一种cb1拮抗剂egcg的制备方法及制备的药物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种CB1拮抗剂EGCG的制备方法及用其制备的治疗脑血管疾病、戒烟和减肥药物，主要步骤为：重组人CB1真核表达载体的构建；CB1高表达HEK293细胞膜及细胞膜色谱柱的制备；亲和色谱分离、制备EGCG。本发明制备的中草药单体分子大麻受体CB1拮抗剂EGCG，作用温和，不良反应极其微小，具有良好发展前景和使用价值。
【专利说明】 一种CB1拮抗剂EGCG的制备方法及制备的药物
【技术领域】
[0001]本发明属于CBl拮抗剂应用领域，尤其涉及一种CBl拮抗剂EGCG的制备方法及用其制备的治疗脑血管疾病、戒烟和减肥药物。
【背景技术】
[0002]大麻受体是一种G蛋白偶联受体，有两种亚型受体CBl和CB2。CBl受体在中枢神经系统、肺、肝脏、肾脏等外周组织中表达。中枢CBl受体主要与抑制食欲、减少摄食有关，而外周CBl受体主要与调节体内能量代谢，减轻体重有关。CBl受体是一类影响人类食欲与能量代谢的受体，利莫那班是第一个选择性作用于CBl受体的拮抗剂，CBl拮抗剂是治疗肥胖症、戒烟和治疗脑缺血疾病的重要靶标，选择性作用于CBl受体的拮抗剂受到了广泛的关注。
[0003]目前筛选CBl拮抗剂的方法主要是药物化学的方法和建立CBl细胞筛选模型进行高通量药物筛选。具体如下:
[0004]一、中国人民解放军军事医学科学院/解放军军事医学科学院，药物化学专业硕士研究生陶晓璇，郑志兵等硕士论文“CB1受体拮抗剂的设计、合成与生物活性评价”，通过CBl受体拮抗剂与其受体的相互作用，建立了“4-甲基-1H-二芳基吡唑类”CBl受体拮抗剂的构效关系。基于已经建立的构效关系，并在充分考虑CBl与CB2的结构相似性、拮抗剂的过膜能力等前提下，以利莫那班作为先导化合物，对其吡唑环3位进行结构修饰，设计了包括季铵盐类、脲基类和胍基类等三类具有较高亲水性的化合物，期望得到具有高亲和性且不易透过血脑屏障的最大限度的减少中枢副作用选择性作用于外周组织的CBl受体拮抗剂。
[0005]二、华东理工大学制药工程专业，胡慧、朱为宏等硕士论文“大麻素I (CBl)受体小分子拮抗剂的筛选及其模型建立”。他们建立CBl受体小分子拮抗剂筛选平台，具体如下:
[0006]I)通过在CHO-Kl细胞株上共转染CBl受体和Gal5质粒，建立稳定表达CBl受体以及Ga 15的细胞株(hCBlR-CHO)；
[0007]2)利用hCBlR-CHO细胞株，建立基于检测钙信号CBl受体拮抗剂筛选模型，并对各种实验条件(如细胞密度、Fluo-4AM的浓度和荧光染料孵育时间等)进行优化，使之符合高通量药物筛选的要求；
[0008]3)应用建立的模型，探索筛选专一性强、亲和力高、毒副作用低的新型CBl受体选择性拮抗剂。应用该模型，论文筛选了 364个小分子化合物，将筛选得到的活性化合物经GTP-Eu竞争结合试验、毒性实验、交叉实验等做进一步验证，成功地发现一个新型CBl受体拮抗剂，其IC50值达到1.3 μ M0
[0009]目前，已有药物利莫那班不良反应明显，已经被世界上停售。EGCG通过拮抗CBl受体，可用于脑血管疾病、减肥和戒烟，国内外未见报道。如何整合出一套完整的CBl拮抗剂筛选路线，获得一个可以通过作用于CBl产生可用于防治脑血管疾病、减肥和戒烟的新药是近期困扰着人们的一个难题。
【发明内容】
[0010]本发明实施例的目的在于提供一种用于验证CBl拮抗剂EGCG治疗脑血管疾病、戒烟和减肥效果的方法，旨在解决近期困扰着人们的如何整合出一套完整的CBl拮抗剂筛选路线，获得一个可以通过作用于CBl产生可用于防治脑血管疾病、减肥和戒烟的新药的问题。
[0011]本发明实施例是这样实现的，一种用CBl拮抗剂EGCG的制备方法，该拮抗剂EGCG制备方法包括步骤:
[0012]步骤一,重组人CBl真核表达载体的构建；
[0013]组织总RNA的提取:取脑组织称重108mg，加入1.0ml Trizol，放入匀浆器中于冰上研磨，转入1.5mlEP管,混勻,静置5min后加入200 μ I氯仿,低温离心机,4°C, 12000rpm,离心15min，取上层水相移入EP管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置lOmin，低温离心，加入Iml预冷的0.1 % DEPC水配制的75%乙醇洗涤沉淀，超净台风干30min，加入400 μ IDEPC处理水溶解沉淀，琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，判断RNA的完整性，紫外分光光度计测定OD值并计算RNA浓度，_80°C保存备用；
[0014]引物设计与合成:根据Genbank公布人CBl基因序列设计引物，在上游引物的Y加入HindIII酶切点，下游引物5'加入EcoR I酶切点，由上海英骏生物技术有限公司合成；
[0015]pcDNA3.Ι-hCBl的构建:逆转录试剂盒逆转录得到总cDNA，进行PCR克隆CBl基因，反应条件:94°C预变性4min ;94°C变性30s ;56°C退火30s ;74°C延伸45s ;最后74°C延伸7min，预期片段长度1400bp，产物用I %琼脂糖凝胶电泳，切胶并用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收，回收的目的片段用HindIII和EcoR I双酶切2h，回收纯化，同时以HindIII和EcoR I酶酶切pcDNA3.1，回收纯化线性化质粒载体，将所获酶切片段以3: I比例用T4DNALigase在20°C连接24h，将连接产物转化到感受态DH5 α中，涂布含氨苄青霉素的LB固体培养基，挑取单个阳性克隆并扩增重组质粒，质粒试剂盒提取pcDNA3.Ι-hCBl，双酶切PCR鉴定，进行测序鉴定；
[0016]CBl真核表达载体转染:将重组载体pcDNA3.Ι-hCBl瞬时转染入HEK293细胞，转染采用LipOfectamine2000试剂进行，转染后48h收集细胞，制备细胞裂解液和总RNA进行下一步分析；
[0017]步骤二，CBl高表达HEK293细胞膜及细胞膜色谱柱的制备:
[0018]取在37°C，5% C02及包和适度条件下，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，常规传代，细胞贴壁生长单层覆盖培养皿底部90%，0.25胰蛋白酶液消化，收集细胞，血球计数板计数，取8 X 106细胞，4°C, 100g离心8min,加入1mL预冷磷酸缓冲液吹打混悬，条件同上离心lOmin，重复上述操作一次，倾出上清液加入8mL低渗缓冲液，冰块中匀浆，低温超声破膜30min，4°C条件下再次12000g离心20min，倾去上层液，加入5mLTris_HCl缓冲液重悬，备用，分光光度计680nm处测定组织样品和牛血清蛋白标准液，测定光密度值，考马斯亮蓝染色法测定膜蛋白含量，取色谱柱柱芯，制得CBl细胞色谱柱；
[0019]步骤三，亲和色谱分离、制备EGCG
[0020]将自制细胞膜色谱柱接到高效液相色谱仪，茶叶提取物用微孔滤膜0.45 μ m滤过，进样20 μ L，色谱条件为:柱温37°C ;流速0.5mL.mirT1，pH7.4，流动相磷酸盐缓冲液50mmol.mirT1,紫外检测波长280nm用流动相平衡2h后进样20 μ L分离，收集3.5-4.0min洗脱液，即获得CBl选择性拮抗剂EGCG。
[0021]进一步，CBl上游引物CNRl-f:
[0022]5' -CGGGATCCGCCACCATGAAGTCGATCCTAGATG-3'下游引物 CNRl—r:5' -GGAATTCCTTTTTCTGTGCAGCCACAA-3'。
[0023]进一步，拮抗剂EGCG的鉴定方法为:
[0024]红外光谱分析:红外光谱分析结果EGCG在1690CHT1处有一较强伸缩振动吸收峰υ，在1190?1240cm-1处有一组较强的非对称伸缩振动吸收峰u，在1450?1600cm-1处有苯环骨架特征振动吸收峰，光谱图与EGCG标准图谱一致，由此初步确认所获CBl拮抗剂物质为EGCG，
[0025]紫外吸收波长检测:取分离样品，用紫外可见光色谱仪测定最大吸收波长，发现在273.4nm处有最大吸收；
[0026]高效液相色谱法分析:采用C18色谱柱，流动相为甲醇:水:乙酸(23: 75: 2，V / V)，流速1.0mL.mirT1，柱温35°C，检测波长为272nm，高效液相色谱法定量分析亲和色谱法所分离EGCG纯度达到98%以上；
[0027]核磁共振分析:EGCG的核磁共振图谱 3.0O(IH).5.11 (IH)，5.53 (IH)，6.05 (2H)，6.65 (2H), 7.09 (2H)。
[0028]进一步，拮抗剂EGCG的使用方法为:水溶剂溶解后，给大鼠使用，给药途径为腹腔注射/ 口服。
[0029]本发明的另一目的在于提供一种用上述的CBl拮抗剂EGCG的制备方法制备的脑血管疾病、戒烟和减肥药物。
[0030]本发明制备的中草药单体分子大麻受体CBl拮抗剂EGCG，作用温和，不良反应极其微小，具有良好发展前景和使用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1是本发明实施例提供的用于验证CBl拮抗剂EGCG治疗脑血管疾病、戒烟和减肥效果的方法流程图。
【具体实施方式】
[0032]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0033]图1示出了本发明提供的用于验证CBl拮抗剂EGCG治疗脑血管疾病、戒烟和减肥效果的方法的流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
[0034]本发明的实施例提供的用于验证CBl拮抗剂EGCG治疗脑血管疾病、戒烟和减肥效果的方法，该方法包括以下步骤:
[0035]SlOl:构建CBl受体的真核表达HEK293细胞；
[0036]S102:用HEK293细胞通过细胞膜色谱法，筛选分离出CBl配体没食子儿茶素没食子酸酯EGCG ；
[0037]S103:经过免洗钙流检测试剂盒验证该配体EGCG为CBl拮抗剂；
[0038]S104:验证EGCG抗脑缺血、减肥作用；进行EGCG终止吸烟效果的随机双盲实验，验证EGCG戒烟功效。
[0039]在步骤S104中，验证EGCG抗脑缺血作用的方法为:
[0040]采用栓线阻断SD大鼠，大脑中动脉闭塞法MCAO法建立大鼠局灶性脑缺血模型，各组动物预先注射给药2d，并于造模前0.5h，造模后4h、12h再分别给药3次；
[0041]造模24h后进行行为学评分，测定脑组织水量和脑梗塞面积百分比及进行病理学检查，并用激光多普勒血流仪检测MCAO大鼠脑血流量变化。
[0042]在步骤S104中，测定EGCG对高脂饮食诱导肥胖小鼠的减肥作用的方法为:
[0043]对高脂饮食法诱导建立肥胖小鼠模型，给予EGCG30mg / kg治疗4周，检测体质量变化以及生殖器周围脂肪含量、脂肪细胞形态和血清胆固醇、三酰甘油含量的变化。
[0044]在步骤S104中，肥胖模型的建立及分组方法如下:
[0045]将ICR小鼠随机分为正常对照组和高脂饲料组，正常组从实验开始到结束均给予普通饲料喂养，高脂饲料组给予高脂饲料喂养，造模维持2个月；
[0046]造模结束后，取超出正常组小鼠平均体质量20%的小鼠为肥胖模型；
[0047]筛选出合格小鼠40只，随机分为4组，分别给予溶剂、EGCGmg / kg组、1mg / kg利莫那班；正常组10只小鼠灌胃给予溶剂，给药维持4周。
[0048]在步骤S104中，4组合格小鼠的指标检测如下:
[0049]首次给药后监测12h内累计食物消耗量，每小时记录I次；
[0050]在整个周期内，每天记录每组小鼠的摄食量以及每只小鼠的体质量，并观察小鼠的活动情况；
[0051]结束后禁食12h，摘除眼球取血，测定血清三酰甘油、总胆固醇，剥出全部右下腹股沟脂肪组织、生殖器周围脂肪组织并称重；
[0052]取生殖器周脂肪2小块用4%甲醛液固定，石蜡切片，HE染色，比较相同视野内脂肪细胞形态。
[0053]在步骤S104中，EGCG对戒烟作用双盲研究方法如下:
[0054]采用随机双盲安慰剂对照研究方法，将43例符合入组条件并签署知情同意书的吸烟者分为EGCG组即治疗组、200mg /片和安慰剂组，EGCG组25例、安慰剂组18例，疗程12周；
[0055]观察治疗期间不同时点戒烟成功率吸烟量< I支/ d、吸烟减少有效率治疗期间吸烟量较治疗前减少> 50%的比例，并评定可视性渴求强度测评表；
[0056]以尿可替宁和呼气一氧化碳浓度验证吸烟情况。
[0057]本发明实施例的拮抗剂的制备方法的步骤为:
[0058]1、重组人CBl真核表达载体的构建
[0059]1.1组织总RNA的提取:取脑组织称重108mg，加入1.0ml Trizol，放入匀浆器中于冰上研磨，转入1.5mlEP管，混匀，静置5min后加入200 μ I氯仿，低温离心机(4°C，12000rpm)离心15min，取上层水相移入EP管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置lOmin，低温离心，加入Iml预冷的0.1% DEPC水配制的75%乙醇洗涤沉淀，超净台风干30min，加Λ 400 μ I DEPC处理水溶解沉淀，琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，判断RNA的完整性，紫外分光光度计测定OD值并计算RNA浓度，-80°C保存备用；
[0060]1.2引物设计与合成:根据Genbank公布人CBl基因序列设计引物，在上游引物的5'加入HindIII酶切点，下游引物5'加入EcoR I酶切点，由上海英骏生物技术有限公司合成；
[0061]CBl 上游引物 CNRl-f:5' -CGGGATCCGCCACCATGAAGTCGATCCTAGATG-3 '下游引物CNRl-r:5/ -GGAATTCCTTTTTCTGTGCAGCCACAA-3;；
[0062]13pcDNA3.Ι-hCBl的构建:逆转录试剂盒逆转录得到总cDNA，进行PCR克隆CBl基因，反应条件:94°C预变性4min ;94°C变性30s ;56°C退火30s ;74°C延伸45s ;最后74°C延伸7min，预期片段长度1400bp，产物用I %琼脂糖凝胶电泳，切胶并用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收，回收的目的片段用HindIH和EcoR I双酶切2h，回收纯化，同时以HindIII和EcoR I酶酶切pcDNA3.1，回收纯化线性化质粒载体，将上述两步所获酶切片段以3: I比例用T4DNALigase在20°C连接24h，将连接产物转化到感受态DH5 α中，涂布含氨苄青霉素的LB固体培养基，挑取单个阳性克隆并扩增重组质粒，质粒试剂盒提取pcDNA3.l_hCBl，双酶切PCR鉴定，送宝生物工程公司进行测序鉴定；
[0063]1.4CB1真核表达载体转染:将重组载体pcDNA3.Ι-hCBl瞬时转染入HEK293细胞，转染采用Lipofectamine2000试剂进行，具体方法参见Lipofectamine2000使用说明书，转染后48h收集细胞，制备细胞裂解液和总RNA等进行下一步实验分析；
[0064]2、CBl高表达HEK293细胞膜及细胞膜色谱柱的制备:
[0065]取在37°C，5% C02及包和适度条件下，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，常规传代，细胞贴壁生长单层覆盖培养皿底部约90 %，0.25胰蛋白酶液消化，收集细胞，血球计数板计数，取约8 X 16细胞，4°C, 100g离心8min,加入1mL预冷磷酸缓冲液吹打混悬，条件同上离心lOmin，重复上述操作一次，倾出上清液加入8mL低渗缓冲液，冰块中匀浆，低温超声破膜30min，4°C条件下再次12000g离心20min，倾去上层液，加入5mLTris_HCl缓冲液重悬，备用，分光光度计680nm处测定组织样品和牛血清蛋白标准液，测定光密度值，考马斯亮蓝染色法测定膜蛋白含量，取色谱柱柱芯，制得CBl细胞色谱柱；
[0066]3、亲和色谱分离、制备EGCG
[0067]将自制细胞膜色谱柱接到高效液相色谱仪，重庆市巫溪当年(2013年产)茶叶提取物用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，进样20 μ L，色谱条件为:柱温37°C ;流速0.5mL.min—1，pH7.4，流动相磷酸盐缓冲液50mmol.mirT1，紫外检测波长280nm用流动相平衡2h后进样20 μ L分离，收集3.5-4.0min洗脱液，即获得CBl选择性拮抗剂EGCG。
[0068]拮抗剂EGCG的鉴定方法为:
[0069]红外光谱分析:红外光谱分析结果EGCG在1690CHT1处有一较强伸缩振动吸收峰υ，在1190?1240cm-1处有一组较强的非对称伸缩振动吸收峰u，在1450?1600cm-1处有苯环骨架特征振动吸收峰，光谱图与EGCG标准图谱一致，由此初步确认所获CBl拮抗剂物质为EGCG。
[0070]紫外吸收波长检测:取分离样品，用紫外可见光色谱仪测定最大吸收波长，发现在273.4nm处有最大吸收，与《中华人民共和国药典》一致。
[0071]高效液相色谱法分析:采用C18色谱柱(4.6.ιΧ250πιπι，5μπι)，流动相为甲醇:水:乙酸(23: 75: 2, V / ￥)，流速1.01^.1^11_1，柱温351:，检测波长为272.。高效液相色谱法定量分析亲和色谱法所分离EGCG纯度达到98%以上。
[0072]核磁共振分析(IHNMR):EGCG 的核磁共振图谱 3.00 (IH).5.11 (IH)。5.53 (IH)，6.05 (2H)，6.65 (2H)，7.09 (2H)。测定结果与文献报道一致。
[0073]综合上述分析鉴定，所采用亲和色谱法分离所获物质为CBl拮抗剂EGCG。
[0074]拮抗剂的使用方法:
[0075]目前所使用的EGCG主要是水溶剂溶解后，给大鼠使用，给药途径为腹腔注射/口服(灌胃)。
[0076]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0077]1、脑血管病证明实验
[0078]1.1试验方法:采用栓线阻断实验模型SD大鼠，大脑中动脉闭塞法(MCAC^i)建立大鼠局灶性脑缺血模型，各组动物预先注射给药2d，并于造模前0.5h，造模后4h、12h再分别给药3次。造模24h后进行行为学评分，测定脑组织水量和脑梗塞面积百分比及进行病理学检查，并用激光多普勒血流仪检测MCAO大鼠脑血流量变化。
[0079]1.2实验结果:
[0080]1.2.1对行为学评分和脑含水量的影响
[0081]MCAO大鼠麻醉清醒后可见偏瘫样症状出现，主要表现为不同程度的手术对侧前肢内收，肩内旋，肌张力降低，推右肩向对侧移动，抵抗阻力下降，部分动物向对侧转圈。对模型大鼠进行神经行为学评分及脑含水量测定。
[0082]结果显示:模型组神经行为学评分和脑含水量明显高于假手术维，EGCG注射组与模型组比较，大鼠的神经行为学障碍明显得到改善，脑含水量显著降低。提示EGCG对MCAO大鼠有明显保护作用。
[0083]1.2.2对脑梗塞面积的影响
[0084]EGCG注射组给药后，对比假手术组大鼠，脑梗塞面积百分率显著下降。
[0085]1.2.3对脑病理组织学的影响
[0086]假手术组大鼠神经元及脑实质细胞结构基本正常，核仁清楚，染色均匀，细胞周围间隙略扩大。模型对照组大鼠脑镜下可见明显大面积软化灶，有的呈筛网状。细胞周围间隙明显扩大、肿胀，尼氏小体减少或消失，核深染、固缩或溶解。脑组织血管扩张，明显充盎。EGCG组大鼠脑组织软化灶明显减小，多小灶性梗死。细胞周围间隙略增宽，右侧神经元及脑实质细胞、毛细盘管周围增大，神经元细胞核轻度肿胀，核仁清楚，可见胶质细胞增生，呈变性，水肿改变。
[0087]综上结果，以及已有其他研究人员，证明EGCG通过拮抗CBl受体可用于脑血管疾病的预防和治疗。
[0088]2、测定EGCG对高脂饮食诱导肥胖小鼠的减肥实验研究
[0089]对高脂饮食法诱导建立肥胖小鼠模型，给予EGCG30mg / kg治疗4周，检测体质量变化以及生殖器周围脂肪含量、脂肪细胞形态和血清胆固醇、三酰甘油含量的变化。结果:EGCG通过抑制CBl受体发挥减肥作用，可显著减少小鼠的食物摄入量和体质量，降低生殖器周围脂肪、血清胆固醇及三酰甘油的含量。结论=EGCG可通过抑制CBl受体，降低食欲产生减肥作用，同时能降低血脂水平。
[0090]2.1肥胖模型的建立及分组
[0091]将ICR小鼠随机分为正常对照组和高脂饲料组。正常组从实验开始到结束均给予普通饲料喂养，高脂饲料组给予高脂饲料喂养，造模维持2个月。造模结束后，取超出正常组小鼠平均体质量20%的小鼠为肥胖模型。筛选出合格小鼠40只，随机分为4组，分别给予溶剂、EGCGmg / kg组、1mg / kg利莫那班。正常组10只小鼠灌胃给予溶剂，给药维持4周。
[0092]2.2指标检测
[0093]首次给药后监测12h内累计食物消耗量，每小时记录I次。在整个实验周期内，每天记录每组小鼠的摄食量以及每只小鼠的体质量，并观察小鼠的活动情况。实验结束后禁食12h，摘除眼球取血，测定血清三酰甘油、总胆固醇。剥出全部右下腹股沟脂肪组织、生殖器周围脂肪组织并称重。取生殖器周脂肪2小块用4%甲醛液固定，石蜡切片，HE染色，t匕较相同视野内脂肪细胞形态。
[0094]2.3摄食量影响
[0095]EGCG30mg / kg小鼠摄食量在每个时间点都低于模型组。与利莫那班对12h内抑制小鼠摄食的效应类似。做不同给药剂量组研究发现，EGCG30mg / kg组抑制摄食量的作用最强。相比于模型组，12h内给药组的小鼠摄食量明显减少，30mg / kg以及1mg / kg利莫那班组小鼠12h的摄食量分别下降了 38.4%,43.0%。
[0096]4周内30mg / kgEGCG组抑制小鼠摄食量的作用最强，药物持续抑制了小鼠的摄食量，而正常组和模型组小鼠的摄食量并没有出现抑制作用。相同剂量下，利莫那班的食物抑制作用比EGCG略强。
[0097]2.4药物对小鼠体质量的影响
[0098]正常组和模型组小鼠的体质量维持稳定。EGCG组和利莫那班都具有降低肥胖小鼠体质量的作用。30mg / kgEGCG组对体质量的下降约8.0%。1mg / kg利莫那班作用强于EGCG作用。
[0099]2.5对小鼠体内脂肪含量的影响
[0100]相比于正常组，模型组小鼠体内脂肪含量显著增加。EGCG和利莫那班治疗后小鼠生殖器周边的脂肪重量下降，30mg / kgEGCG显著降低脂肪含量。
[0101]2.6对小鼠脂肪细胞体积的影响
[0102]模型组脂肪细胞直径较大，视野内细胞数较少；30mg / kgEGCG治疗后，小鼠脂肪细胞直径变小，细胞内脂肪含量较少较为明显。
[0103]2.7对小鼠血清三酰甘油及胆固醇含量的影响
[0104]高脂饮食诱导的肥胖小鼠血清胆固醇和三酰甘油的含量显著升高。EGCG30mg /kg剂量组治疗后，小鼠血清胆固醇和三酰甘油的含量显著下降。
[0105]3、EGCG对戒烟作用双盲实验研究
[0106]采用随机双盲安慰剂对照研究方法，将43例符合入组条件并签署知情同意书的吸烟者分为EGCG组(治疗组；200mg /片)和安慰剂组，EGCG组25例、安慰剂组18例，疗程12周；观察治疗期间不同时点戒烟成功率(吸烟量< I支/ d)、吸烟减少有效率(治疗期间吸烟量较治疗前减少> 50 %的比例)，并评定可视性渴求强度测评表；以尿可替宁和呼气一氧化碳浓度验证吸烟情况。
[0107]结果显示:治疗后，治疗组和安慰剂组戒烟成功率分别为47.19%和12.71%，吸烟减少有效率分别为37.41%和11.82%，两组差异具有统计学意义(P〈0.01);治疗第2?12周末治疗组渴求强度的得分、CO呼出量均小于安慰剂组(P〈0.01);治疗组尿可替宁含量在第8周和第12周低于安慰剂组(P〈0.01)。治疗期间两组志愿者均无严重不良事件发生。
[0108]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种CBl拮抗剂EGCG的制备方法，其特征在于，该拮抗剂EGCG制备方法包括步骤: 步骤一，重组人CBl真核表达载体的构建； 组织总RNA的提取:取脑组织称重108mg，加入1.0ml Trizol，放入匀浆器中于冰上研磨，转入1.5mlEP管,混勻，静置5min后加入200 μ I氯仿,低温离心机,4°C, 12000rpm,离心15min,取上层水相移入EP管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置lOmin，低温离心，加入Iml预冷的0.1 % DEPC水配制的75%乙醇洗涤沉淀，超净台风干30min，加入400 μ I DEPC处理水溶解沉淀，琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，判断RNA的完整性，紫外分光光度计测定OD值并计算RNA浓度，_80°C保存备用； 引物设计与合成:根据Genbank公布人CBl基因序列设计引物，在上游引物的5'加入HindIII酶切点，下游引物5'加入EcoR I酶切点，由上海英骏生物技术有限公司合成； pcDNA3.Ι-hCBl的构建:逆转录试剂盒逆转录得到总cDNA，进行PCR克隆CBl基因，反应条件:94°C预变性4min ;94°C变性30s ;56°C退火30s ;74°C延伸45s ;最后74°C延伸7min，预期片段长度1400bp，产物用I %琼脂糖凝胶电泳，切胶并用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收，回收的目的片段用HindIII和EcoR I双酶切2h，回收纯化，同时以HindIII和EcoRI酶酶切pcDNA3.1，回收纯化线性化质粒载体，将所获酶切片段以3:1比例用T4DNA Ligase在20°C连接24h，将连接产物转化到感受态DH5 α中，涂布含氨苄青霉素的LB固体培养基，挑取单个阳性克隆并扩增重组质粒，质粒试剂盒提取pcDNA3.Ι-hCBl，双酶切PCR鉴定，进行测序鉴定； CBl真核表达载体转染:将重组载体pcDNA3.Ι-hCBl瞬时转染入HEK293细胞，转染采用LipOfectamine2000试剂进行，转染后48h收集细胞，制备细胞裂解液和总RNA进行下一步分析； 步骤二，CBl高表达HEK293细胞膜及细胞膜色谱柱的制备: 取在37°C，5% C02及包和适度条件下，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，常规传代，细胞贴壁生长单层覆盖培养皿底部90%，0.25胰蛋白酶液消化，收集细胞，血球计数板计数，取8 X 16细胞,40C, 100g离心8min,加入1mL预冷磷酸缓冲液吹打混悬,条件同上离心lOmin，重复上述操作一次，倾出上清液加入8mL低渗缓冲液，冰块中匀浆，低温超声破膜30min，4°C条件下再次12000g离心20min，倾去上层液，加入5mLTris-HCl缓冲液重悬，备用，分光光度计680nm处测定组织样品和牛血清蛋白标准液，测定光密度值，考马斯亮蓝染色法测定膜蛋白含量，取色谱柱柱芯，制得CBl细胞色谱柱； 步骤三，亲和色谱分离、制备EGCG 将自制细胞膜色谱柱接到高效液相色谱仪，茶叶提取物用微孔滤膜0.45 μ m滤过，进样20yL，色谱条件为:柱温37°C ;流速0.5mL.mirT1，pH7.4，流动相磷酸盐缓冲液50mmol.mirT1,紫外检测波长280nm用流动相平衡2h后进样20 μ L分离，收集3.5-4.0min洗脱液，即获得CBl选择性拮抗剂EGCG。
2.如权利要求1所述的拮抗剂EGCG制备方法，其特征在于，CBl上游引物CNRl-f: 5' -CGGGATCCGCCACCATGAAGTCGATCCTAGATG-3'下游引物 CNRl-r:5' -GGAATTCCTTTTTCTGTGCAGCCACAA-3'。
3.如权利要求1所述的拮抗剂EGCG制备方法，其特征在于，拮抗剂EGCG的鉴定方法为: 红外光谱分析:红外光谱分析结果EGCG在1690CHT1处有一较强伸缩振动吸收峰u，在1190?1240CHT1处有一组较强的非对称伸缩振动吸收峰u，在1450?ΙΘΟΟαιΓ1处有苯环骨架特征振动吸收峰，光谱图与EGCG标准图谱一致，由此初步确认所获CBl拮抗剂物质为EGCG, 紫外吸收波长检测:取分离样品，用紫外可见光色谱仪测定最大吸收波长，发现在273.4nm处有最大吸收； 高效液相色谱法分析:采用C18色谱柱，流动相为甲醇:水:乙酸(23:75:2，v/v)，流速1.0mL.mirT1，柱温35°C，检测波长为272nm，高效液相色谱法定量分析亲和色谱法所分离EGCG纯度达到98%以上； 核磁共振分析=EGCG 的核磁共振图谱 3.00 (IH).5.11 (IH)，5.53 (IH)，6.05 (2H)，6.65 (2H), 7.09 (2H)。
4.如权利要求1所述的拮抗剂EGCG制备方法，其特征在于，拮抗剂EGCG的使用方法为:水溶剂溶解后，给大鼠使用，给药途径为腹腔注射/ 口服。
5.一种用权利要求1-4任意一项所述的CBl拮抗剂EGCG的制备方法制备的脑血管疾病、戒烟和减肥药物。
【文档编号】C07D311/62GK104250241SQ201310566708
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】李晶, 封玉玲, 肖忠华 申请人:重庆三峡医药高等专科学校