20秒的60个循环。
[0310]结果:
[0311]含有100%(14，000 个突变 DNA 拷贝)、50%(7，000 个突变 DNA 拷贝)、10%(1，400 个突变DNA拷贝)、1% (140个突变DNA拷贝)、0.1% (14个突变DNA拷贝)、0.01% (1个突变DNA拷贝)和0%突变等位基因G12V的DNA样本的平均引物组合qPCR曲线在图21中示出。与实施例6和7中描述的结果相似，使用探针多核苷酸的检测限为0.01%或1个突变DNA分子。在利用低量的突变DNA(0.1%和0.01%)时，信号强度降低。
[0312]结论:
[0313]引物组合KRAS G12V突变qPCR测定敏感性没有因为使用探针多核苷酸而显著提高。源自单个突变等位基因的信号可与背景(一直到65个循环都为平直的线(flat line))相区别开来，表明含有探针多核苷酸的测定的选择性较好。
[0314]实施例9
[0315]用引物组合、探针多核苷酸和阻断剂多核苷酸的KRAS G12V测定.[0316]材料:
[0317]模板DNA:
[0318]野生型人基因组DNA得自Promega#G1471，突变G12V DNA分离自SW480细胞(参见实施例6)。
[0319]寡核苷酸:
[0320]kras P10_184(SEQ ID NO: 18)(即，“第一多核苷酸”)，
[0321]kras F10_182(SEQ ID NO: 17)(即，“第二多核苷酸”)，
[0322]kras特异性Zen双淬灭探针10-210 (SEQ ID NO: 21)(即，“探针多核苷酸”)，
[0323]kras 常规反向引物 10-208 (SEQ ID NO: 20),(即，“反向引物”)
[0324]阻断寡核苷酸10-213 (SEQ ID NO:22)(即，“阻断剂多核苷酸”)
[0325]实时 qPCR 混合物:BioRad IQ Supermix#170_8862
[0326]方法:
[0327]实时扩增反应:使用BioRad CFX96实时系统一式三份地在25 μ 1等分试样中进行扩增，所述等分试样由以下组成:12.5 μ 12x BioRad IQSupermix、200nM kras P10-184 (SEQID N0:18)、50nM kras F10_182(SEQ ID NO: 17)、200nM 反向引物 10-208 (SEQ ID NO:20),250nM探针多核苷酸 10-210 (SEQ ID NO: 21)、2000nM 阻断寡核苷酸 10-213 (SEQ ID NO:22)和50ng模板DNA。使用以下热循环分布进行扩增:94°C下3分钟的1个循环，接着是94°C下10秒及65°C下1分钟的60个循环。
[0328]结果:
[0329]含有100%(14, 000 个突变 DNA 拷贝),50%(7, 000 个突变 DNA 拷贝)、10%(1，400 个突变DNA拷贝)、1% (140个突变DNA拷贝)、0.1% (14个突变DNA拷贝)、0.01% (1个突变DNA拷贝)和0%突变等位基因G12V的DNA样本的平均引物组合qPCR曲线在图22中示出。
[0330]结论:
[0331]阻断剂寡核苷酸10-213 (SEQ ID NO: 22)(与探针多核苷酸的组合)的添加显著改善该测定的特性。与实施例4、5和6中描述的结果相似，使用TaqMan探针和阻断剂的检测限为0.01%,或1个突变DNA分子，但是在对单个突变等位基因的检测的选择性上，与实施例6中描述的测定相比提高约100-1000倍(单个突变拷贝与源自14，000个正常DNA分子的背景之间相差5-7个循环)。
[0332]实施例10
[0333]用探针多核苷酸、阻断剂多核苷酸和3’ -碱基LNA修饰的引物组合KRAS G12V测定.[0334]材料:
[0335]模板DNA:
[0336]野生型人基因组DNA得自Promega#G1471，突变G12V DNA分离自SW480细胞(参见实施例6)。
[0337]寡核苷酸:
[0338]具有3，LNA的kras P10_236(SEQ ID NO:23)(即，“3，端包含锁核酸的第一多核苷酸”)，
[0339]kras F10_182(SEQ ID NO: 17)(即，“第二多核苷酸”)，
[0340]kras特异性Zen双淬灭探针10-210 (SEQ ID NO: 21)(即，“探针多核苷酸”)，
[0341]kras 常规反向引物 10-208 (SEQ ID NO: 20)(即，“反向引物”)，
[0342]阻断寡核苷酸10-213 (SEQ ID NO: 22)(即，“阻断剂多核苷酸”)
[0343]实时qPCR 混合物:BioRad IQ Supermix#170-8862
[0344]方法:
[0345]实时扩增反应:使用BioRad CFX96实时系统一式三份地在25 μ I体积中进行扩增，所述的 25 μ 1 体积由以下组成:12.5μ 12x BioRad IQSupermix、200nM krasP10-236(SEQ ID N0:23)、50nM kras F10_182(SEQ ID NO: 17)、200nM反向引物 10-208 (SEQID NO: 20)、250nM探针多核苷酸 10-210 (SEQ ID NO: 21)、2000nM 阻断寡核苷酸 10-213 (SEQID NO:22)和50ng模板DNA。使用以下热循环分布进行扩增:94°C下3分钟的1个循环，接着是94°C下10秒及65°C下1分钟的60个循环。
[0346]结果:
[0347]含有1%(140个突变DNA拷贝)和0%突变等位基因G12V的DNA样本的平均引物组合qPCR曲线在图23中示出。
[0348]结论:
[0349]与前面的实施例相比较，具有探针多核苷酸、阻断剂多核苷酸及P10-236的3’-碱基LNA修饰的引物组合KRAS gl2V测定展现出最佳的敏感性(单个突变等位基因)和最佳的选择性(14，000个野生型DNA分子无信号)。
[0350]实施例11
[0351]以每14，000拷贝WT DNA0.5拷贝G12V DNA使用改进的KRASG12V测定的单突变检测:16个样本的分析
[0352]材料:
[0353]与实施例10相同。
[0354]方法:[0355]模板制备:
[0356]为了产生0.5拷贝的KRAS G12V DNA模板，将先前分离的SW480基因组DNA稀释在IOng/ μ I Promega人基因组DNA中至最终浓度为I个SW480DNA分子/10 μ I WT DNA。
[0357]实时扩增反应:
[0358]使用实施例10中描述的扩增混合物组合物和方案，在16个等分试样中用5 μ 10.5拷贝的KRAS G12V DNA模板或WT DNA进行扩增。
[0359]结果:
[0360]使用来自实施例10的改进的KRAS G12V qPCR突变测定和含有(在统计上)每14，000拷贝WT DNA0.5拷贝G12V DNA的样本的16个重复实验在图24a_d中示出。经稀释的掺标DNA样本的50-60% (16个中的8_10个)指示存在单个突变DNA，并且经稀释的掺标DNA样本的40-50%(16个中的6_8个)显示无信号，这与统计期望值一致。
[0361]使用来自实施例10的改进的KRAS G12V qPCR突变测定和含有14，000拷贝WTDNA (未添加突变DNA)的样本的16个重复实验在图24e_h中示出。94%的WT DNA样本(16个中的15个)显示无信号，表明所述改进的KRAS G12V引物组合qPCR突变测定对单个突变DNA检测的选择性非常高。
[0362]结论: [0363]对于在存在超过10，000个非突变DNA分子情况下的单个突变等位基因的检测，用探针多核苷酸、阻断剂和3’ -的LNA碱基的引物组合G12V测定具有100%的敏感性和94-100%的选择性。G12V测定的此类参数满足要求最高的诊断测定的特征。该测定理想地适合于检测在血液中循环的罕见癌细胞以便有效且非侵入性地管理CRC和NSCLC患者。
[0364]使用在具有14，000拷贝的野生型DNA的混合物中包含140拷贝的突变DNA构建体的模板混合物单独地对KRAS基因座中七种突变(G12D、G12R、G12S、G13D、G12C、G12A和G12V)中的每一种进行进一步的测定。用于每种KRAS反应的引物购自Integrated DNATechnologies, Inc.(Coralville, IA)并在下表 I 中。
【权利要求】
1.一种包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的多核苷酸引物组合，所述第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域0\)互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，以及所述第二多核苷酸(F)包含具有与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的序列的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd),所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc和Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，其中所述靶多核苷酸具有被Fb与所述靶多核苷酸的杂交变性的二级结构，并且其中Pa特异性地与选自以下的基因座中的序列杂交:V-K1-raS2KirSten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)、v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1 (BRAF)、KRAS密码子12、KRAS密码子13、NRAS、表皮生长因子受体(EGFR)、P13K、PIK3CA、p53、TP53、BCR-ABL、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、KIT、血小板衍生生长因子受体、α多肽(TOGFRA)、Janus激酶2 (JAK2)、连环蛋白(钙粘着蛋白相关蛋白)β 1(CTNNB1)、ALK和AKT。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸引物组合，其中所述靶多核苷酸的二级结构抑制在不存在F的情况下所述靶多核苷酸的聚合酶延伸。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸引物组合，其中所述P和/或F进一步包含经修饰的核酸。
4.一种包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的多核苷酸引物组合，所述第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域0\)互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，以及所述第二多核苷酸(F)包含具有与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的序列的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd),所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc和Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，其中P和/或F进一步包含经修饰的核酸，并且其中Pa特异性地与选自以下的基因座中的序列杂交:v-Ki_ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)、v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF)、KRAS密码子12、KRAS密码子13、NRAS、表皮生长因子受体(EGFR)、P13K、PIK3CA、p53、TP53、BCR-ABL、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、KIT、血小板衍生生长因子受体、α多肽(PDGFRA)、Janus激酶2(JAK2)、连环蛋白(钙粘着蛋白相关蛋白)β 1(CTNNB1)、ALK 和 AKT。
5.—种包含第一多核苷酸、第二多核苷酸和阻断剂多核苷酸的多核苷酸引物组合，所述第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域0\)互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，所述第二多核苷酸(F)包含具有与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的序列的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd),所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc与Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，以及所述阻断剂多核苷酸包含与第三靶多核苷酸区域(T3)互补的核苷酸序列，其中Τ3位于"^和！^的5’处，并且其中Pa特异性地与选自以下的基因座中的序列杂交:v-Ki_ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)、v_raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1 (BRAF)、KRAS 密码子 12、KRAS 密码子 13、NRAS、表皮生长因子受体(EGFR)、P13K、PIK3CA、p53、TP53、BCR-ABL、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、KIT、血小板衍生生长因子受体、α多肽(PDGFRA)、Janus激酶2 (JAK2)、连环蛋白(钙粘着蛋白相关蛋白)β I (CTNNBl)、ALK和 AKT。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸引物组合，其中在P的3’端的核苷酸和在所述阻断剂多核苷酸的5’端的核苷酸重叠。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸引物组合，其中所述阻断剂多核苷酸具有在Pa的整个长度上与Pa重叠的序列。
8.根据权利要求6所述的多核苷酸引物组合，其中在P的3’端的核苷酸和在所述阻断剂多核苷酸的5’端的核苷酸不同。
9.根据权利要求5、6或8所述的多核苷酸引物组合，其中P、F和/或所述阻断剂多核苷酸包含经修饰的核酸。
10.一种包含第一多核苷酸、第二多核苷酸和探针多核苷酸的多核苷酸引物组合， 所述第一多核苷酸包含与第一靶多核苷酸区域(T1)互补的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)， 所述第二多核苷酸(F)包含与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd),所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc和Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，以及 所述探针多核苷酸包含与第三靶多核苷酸区域(T4)互补的核苷酸序列，其中T4位于T1和T2的5’处，并且其中Pa特异性地与选自以下的基因座中的序列杂交:V-K1-raS2KirSten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)、v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物BI (BRAF)、KRAS密码子 12、KRAS 密码子 13、NRAS、表皮生长因子受体(EGFR)、P13K、PIK3CA、p53、TP53、BCR_ABL、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、KIT、血小板衍生生长因子受体、α多肽(TOGFRA)、Janus激酶2(JAK2)、连环蛋白(钙粘着蛋白相关蛋白)β I (CTNNBl)、ALK和ΑΚΤ。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸引物组合，其中所述探针多核苷酸包含标记和淬灭剂。
12.根据权利要求10或11所述的多核苷酸引物组合，其中P、F和/或所述探针多核苷酸包含经修饰的核酸。
13.根据权利要求10、11或12所述的多核苷酸引物组合，其进一步包含阻断剂多核苷酸，其中所述阻断剂多核苷酸包含与第四靶多核苷酸区域(T3)互补的核苷酸序列，并且其中T3位于T1和T2的5’处及T4的3’处。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸引物组合，其中所述阻断剂包含经修饰的核酸。
15.—种包含第一多核苷酸、第二多核苷酸和通用淬灭剂多核苷酸的多核苷酸引物组I=I， 所述第一多核苷酸(P)包含与第一靶多核苷酸区域(T1)互补的第一结构域(Pa)、包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)及在其5’端的标记， 所述第二多核苷酸(F)包含与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd)，所述第二结构域(Fd)包含两个多核苷酸序列，即，与Pc的5’序列充分互补从而使得Pc的5’多核苷酸序列与Fd将在适当的条件下杂交的5’多核苷酸序列，和与所述通用淬灭剂多核苷酸充分互补从而使得Fd的3’多核苷酸序列与所述通用淬灭剂将在适当的条件下杂交的3’多核苷酸序列，以及所述通用淬灭剂多核苷酸包含淬灭剂及与Fd的3’多核苷酸序列充分互补从而使得所述通用淬灭剂多核苷酸与所述Fd的3’多核苷酸序列将在适当的条件下杂交的核苷酸序列，并且其中Pa特异性地与选自以下的基因座中的序列杂交:v-Ki_ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)、v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1 (BRAF)、KRAS密码子12、KRAS 密码子 13、NRAS、表皮生长因子受体(EGFR)、P13K、PIK3CA、p53、TP53、BCR-ABL、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、KIT、血小板衍生生长因子受体、α多肽(TOGFRA)、Janus激酶2(JAK2)、连环蛋白(钙粘着蛋白相关蛋白)β 1 (CTNNB1)、ALK和AKT。
16.根据权利要 求15所述的多核苷酸引物组合，其中P、F和/或所述通用淬灭剂多核苷酸包含经修饰的核酸。
17.根据上述权利要求中任一项所述的多核苷酸引物组合，其进一步包含反向引物，其中所述反向引物包含互补于含有与杂交的序列的多核苷酸链的多核苷酸序列。
18.根据权利要求3、4、9、12、14或16中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中P包含经修饰的核酸。
19.根据权利要求3、4、9、12、14或16中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中F进一步包含经修饰的核酸。
20.根据权利要求18所述的多核苷酸引物组合，其中所述经修饰的核酸在Pa中。
21.根据权利要求19所述的多核苷酸引物组合，其中所述经修饰的核酸在Fb中。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中P在Pa中包含多个经修饰的核酸。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中F在Fb中包含多个经修饰的核酸。
24.根据权利要求21所述的多核苷酸引物组合，其中所述经修饰的核酸为位于P的3’端的核苷酸。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中Fd与Pc至少70%互补。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中Pc与Fd至少70%互补。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中Pc和Fd在不存在所述模板多核苷酸的情况下彼此杂交。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中P为DNA、经修饰的DNA、RNA、经修饰的RNA、肽核酸(PNA)或它们的组合。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中F为DNA、经修饰的DNA、RNA、经修饰的RNA、肽核酸(PNA)或它们的组合。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的多核苷酸引物组合，其进一步包含在其3’端连接至F的阻断从DNA聚合酶的延伸的阻断基团。
31.根据权利要求30所述的多核苷酸引物组合，其中所述阻断基团选自3’磷酸基团、3’氨基、双脱氧核苷酸和反转脱氧胸苷(dT)。
32.根据权利要求1至30中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中Pa为长度约5个碱基至长度约30个碱基、长度约5个碱基至长度约20个碱基、长度约5个碱基至长度约15个碱基、长度约5个碱基至长度约10个碱基、长度约5个碱基至长度约8个碱基。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中Pc为长度约5个碱基至长度约200个碱基、长度约5个碱基至长度约150个碱基、长度约5个碱基至长度约100个碱基、长度约5个碱基至长度约50个碱基、长度约5个碱基至长度约45个碱基、长度约5个碱基至长度约40个碱基、长度约5个碱基至长度约35个碱基、长度约5个碱基至长度约30个碱基、长度约5个碱基至长度约25个碱基、长度约5个碱基至长度约20个碱基、长度约5个碱基至长度约15个碱基、长度约10个至长度约50个碱基、长度约10个碱基至长度约45个碱基、长度约10个碱基至长度约40个碱基、长度约10个碱基至长度约35个碱基、长度约10个碱基至长度约30个碱基、长度约10个碱基至长度约25个碱基、长度约10个碱基至长度约20个碱基，或长度约10个碱基至长度约15个碱基。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中Fb为长度约10个碱基至长度约5000个碱基、长度约10个碱基至长度约4000个碱基、长度约10个碱基至长度约3000个碱基、长度约10个碱基至长度约2000个碱基、长度约10个碱基至长度约1000个碱基、长度约10个碱基至长度约500个碱基、长度约10个碱基至长度约250个碱基、长度约10个碱基至长度约200个碱基、长度约10个碱基至长度约150个碱基、长度约10个碱基至长度约100个碱基、长度约10个碱基至长度约95个碱基、长度约10个碱基至长度约90个碱基、长度约10个碱基至长度约85个碱基、长度约10个碱基至长度约80个碱基、长度约10个碱基至长度约75个碱基、长度约10个碱基至长度约70个碱基、长度约10个碱基至长度约65个碱基、长度约10个碱基至长度约60个碱基、长度约10个碱基至长度约55个碱基、长度约10个碱基至长度约50个碱基、长度约10个碱基至长度约45个碱基、长 度约10个碱基至长度约40个碱基、长度约10个碱基至长度约35个碱基、长度约10个碱基至长度约30个碱基，或长度约10个碱基至长度约100个碱基。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中Fd为长度约5个碱基至长度约200个碱基、长度约5个碱基至长度约150个碱基、长度约5个碱基至长度约100个碱基、长度约5个碱基至长度约50个碱基、长度约5个碱基至长度约45个碱基、长度约5个碱基至长度约40个碱基、长度约5个碱基至长度约35个碱基、长度约5个碱基至长度约30个碱基、长度约5个碱基至长度约25个碱基、长度约5个碱基至长度约20个碱基、长度约5个碱基至长度约15个碱基、长度约10个至长度约50个碱基、长度约10个碱基至长度约45个碱基、长度约10个碱基至长度约40个碱基、长度约10个碱基至长度约35个碱基、长度约10个碱基至长度约30个碱基、长度约10个碱基至长度约25个碱基、长度约10个碱基至长度约20个碱基，或长度约10个碱基至长度约15个碱基。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中P包含标记。
37.根据权利要求36所述的多核苷酸引物组合，其中所述标记位于P的5’端。
38.根据权利要求36或37所述的多核苷酸引物组合，其中所述标记是可淬灭的。
39.根据权利要求36、37或38中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中F包含淬灭剂。
40.根据权利要求39所述的多核苷酸引物组合，其中所述淬灭剂位于F的3’端。
41.根据权利要求39或40所述的多核苷酸引物组合，其中所述淬灭剂选自BlackHoleQuencherl、Black Hole Quencher-2Λ1wa BlackFQ、1wa Black RQ 和 Dabcyl.G-base。
42.根据权利要求9、14和18至41中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中所述阻断剂多核苷酸中的经修饰的核酸为位于所述阻断剂多核苷酸5’端的所述核苷酸。
43.根据权利要求3、4、9、12、13、16或17至42中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中所述经修饰的核酸为位于P的3’端的核苷酸。
44.根据权利要求3、4、9、12、14、16、18-24、42或43中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中所述经修饰的核酸为锁核酸。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的多核苷酸引物组合，其中所述引物组合特异性地识别选自以下的突变:KRAS G12V、KRASG12D、KRAS G12R、KRAS G12S、KRAS G13D、KRASG12C、KRASG12A 和 BRAF V600E/K。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的多核苷酸引物组合,其中所述祀多核苷酸包含宿主中的基因组DNA、线粒体DNA、RNA、mRNA、小RNA、微小RNA、游离循环核酸及外源病原体RNA 或 DNA。
47.根据权利要求46所述的多核苷酸引物组合，其中所述RNA为指示特异性RNA。
48.根据权利要求47所述的多核苷酸引物组合，其中所述指示特异性RNA选自:HER2、EGFR、细胞角蛋白19(CK19)、CD24、CD44、NOTCHU TWIST1、乳腺珠蛋白(MGBl)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、激肽释放酶2/3 (KLK2/3)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、小RNA、微小RNA和病原体特异性RNA。
49.根据权利要求46所述的多核苷酸引物组合，其中所述DNA为指示特异性DNA。
50.根据权利要求49所述的多核苷酸引物组合，其中所述指示特异性DNA选自:物种特异性DNA、菌株特异性DNA、病原体特异性DNA、指示特异性DNA甲基化状态和个人识别特异性DNA。
51.一种用根据权利要求1至50中任一项所述的引物组合检测样本中靶多核苷酸的存在的方法，其中P包含与T1完全互补的第一结构域并且其中Pa与所述样本中的非靶多核苷酸不完全互补， 所述方法包括以下步骤: 使所述样本与所述引物组合和聚合酶在当所述样本中存在所述靶多核苷酸时允许来自Pa的与所述靶多核苷酸互补的序列延伸的条件下接触，以及 检测从Pa延伸的所述序列，其中检测指示所述样本中所述靶多核苷酸的存在。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述方法提供了具有非靶多核苷酸的样本的序列检测与具有靶多核苷酸的样本的序列检测相比的变化。
53.一种用引物组合检测样本中靶多核苷酸的存在的方法，所述引物组合包含第一多核苷酸和第二多核苷酸， 所述第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域(T1)完全互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，Pa具有与所述样本中的非靶多核苷酸不完全互补的序列，以及 所述第二多核苷酸(F)包含与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd)，所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc与Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列， 所述方法包括以下步骤: 使所述样本与所述引物组合和聚合酶在当所述样本中存在所述靶多核苷酸时允许来自Pa的与所述靶多核苷酸互补的序列延伸的条件下接触，以及检测从Pa延伸的所述序列，从而指示所述样本中所述靶多核苷酸的存在。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述方法提供了具有非靶多核苷酸的样本的序列检测与具有靶多核苷酸的样本的序列检测相比的变化。
55.根据权利要求51至54中任一项所述的方法，其中所述检测步骤使用聚合酶链式反应进行。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述聚合酶链式反应利用所述引物组合的P及反向引物，所述反向弓丨物具有与从Pa延伸的序列互补的序列。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述聚合酶链式反应利用与从Pa延伸的序列互补的反向引物以及具有互补于与Pa杂交的所述靶多核苷酸链的序列的正向引物。
58.根据权利要求51至57中任一项所述的方法，其中检测实时进行。
59.一种使用引物组合启动样本中的靶多核苷酸上的聚合酶延伸的方法，所述引物组合包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域0\)完全互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，Pa具有与所述样本中的非靶多核苷酸不完全互补的序列，以及所述第二多核苷酸(F)包含与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd)，所述第二 结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc和Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列，其中所述样本包含以下二者的混合物:(i)在第一区域中具有与Pa中的所述序列完全互补的序列0\)的靶多核苷酸和(ii)在第一区域中具有与Pa不完全互补的序列(?\*)的非靶多核苷酸，所述方法包括以下步骤:使所述样本与引物组合和聚合酶在当Pa接触?\时允许来自Pa的并与所述靶多核苷酸链互补的序列延伸的条件下接触。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述靶多核苷酸中的所述第一区域(?\)中的序列与所述非靶多核苷酸中的所述第一区域0\*)中的序列有一个碱基不同。
61.根据权利要求59所述的方法，其进一步包括检测从Pa延伸的所述序列的步骤，其中检测指示所述样本中所述靶多核苷酸的存在。
62.一种使用根据权利要求1至50中任一项所述的引物组合启动样本中靶多核苷酸上的聚合酶延伸的方法，其中P包含与第一靶多核苷酸区域0\)完全互补的第一结构域(Pa)，并且其中Pa与所述样本中的非靶多核苷酸不完全互补，所述方法包括以下步骤:使所述样本与所述引物组合和聚合酶在当所述样本中存在所述靶多核苷酸时允许来自Pa的与所述靶多核苷酸互补的序列延伸的条件下接触。
63.根据权利要求62所述的方法，其进一步包括检测从Pa延伸的所述序列的步骤，从而指示所述样本中所述靶多核苷酸的存在。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的方法，其中所述检测步骤使用聚合酶链式反应进行。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述聚合酶链式反应利用所述引物组合的P及反向引物，所述反向引物具有与从Pa延伸的所述序列互补的序列。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述聚合酶链式反应利用与从Pa延伸的所述序列互补的反向引物以及具有互补于与Pa杂交的所述靶多核苷酸链的序列的正向引物。
67.根据权利要求63至66中任一项所述的方法，其中检测实时进行。
68.一种使用多核苷酸引物组合扩增样本中的靶多核苷酸的方法，所述引物组合包含第一多核苷酸和第二多核苷酸， 所述第一多核苷酸(P)包含具有与第一靶多核苷酸区域(T1)完全互补的序列的第一结构域(Pa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(Pc)，Pa具有与所述样本中的非靶多核苷酸不完全互补的序列，以及 所述第二多核苷酸(F)包含与第二靶多核苷酸区域(T2)互补的第一结构域(Fb)及第二结构域(Fd),所述第二结构域(Fd)包含与Pc充分互补从而使得Pc和Fd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列， 其中所述样本包含以下二者的混合物:(i)在第一区域(T1)中具有与Pa中的所述序列完全互补的序列的靶多核苷酸和(ii) 一个或多个与Pa不完全互补的非靶多核苷酸； 所述方法包括以下步骤: (a)使所述样本与所述引物组合和聚合酶在当所述样本中存在所述靶多核苷酸时允许来自Pa的与所述靶多核苷酸互补的序列延伸的条件下接触， (b)使从Pa延伸的所述序列从所述靶多核苷酸变性，以及 (C)在具有与步骤(b)中从Pa延伸的所述序列中的区域互补的序列的反向引物的存在下重复步骤(a)以扩增所述靶多核苷酸， 其中所述靶多核苷酸的延伸和扩增在Pa与所述Pa中的所述序列完全互补时发生，但是在所述靶多核苷酸中的所述第一区域与Pa中的所述序列不完全互补时效率较低或者不发生。
69.一种使用根据权利要求1至50中任一项所述的多核苷酸引物组合扩增样本中的靶多核苷酸的方法，其中所述第一多核苷酸(P)包含与第一靶多核苷酸区域(T1)完全互补的第一结构域(Pa)，并且其中Pa与所述样本中的非靶多核苷酸不完全互补， 所述方法包括以下步骤: (a)使所述样本与所述引物组合和聚合酶在当所述样本中存在所述靶多核苷酸时允许来自Pa的与所述靶多核苷酸互补的序列延伸的条件下接触、 (b)使从Pa延伸的所述序列从所述靶多核苷酸变性，以及 (C)在具有与步骤(b)中从Pa延伸的所述序列中的区域互补的序列的反向引物的存在下重复步骤(a)以扩增所述靶多核苷酸， 其中所述靶多核苷酸的延伸和扩增在T1与Pa中的所述序列完全互补时发生，但是在所述靶多核苷酸中的所述第一区域与Pa中的所述序列不完全互补时效率较低或者不发 生。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述反向引物具有与从Pa延伸的所述序列中的区域完全互补的序列。
71.根据权利要求68或69所述的方法,其中所述反向引物为包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的引物组合，所述第一多核苷酸(PP)包含具有与步骤(a)中从Pa延伸的所述序列中的第一区域(TT1)完全互补的序列的第一结构域(PPa)及包含独特多核苷酸序列的第二结构域(PPc)，以及
所述第二多核苷酸(FF)包含与步骤(a)中从Pa延伸的所述序列中的第二区域(TT2)互补的第一结构域(FFb)及第二结构域(FFd)，所述第二结构域(FFd)包含与PPc充分互补从而使得PPc与FFd将在适当的条件下杂交的多核苷酸序列。
72.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述反向引物为根据权利要求1至50中任一项所述的引物组合。
73.根据权利要求68至72中任一项所述的方法，其进一步包括检测在所述方法中扩增的产物的步骤。
74.根据权利要求73所述的方法，其中检测使用聚合酶链式反应进行。
75.根据权利要求73或74所述的方法，其中检测实时进行。
76.根据权利要求51-75中任一项所述的方法,其中所述祀多核苷酸包含突变。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述突变选自:碱基取代、插入/缺失(indel)、扩增、重排、体细胞突变、种系突变、内源突变、外源突变和非编码突变。
78.根据权利要求51-75中任一项所述的方法,其中所述祀多核苷酸包含选自以下的基因座中的突变:v-Ki_ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)、v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物BI (BRAF)、KRAS密码子12、KRAS密码子13、NRAS、表皮生长因子受体(EGFR)、P13K、PIK3CA、p53、TP53、BCR-ABL、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、KIT、血小板衍生生长因子受体、α多肽(roGFRA)、Janus激酶2(JAK2)、连环蛋白(钙粘着蛋白相关蛋白)β I (CTNNBl)、ALK 和 AKT。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述KRAS突变选自:G12V、G12D、G12R、G12S、G13D、G12C 和 G12A。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述BRAF突变为V600E/K。
81.根据权利要求51-80中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸包含宿主中的基因组DNA、线粒体DNA、RNA、mRNA、小RNA、微小RNA、游离循环核酸及外源病原体RNA或DNA。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述RNA为指示特异性RNA。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述指示特异性RNA选自:HER2、EGFR、细胞角蛋白19 (CK19)、CD24、CD44、NOTCHl、TWISTl、乳腺珠蛋白(MGBl)、胆色素原脱氨酶(PB⑶)、激肽释放酶2/3(KLK2/3)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、小RNA、微小RNA和病原体特异性RNA。
84.根据权利要求81所述的方法，其中所述DNA为指示特异性DNA。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述指示特异性DNA选自:物种特异性DNA、菌株特异性DNA、病原体特异性DNA、指示特异性DNA甲基化状态和个人识别特异性DNA。
86.根据权利要求51-85中任一项所述的方法，其中所述样本选自:身体组织、新鲜、冷冻或固定的肿瘤样本、活检样本、淋巴结样本、骨髓样本、全血样本、血清或血浆样本，循环肿瘤细胞(CTC)样本、循环蛋白质样本、无循环细胞的核酸样本、尿液样本、痰液样本、颊拭子样本、环境拭子样本、商业/农业样本及唾液样本。
【文档编号】C07H21/04GK103703013SQ201280017747
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年2月14日 优先权日:2011年2月14日
【发明者】弗拉基米尔·马卡罗夫, 谢尔盖·A·丘坡瑞塔 申请人:斯威夫特生物科学公司