含有t-细胞表位的b细胞受体复合体结合蛋白质的制作方法
【专利摘要】本发明涉及这样的多肽，其包含a)结合选自CD22、CD19、CD20和CD21的至少一种蛋白质的结合肽，和b)包含至少一个T-细胞表位的免疫原性肽，其用于针对B-细胞过度增殖接种受试者或用于在受试者中调节免疫应答。本发明进一步涉及编码所述多肽的多核苷酸和载体及包含其的宿主细胞。本发明还涉及用于刺激抗原特异性T-细胞的方法，其包括a)使抗原呈递细胞(APC)与本发明的多肽、多核苷酸或载体接触，b)使所述APC与T-细胞接触，和c)由此刺激对所述至少一个T-细胞表位特异的抗原特异性T-细胞；涉及用于针对B-细胞过度增殖免疫受试者的方法、用于针对传染物免疫受试者的方法，和用于在受试者中诱导耐受性的方法。
【专利说明】含有τ-细胞表位的B细胞受体复合体结合蛋白质
[0001]本发明涉及这样的多肽，其包含a)结合选自⑶22、⑶19、⑶20和⑶21的至少一个蛋白质的结合肽，和b)包含至少一个T-细胞表位的免疫原性肽，其用于针对B-细胞过度增殖接种受试者或用于在受试者中调节免疫应答。本发明进一步涉及编码所述多肽的多核苷酸和载体及包含该多肽的宿主细胞。其还涉及用于刺激抗原特异性T-细胞的方法，其包括a)使抗原呈递细胞(APC)与本发明的多肽、多核苷酸或载体接触，b)使所述APC与T-细胞接触，和c)由此刺激对所述至少一个T-细胞表位特异的抗原特异性T-细胞；涉及用于针对B-细胞过度增殖免疫受试者的方法、用于针对传染物免疫受试者的方法，和用于在受试者中诱导耐受性的方法。
[0002]通过免疫，受试者的免疫系统针对抗原变得强化。尤其是，适应性免疫系统(即赋予个体免疫系统识别、记忆和处理潜在病原体能力的免疫系统的一部分)已经具有强大的医学重要性(Kaech 等(2002)，Nature Reviews Immunology 2 (4): 251-62 ;Pulendran 和Ahmed(2006), Cell 124(4):849-63)。一方面，适应性免疫系统已经被广泛开发用于接种，以赋予针对另外潜在致死疾病的免疫性。其也已经用于通过识别肿瘤抗原消除癌细胞，取得了一定的成功。另一方面，适应性免疫系统的衰减在这样的疾病，像例如变态反应、哮喘或自身免疫性疾病中具有重要性，在所述疾病中强免疫应答是不合适的。
[0003]尽管接种整体上成功，但是存在若干引起疾病的物质，像病毒(例如人免疫缺陷病毒、病毒)、细菌(例如，葡萄球菌种(Staphylococcus spec.) >Borellia spec.)、真核病原体(例如锥虫种(Trypanosoma spec.)),还有癌细胞,其已经难以易于接种。其原因是复杂的并且在很大程度上取决于特定物质的性质，还取决于待接种的个体的生理状态。对于一些引起疾病的物质，已经设计在接种过程中强化免疫应答的方法，像使用病毒样颗粒代替可溶性抗原、包括佐剂、使用活疫苗等。还建议通过向专门的抗原呈递细胞，即巨噬细胞、树状细胞和B-细胞递送合适的表位(其通常是肽)来加强免疫应答。
[0004]B-细胞在免疫系统中的主要作用是在其激活后产生抗原特异性抗体。激活需要B-细胞表面上的B-细胞-受体(BCR)开始结合其近亲抗原。BCR的这种激活导致B-细胞的激活，其经历成熟和克隆扩张，随后以这种方式产生的部分细胞变成产生对所述抗原特异的抗体的浆细胞。BCR介导该激活；其由能够特异地识别一种抗原结构的膜结合抗体分子与若干共同受体(包括⑶21和⑶19) 一起组成。已知B-细胞的两个其他表面分子⑶20和CD22至少短暂地与BCR相互作用并分别充当正调节物和负调节物。因此，在更广泛意义上可以认为它们是BCR复合体(BCRC)的成员。全部四个分子共有的是其内在化到细胞质囊泡中及其在配体结合后与内体融合。
[0005]适应性免疫系统的另一个重要分支是表位特异性T-细胞。在人中，这些细胞在其表面上具有T-细胞-受体，其识别结构域对抗原性肽(T-细胞表位)和主要组织相容性复合体(MHC)蛋白质之间的确定的复合体特异。如果T-细胞-受体参与近亲相互作用，那么所述T-细胞在免疫应答中变成激活的、增殖并执行其激活或抑制任务。
[0006]MHC分子有两种形式:MHC类型I在每个人细胞的表面上表达并基本上随机呈递来自细胞溶胶中存在的蛋白质的肽；因此它们给出了细胞蛋白质所有组成成分的连续概貌并允许例如在细胞的病毒感染或致癌作用中识别非正常的蛋白质表达。为了识别MHC类型I分子-肽复合体，T-细胞受体需要CD8表面蛋白质作为共同受体。因此存在表达CD8共同受体的T-细胞的亚类，称为CD8+-T-细胞；其主要但非唯一的功能是清除呈递肽的体细胞，其表明所述细胞中的潜在的致病过程，例如病毒感染，这是为什么它们也称为细胞毒性T-细胞的原因。
[0007]MHC类型II仅在专职性抗原呈递细胞(APCs)上表达。在这些细胞上，呈递这样的肽，其来自APCs主要通过内吞作用摄入的蛋白质。MHC类型II的识别需要共同受体⑶4，其仅在⑶4+T-细胞的表面上表达。这些T-细胞，也称为T-辅助细胞的主要作用是激活⑶8+-T-细胞、巨噬细胞和B-细胞。适当的表位递送至APCs因此导致这些表位通过MHC类型II呈递到辅助T-细胞，其继而激活这些T-细胞并导致免疫系统的其他分支激活。重要的是，存在这样的实验证据:与B细胞受体单独参与相比，CD19/CD21复合体的共同参与导致抗原更迅速和有效地产生抗原性肽/类型II复合体(Fearon DT等(2000)，Annu RevTmmunol 18:393-422)。
[0008]迄今为止用于向APCs递送表位的方法已经包括温育APCs与可溶性抗原、利用活的衰减微生物进行感染、利用来自牛痘或其他病毒的病毒载体进行感染，和注射DNA疫苗。然而利用这些方法的结果并非在所有情况下均令人满意。
[0009]同样，去除或抑制APCs，尤其是B-细胞已经用于在这样的疾病中衰减适应性免疫应答，在所述疾病中存在过度反应(例如变态反应)或错误导向的反应(例如自身免疫性疾病)。然而，在目前可用治疗的情况下，这些疾病在许多情况下不能被令人满意地治疗。
[0010]因此仍然存在对改善的疫苗和其他免疫调节物的需要。可以认为本发明的技术问题是提供手段和方法，其允许改善的接种和免疫调节。通过权利要求和下文中表征的实施方案解决所述技术问题。
[0011]因而，本发明涉及多肽，其包含a)结合选自⑶21、⑶19、⑶20和⑶22的至少一个蛋白质的结合肽，和b)包含至少一个T-细胞表位的免疫原性肽，其用于在受试者中调节免疫应答。
[0012]如本说明书中所用，术语“多肽”涉及任何化学分子，其包含如下文所明确说明的至少结合肽和至少一个免疫原性肽。应该理解，结合肽和免疫原性肽之间的化学键不必是肽键。本发明还考虑，结合肽和免疫原性肽之间的化学键是酯键、二硫键，或技术人员已知的任何其他合适的共价化学键。还考虑的是具有如此低的解离常数的非共价键，以至于免疫原性肽将仅从结合肽上解离可忽略的程度。优选地，对于所述非共价键的解离常数是小于10_5mol/l (如在Strep-Tag: Strep-Tactin结合时是这种情况)、小于10_6mol/l (如在Strep-TagI1: Strep-Tactin 结合时是这种情况)、小于 lCT8mol/l、小于 lCrlclmol/l、或小于10_12mol/l(如对链霉抗生物素:生物素结合而言是这种情况)。确定解离常数的方法为本领域技术人员所熟知并包括，例如分光滴定方法、表面等离振子共振测定法、平衡透析等。优选地，结合肽与免疫原性肽之间的化学键是肽键，即多肽是包含或由本发明的结合肽和免疫原性肽组成的融合多肽。优选地，多肽不包含已知抑制抗原呈递的一个或多个肽序列。此外，优选地，多肽不包含遗传物质，即多核苷酸。在优选的实施方案中，多肽由本文所述的组分组成。
[0013]如本文所用的术语“结合肽”指结合B-细胞受体复合体(BCRC)的至少一个蛋白质的任何肽，其中BCRC的蛋白质优选为CD21、CD19、CD20和CD22，其具有允许所述结合肽被B-细胞内在化的亲和力。优选地，所述结合肽结合B-细胞受体复合体的所述蛋白质的解离常数小于 l(T5mol/l、小于 l(T6mol/l、小于 l(T7mol/l、小于 l(T8mol/l 或小于 l(T9mol/l。优选地，结合肽是EB病毒(EBV，也称为人类疱疹病毒4)糖蛋白gp350/220(gp350，基因:SEQID NO:1, Genbank Acc No:NC_009334.1G1: 139424470,蛋白质产物 SEQ ID NO: 2, GenbankAcc No:YP_001129462.1G1: 139424497) N末端的肽，更优选地结合肽包含EBV gp350的前470个氨基酸或EBV gp350的另一⑶21结合肽。在另一优选的实施方案中，结合肽是结合上文明确说明的B-细胞受体复合体蛋白质(BCRC蛋白质)的至少一个的抗体。优选的结合肽是:
[0014]-小鼠抗人CD21 抗体，其包含 Genbank Acc No:GQ850526.1G1: 282721923，SEQ IDN0.13编码的重链(SEQ ID NO: 25)，并包含Genbank Acc No:GQ850527.1G1: 282721925，SEQID N0.14 编码的轻链(SEQ ID NO: 26)；
[0015]-小鼠抗人CD19 抗体，其包含 Genbank Acc No:X99230.1G1: 1435158，SEQ IDNO: 37编码的重链可变片段(例如SEQ ID NO: 27的重链，由SEQ ID N0.15编码)，并包含Genbank Acc No:X99232.1G1: 1435165，SEQ ID NO: 38 编码的轻链可变片段(例如 SEQ IDNO:28的轻链，由SEQ ID N0.16编码)；
[0016]-小鼠抗人CD22 抗体，其包含 Genbank Acc No: S77347G1: 998423, SEQ ID NO: 39编码的重链可变片段(例如SEQ ID Ν0:29的重链，由SEQ ID N0.17编码)，并包含GenbankAcc No:S77340G1:998421, SEQ ID NO:40 编码的轻链可变片段(例如 SEQ ID N0:30 的轻链，由 SEQ ID N0.18 编码)；
[0017]-小鼠抗人CD20 抗体，其包含 Genbank Acc No:AY058907.1G1: 16902039，SEQ IDΝ0:41编码的重链可变片段(例如SEQ ID NO:31的重链，由SEQ ID N0.19编码)，并包含Genbank Acc No:AY058906.1G1: 16902037，SEQ ID NO: 42 编码的轻链可变片段(例如 SEQID NO:32 的轻链，由 SEQ ID N0.20 编码)。
[0018]如本文所用，术语“抗体”指来自种类IgA、IgD、IgE、IgG或IgM任一类的可溶性免疫球蛋白。可以通过所熟知的方法，使用纯化的蛋白质或来源于所述纯化蛋白质的合适片段作为抗原来制备针对BCRC蛋白质的抗体。可以通过本领域所熟知的抗原性决定算法鉴定适合作为抗原的片段。可以从本发明的多肽通过蛋白质水解消化获得此类片段或者此类片段可以是合成肽。优选地，适合作为抗原的肽在其天然环境中定位在B-细胞的外部。优选地，本发明的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人或人源化抗体或灵长类抗体、嵌合抗体或其片段。更优选地，抗体是单链抗体。本发明的抗体还包含双特异性抗体、合成抗体、抗体片段，如Fab、Fv或scFv片段等，或这些中任何一种的化学修饰衍生物。优选地，本发明的抗体应该特异性地结合(即不与其他多肽或肽交叉反应)本发明的BCRC蛋白质。可以通过多种熟知的技术测试特异性结合。可以使用例如Harlow和Lane "Antibodies, A LaboratoryManual〃，CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988中描述的方法获得抗体或其片段。可以通过 Kohler 和 Milstein (1975), Nature 256, 495 ;和 Galfre (1981), Meth.Enzymol.73, 3 中最初描述的技术制备单克隆抗体，其包括将小鼠骨髓瘤细胞融合到来自免疫的哺乳动物的脾细胞中。
[0019]优选地，结合肽在氨基酸序列上与免疫原性肽邻接，即该结合肽与该免疫原性肽形成融合多肽。更优选地，融合多肽包含融合到抗体的重链或轻链上的免疫原性肽。最优选地，融合多肽包含来自融合到结合BCRC蛋白质的小鼠抗体的重链上的EBV EBNA3C的免疫原性肽，例如SEQ ID N0:33(融合到EBNA3C-5H11表位上的抗-CD21重链，由SEQ ID NO: 21编码)、SEQ ID NO:34(融合到EBNA3C-5H11表位上的抗-CD19重链，由SEQ ID NO:22编码)、SEQ ID NO: 35 (融合到EBNA3C-5H11表位上的抗-CD22重链，由SEQ ID NO: 23编码)或SEQ ID N0:36(融合到EBNA3C-5H11表位上的抗-CD20重链，由SEQ ID NO: 24编码)的融合蛋白质。然而，本发明还考虑的是，结合肽优选在氨基酸序列上与结合上文所述的免疫原性肽的衔接分子邻接。本领域技术人员清楚的是，在这种情况下，免疫原性肽优选包含衔接分子，其适合于共价或非共价结合融合到结合肽上的衔接分子，例如优选地，该结合肽融合到Strep-Tag上并且该免疫原性肽融合到Strep-Tactin上。
[0020]如本文所用的术语“⑶21”指人分化蛋白质簇21，也称为补体受体2(CR2)(转录物变体 1:SEQ ID NO:3, Genbank Acc No:ΝΜ_001006658.2G1: 260099695,蛋白质产物 SEQ ID NO:4, Genbank Acc No:NP_001006659.1G1: 54792123 ;转录物变体 2: SEQ IDNO: 5，Genbank Acc.NM_001877.4G1: 260099700,蛋白质产物 SEQ ID NO:6, Genbank AccΝο:ΝΡ_001868.261:42544177)。术语 “CD19” 指人分化蛋白质簇 19 (转录物 SEQ IDNO: 7, Genbank Acc No:ΝΜ_001178098.1G1: 296010920 ;蛋白质产物 SEQ ID NO: 8, GenbankAcc No:NP_001171569.1G1: 296010921)。术语 “CD20” 指人分化蛋白质簇 20 (转录物 SEQID NO: 9, Genbank Acc No:NM_152866.2G1:68348720 ;蛋白质产物 SEQ ID NO: 10，GenbankAcc No:NP_068769.2G1:23110987)。术语 “CD22” 指人分化蛋白质簇 22 (转录物 SEQ IDNO: 11，Genbank Acc No:NM_001771.3G1: 297374826 ;蛋白质产物 SEQ ID NO: 12，GenbankAcc No:NP_001762.2G1:157168355)。本发明考虑的是，用于 BCRC 蛋白质 CD21、CD19、CD20和CD22的术语还应该包括哺乳动物中各蛋白质的同源物、直向同源物和天然存在的变体(例如从剪接变体翻译的变体)。
[0021]如本文所用的术语“免疫原性肽”指包含至少一个T-细胞表位的肽。如本领域技术人员所知，T-细胞表位是肽中包含的邻接的氨基酸序列，其可以结合主要组织相容性复合体(MHC)类型I或类型II分子，以呈递于细胞(MHC-1)或专职性抗原呈递细胞(MHC-1I)的表面上。技术人员知道怎样预测MHC-1或MHC-1I上呈递的免疫原性肽(Nielsen 等，(2004), B1informatics, 20(9), 1388 - 1397), Bordner (2010), PLoS ONE5(12):el4383)以及怎样评估特异性肽的结合(例如Bernardeau等，(2011), J ImmunolMethods, 371 (1-2):97-105)。优选地，T-细胞表位是MHC-1I表位。优选地，T-细胞表位是来自肿瘤抗原的表位，即基本上仅在肿瘤细胞中或肿瘤细胞上表达的蛋白质包含的氨基酸序列。在优选的实施方案中，T-细胞表位是来自B-细胞淋巴瘤肿瘤抗原的表位。更优选地，T-细胞表位是来自EBV的潜在基因产物的表位。更优选地，T-细胞表位是已知或怀疑促进细胞转化的EBV的潜在基因产物之一，即EBV EBNA2、LMP1、EBNA3A、-B和-C蛋白质之一中包含的氨基酸序列(Long等(2011)，Curr Opin Immunol 23 (2): 258-64)。在优选的实施方案中，T-细胞表位是如下文详述的强T-细胞表位。
[0022]如本说明书中所用，术语“免疫应答的调节”指通过应用本发明的多肽在受试者的适应性免疫系统的应答中诱导改变。调节可以是激活，即导致对T-细胞表位的增强的应答；或调节可以是抑制，即导致对T-细胞表位的降低应答，例如耐受性。免疫应答的调节优选实现受试者中病症或疾病或其伴随症状显著程度地改善，或者还优选地，免疫应答的调节实现受试者疾病或病症方面的健康维持一段时间。如本文所用的免疫应答调节的所述实现还包括疾病或病症方面的健康的完全恢复。还应理解的是，根据本发明使用的免疫应答的调节可能并不是对所有待治疗的受试者均有效。然而，所述术语应该需要患有疾病或病症的受试者中统计学上显著的一部分可以被成功治疗或者一群受试者或群体受试者中统计学上显著的一部分被有效防止患上疾病或病症或其伴随症状。本领域技术人员可以使用多种熟知的统计学评估工具，例如确定置信区间、P-值确定、斯氏t-检验、Mann-Whitney检验等容易地确定一部分是否在统计学上显著。优选的置信区间是至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。P-值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，免疫应答的调节应该对至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %的给定一群受试者或群体受试者有效。优选地，免疫应答的调节是针对传染物接种、针对B-细胞过度增殖接种，或诱导对引起自身免疫性疾病的抗原的耐受性。
[0023]如本文所用，术语“传染物”优选指在受试者中引起疾病的微生物。优选地，传染物是细菌、真核传染物，例如疟原虫种(Plasmodium spp.)，更优选病毒，例如肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒(HIV)。在优选的实施方案中，传染物是引起慢性疾病的物质。更优选地，传染物是引起慢性和/或持久性感染的物质。仍然更优选地，传染物是通过调节所述传染物的至少一个抗原决定簇而引起慢性和/或持久性感染的物质。最优选地，上述抗原决定簇的至少5个、至少10个、至少15个、至少20个受调节形式是已知的，优选已知存在于受试者的身体中。在其他优选的实施方案中，上述受调节的抗原决定簇是多肽。
[0024]如本文所用，术语“B-细胞过度增殖”指与正常相比B-细胞增加的增殖。优选地，B-细胞过度增殖是EBV相关的疾病，包括传染性单核细胞增多或移植后淋巴组织增生病(PTLD)或B-细胞淋巴瘤。
[0025]如本文所用，术语“诱导耐受性”指在受试者中诱导对免疫原性肽的降低的应答。优选地，在患有或具有患有自身免疫性疾病的受试者中诱导耐受性。还优选地，诱导对免疫原性肽的耐受性，已知针对所述免疫原性肽的免疫应答加重所述自身免疫性疾病。优选的自身免疫性疾病是多发性硬化症、类风性关节炎或自身免疫性甲状腺炎，或其免疫反应的T细胞表位已经被鉴定的其他自身免疫性疾病。
[0026]在其他优选的实施方案中，本发明涉及如下文定义的多肽池、如下文定义的多核苷酸池，和如下文定义的载体池。
[0027]通过应用本发明的多肽实现的调节类型取决于若干因素:APC的类型对免疫应答的结果具有显著影响；静止B淋巴细胞通常诱导耐受性，然而树突细胞和激活的B胚细胞如免疫母细胞诱导激活。因而，激活的B细胞如B细胞淋巴瘤的靶向导致T细胞识别并最终导致其被清除。相反，具有自身抗原的静止B细胞的靶向导致其耐受性。所递送抗原的剂量也起重要的作用；非常低和高的抗原量趋向于诱导耐受性，中间量导致T细胞激活。此夕卜，靶向CD19、CD21或CD20的抗体或多肽的免疫刺激效果或相反针对CD22抗体的B免疫抑制效果也将影响抗原递送的结果。
[0028]术语“受试者”指动物，优选哺乳动物生物体，其具有针对分子产生免疫应答的能力，所述分子对生物体而言是外源的并且包含至少一个BCRC蛋白质。更优选地，受试者是牛、猪、绵羊、马、猫、狗、小鼠或大鼠，最优选是人类。
[0029]上文给出的定义已作修改后应用于下文:
[0030]本发明还涉及编码结合肽的多核苷酸，所述结合肽共价连接免疫原性肽或结合免疫原性肽的衔接分子。
[0031]根据本发明使用的术语“多核苷酸”优选指包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码包含如上文详细说明的结合肽和免疫原性肽的融合多肽，或其编码包含如上文详细说明的结合肽和衔接肽的融合多肽。在所附实施例或(Adhikary等(2006)，J.Exp.Med.203(4):995-1006 ;Busse 等(2010)，J.Virology 84(2): 1139-47 ；Gurer 等(2008), Blood 112(4):1231-9)中描述了用于测定上文提及的结合肽和免疫原性肽的活性的合适测定法。已经根据本发明使用熟知的技术将免疫原性肽克隆到特异性结合BCRC的蛋白质的多肽中来获得编码包含上述肽的融合多肽的多核苷酸。
[0032]因此，多核苷酸优选包含编码具有如SEQ ID NO:33_36中所示的氨基酸序列的多肽的SEQ ID N0:21-24中所示的核酸序列。应该理解的是，具有如SEQ ID N0:21_24中所示的氨基酸序列的多肽由于简并性遗传密码同样还可以由其他多核苷酸编码。
[0033]此外，如根据本发明使用的术语“多核苷酸”进一步包括上述特定多核苷酸的变体。多核苷酸变体优选包含这样的核酸序列，其特征在于所述序列可以来自SEQ IDNO:21-24中所示的上述特定核酸序列，其具有至少一个核苷酸取代、添加和/或缺失，由此所述变体核酸序列应该仍然编码包含上文详细说明的活性的多肽。变体包括包含这样的核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列与SEQ ID NO: 21-24中所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的同一性。此夕卜，还包括的是包含编码这样的氨基酸序列的核酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQID NO:33-36中所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的同一性。优选在完整氨基酸或核酸序列区域上计算百分比同一性值。本领域技术人员可获得基于多种算法的一系列程序用于比较不同的序列。在该背景中，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出了特别可信的结果。为了进行序列比对，待使用程序PileUp(J.Mol.Evolut1n.，25，351-360，1987，Higgins等，CABI OS, 51989:151-153)或程序 Gap 和 BestFit [Needleman 和 Wunsch (J.Mol.B1l.48 ；443-453 (1970))以及 Smith 和 Waterman (Adv.App 1.Math.2 ;482_489 (1981))],其为 GCG软件包的一部分[Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711 (1991)]。待优选使用程序GAP在完整序列区域上利用以下设置来确定上文以百分比(％)说明的序列同一'注:空位加权:50，长度加权:3，平均匹配:10.000和平均错配:0.000，除非另有详细说明，其应该总是用作序列比对的标准设置。
[0034]包含上述核酸序列任何一个的片段的多核苷酸也包括为本发明的多核苷酸。片段应该编码仍然具有如上文详细说明的活性的多肽。因此，多肽可以包含或由赋予所述生物活性的本发明的肽组成。如本文表示的片段优选包含上述核酸序列的至少50、至少100、至少250或至少500个连续核苷酸或编码包含上述氨基酸序列的至少20、至少30、至少50、至少80、至少100或至少150个连续氨基酸的氨基酸序列。
[0035]本发明的多核苷酸基本上由上述核酸序列组成或包含上述核酸序列。因此，它们也可以含有其他核酸序列。尤其是，本发明的多核苷酸可以编码融合蛋白质，其中所述融合蛋白质的一个配偶体是由上文说明的核酸序列编码的多肽。此类融合蛋白质可以包含其他多肽作为额外部分用于监测表达(例如绿色、黄色、蓝色或红色荧光蛋白质、碱性磷酸酶等)或所谓的“标签”，其可以充当可检测标志物或辅助测定用于纯化目的。用于不同目的的标签为本领域所熟知并包含FLAG-标签、6-组氨酸标签、MYC-标签等。
[0036]本发明的多核苷酸应该优选地提供为分离的多核苷酸(即从其天然环境中分离的)或是遗传修饰的形式。多核苷酸优选为DNA,包括cDNA或RNA。该术语包括单链以及双链多核苷酸。此外，还包含的是化学修饰的多核苷酸，包括天然存在的修饰多核苷酸，如糖基化的或甲基化的多核苷酸或人工修饰的一种，如生物素化的多核苷酸。
[0037]本发明进一步涉及包含本发明的多核苷酸的载体。
[0038]术语“载体”优选包括噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体，如细菌或酵母人工染色体。此外，该术语还涉及靶向构建体，其允许靶向构建体随机或位点定向整合到基因组DNA中。此类靶向构建体优选包含足够长度的DNA用于下文详细描述的同源或异源重组。包括本发明的多核苷酸的载体优选进一步包含选择标记用于在宿主中的繁殖和/或选择。可以通过本领域所熟知的多种技术将载体掺入到宿主细胞中。例如，质粒载体可以以沉淀如磷酸I丐沉淀或氯化铷沉淀或与带电荷脂质的复合体或基于碳的簇,如呋仑碳(fullerens)来引入。或者，质粒载体可以通过热激或电穿孔技术来引入。如果载体是病毒，那么其可以在应用于宿主细胞之前使用适当的包装细胞系在体外进行包装。逆转录病毒载体可以是有复制能力的或复制缺陷的。在后一种情况下，病毒繁殖一般将仅发生在互补性宿主/细胞中。
[0039]更优选地，在本发明的载体中，多核苷酸有效连接允许在原核或真核细胞中表达的表达控制序列或其分离的部分。所述多核苷酸的表达包含多核苷酸优选转录成可翻译的mRNA。保证在真核细胞,优选哺乳动物细胞中表达的调节元件为本领域所熟知。它们优选包含保证转录起始的调节序列，和任选地保证转录终止和转录物稳定的多聚-A信号。额外的调节元件可以包括转录以及翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可能调节元件包含例如大肠杆菌(E.coli)中的lac、trp或tac启动子,并且允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实例是酵母中的AOXl或GALl启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或珠蛋白内含子。此外，诱导型表达控制序列可以用于本发明包括的表达载体。此类诱导型载体可以包含tet或Iac操纵基因序列或由热激或其他环境因素诱导的序列。合适的表达控制序列为本领域所熟知。除负责转录起始的元件外，此类转录元件还可以包含转录终止信号，如多核苷酸下游的SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。在该背景中，合适的表达载体为本领域所知，如 Okayama-Berg cDNA 表达载体 pcDVl (Pharmacia)、pBluescript (Stratagene)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNAl、pcDNA3 (InVitrogene)或 pSPORTl (GIBCO BRL)。优选地，所述载体是表达载体和基因转移或靶向载体。来自病毒，如逆转录病毒、牛痘病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒或牛乳头状病毒的表达载体可以用于向靶向细胞群递送本发明的多核苷酸或载体。本领域技术人员所熟知的方法可以用于构建重组病毒载体；参阅例如，Sambrook, MolecularCloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.andAusubeI, Current Protocols in Molecular B1logy, Green Publishing Associates andWiley Interscience, N.Y.(1994)中描述的技术。
[0040]优选地，载体是介导本发明的多核苷酸在宿主细胞中表达的载体。技术人员知道怎样选择用于繁殖载体和/或表达载体编码的蛋白质的载体和宿主细胞的组合。
[0041]此外，本发明涉及包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。
[0042]如本文所用，“宿主细胞”指具有繁殖本发明的载体和/或产生在本发明的载体或多核苷酸上编码的多肽能力的细菌、古细菌(archaeal)或真核细胞。优选地，宿主细胞是来自物种大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌细胞、鳞翅类、小鼠、大鼠或人细胞的细胞。优选地，宿主细胞是在体外培养的细胞，更优选293HEK细胞。还优选地，宿主细胞是APC，更优选B-细胞，最优选来自淋巴结的激活B-细胞、类淋巴母细胞、静止B-细胞或来自淋巴瘤的赘生性B细胞。
[0043]本发明涵盖用于刺激抗原特异性T-细胞的方法，其包括a)使抗原呈递细胞(APC)与本发明的多肽、多核苷酸或载体接触，b)使所述APC与T-细胞接触，和c)由此刺激对所述至少一个T-细胞表位特异的抗原特异性T-细胞。
[0044]本发明的方法优选为体外方法。此外，其可以包括除上文明确提及的那些步骤以外的步骤。例如，其他步骤可以涉及例如，对于步骤a)分离抗原呈递细胞(APC)或在步骤
b)中包括T-细胞刺激剂。
[0045]如本文所用，术语“抗原”涉及所选作为本发明的T-细胞表位来源的蛋白质。术语“抗原特异性T-细胞”涉及在其表面上呈递T-细胞受体分子的T-细胞，所述T-细胞受体分子特异性识别，即结合在MHC分子背景中呈递的本发明的T-细胞表位。优选地，MHC分子是MHC类型II分子；因此，优选地，T-细胞是⑶4+T-细胞。
[0046]如本发明方法背景中使用的术语“接触”为技术人员所理解。优选地，该术语指引起本发明的多肽、多核苷酸、载体或细胞与受试者，或优选细胞物理接触，即允许上述组分相互作用。
[0047]如本文所用，术语“抗原呈递细胞”或“APC”指在其表面上表达BCRC蛋白质的至少一个的B-细胞或滤泡树突细胞。优选地，APC是B-细胞，更优选来自淋巴结的激活B-细胞、类淋巴母细胞、静止B-细胞或例如来自淋巴瘤的赘生性B细胞。
[0048]本发明还包括的是用于针对传染物免疫受试者的方法，其包括a)使所述受试者与本发明的多肽、多核苷酸或载体池接触，和b)由此针对传染物免疫所述受试者。
[0049]如本文所用，术语“多肽池”指本发明的多肽集合，其包含选自见于患者的免疫原性肽文库的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个不同的免疫原性肽，所述患者长期感染特定的传染物。技术人员知道怎样建立所述免疫原性妝文库(Reineke, U.,等(2002) J.1mmunol.Methods.267 (I): 37-51 !Milosevic, S.,等(2006), J.Virol.80 (21): 10357-10364 ；Pedroza-Roldan, C.,等(2009)，47:270-282)。术语“多核苷酸池”和“载体池”待修改后而被理解。
[0050]本发明涉及用于针对B-细胞过度增殖免疫受试者的方法，其包括a)使所述受试者与包含强T-细胞表位作为免疫原性肽的多肽、包含编码强T-细胞表位的序列的本发明的多核苷酸，或包含编码强T-细胞表位的序列的本发明的载体接触，和b)由此针对B-细胞过度增殖免疫所述受试者。
[0051 ] 术语“强T-细胞表位”指这样的T-细胞表位，对其而言，在受试者中存在识别所述T-细胞表位的T-细胞的概率高。优选地，识别强T-细胞表位的T-细胞以高频率存在于受试者中。优选地，从通常感染所述受试者的病毒的蛋白质或针对其已经接种所述受试者的病毒的蛋白质选择T-细胞表位。更优选地，从用于免疫的病毒蛋白质选择强T-细胞表位。最优选的强T-细胞表位例如来自EBV潜在抗原，如EBNA-3C 3H10肽(VVRMFMRERQLPQS，SEQID NO:43)。
[0052]本发明还涉及用于在受试者中诱导耐受性的方法，其包括a)使所述受试者与诱导耐受性的多肽、编码诱导耐受性的多肽的多核苷酸，或编码诱导耐受性的多肽的载体接触，和b)由此在受试者中诱导耐受性。
[0053]如本文所用，术语“诱导耐受性的多肽”指本发明的多肽，其在受试者中诱导降低的针对免疫原性肽的应答。优选地，诱导耐受性的多肽包含作为结合体的识别CD22的结合肽，更优选地，所述诱导耐受性多肽是融合到免疫原性肽上的抗CD22抗体。
[0054]该说明书中引用的所有参考在其完整公开内容以及该说明书中特别提及的公开内容方面被引入作为参考。
[0055]图注:
[0056]图1:利用EBV转化的B细胞(LCLs)作为抗原呈递细胞进行的T细胞测定，并利用与来自EBV EBNA3C蛋白质的5H11表位或与其各自重链(HC)融合的不同量的抗体进行脉冲。所测试的抗体对⑶21、⑶19和⑶22特异。阳性对照包括与5H11肽表位温育的细胞，阴性对照包括没有抗原的抗⑶19、抗⑶21或抗⑶22抗体。以皮克IFN- y /ml给出结果。
[0057]表2:利用EBV转化的B细胞(LCLs)或伯基特淋巴瘤细胞系AG876作为抗原呈递细胞进行的T细胞测定，并利用与来自EBV EBNA3C蛋白质的3H10表位融合的多种量的⑶21特异性抗体进行脉冲。阳性对照包括与3H10肽表位温育的细胞，阴性对照包括没有3H10的抗⑶21抗体或没有轻链的3H10抗⑶21融合蛋白质。以皮克IFN- y /ml给出结果。
[0058]图3:利用包含EBNA3C-3H10的本发明的多肽处理EBV转化的B细胞(LCLs)或伯基特淋巴瘤细胞系导致抗原呈递和有效的T细胞激活。利用装载EBNA3C表位的IngB-细胞靶向的抗体(α⑶-21、-20、-19和-22)处理B细胞24小时。阳性对照包括单独用增加量(Ing-1yg)的3Η10肽脉冲的细胞，并且阴性对照包括未处理的细胞，或用不含EBNA3C-3H10表位的抗体脉冲的细胞。处理后，B细胞与EBN3C-3H10特异性的T细胞克隆以1:2的比例混合。24小时后，通过ELISA测定IFN Y的分泌作为T细胞激活的指示。以pg/ml给出结果。
[0059]图4:包含EBNA3C-3H10的本发明的多肽的抗原呈递导致⑶4+T细胞杀死肽特异性细胞。用EBNA3C-3H10-装载的a CD19抗体(CD19_3H10Ab ;Ing和1ng)、不含表位的a CD19抗体(CD19Ab)或EBNA3C肽处理LCLs，或者保持不被处理。然后用51Cr标记这些靶细胞并与EBNA3C-3H10特异性效应T细胞以递增的效应子:靶标比例(1: 1、3: 1、6: 1、12: 1、25:1,50:1)共同温育4小时。进行51Cr释放测定以确定靶标LCL群体的％裂解作为特异性细胞杀死的量度。
[0060]图5:用于实施例5的小鼠实验的MCMV感染、淋巴瘤细胞递送和抗体处理的一般方案。
[0061]以下实施例应该仅阐明本发明。它们无论如何不应该解释为限制本发明的范围。
[0062]实施例1
[0063]针对⑶21、⑶19和⑶22的抗体与来自EB病毒潜在抗原EBNA3C的抗原性表位(5H11)融合。融合蛋白质用于将表位引入到EB病毒转化的B细胞(类淋巴母细胞细胞系，LCLs)的内体中。脉冲的B细胞然后与对EBNA3C 5H11表位特异的T细胞克隆共同培养。通过测定上清液中干扰素Y释放来评估T细胞激活。
[0064]直接与5H11表位温育的LCLs用作阳性对照。没有轻链的抗体5H11融合蛋白质用作阴性对照，和不与表位融合的抗体一样。
[0065]携带20pg的5H11的Ing的⑶21-5H11融合蛋白质引发与利用I μ g的肽获得的免疫应答相当的免疫应答(图1)。因而，激活的B细胞上的抗原呈递效率在与CD21抗体融合后比仅与表位融合后高50.000倍。利用⑶19、⑶20和⑶22特异性抗体获得了相似的结果。重要的是要指出，未处理的EBV无限增殖化的B细胞不能在类型II途径上呈递5H11。
[0066]实施例2
[0067]LCLs和伯基特淋巴瘤细胞系AG876用作抗原呈递B细胞并且通过干扰素Y释放测定确定其各自呈递来自融合到CD21特异性抗体上的EBNA3C蛋白质的3H10表位的能力。3H10肽单独提供阳性对照，将没有重链或轻链的非功能融合蛋白质、模拟物处理的抗原呈递细胞作为阴性对照。
[0068]LCLs和AG876以相似的效率呈递3H10表位(图2)。AG876在与CD21抗体-3H10融合蛋白质温育后比LCLs呈递3H10的效率低，但仍然比未缀合的3H10效率高大约100倍。该相对降低的效率与伯基特淋巴瘤细胞中有缺陷的抗原呈递机器一致。然而，CD21抗体-3H10融合蛋白质引发针对肿瘤细胞的有效的免疫应答。
[0069]实施例2.1:在EBV转化的B细胞和多种伯基特淋巴瘤细胞系中进一步评估本发明的多肽
[0070]已经产生了装载有多个EBV表位的一组抗体。已经评估了这些抗体其向肽特异性T细胞呈递抗原并激活这些T细胞的能力。在图3中显示了利用包含来自EBNA3C蛋白质的表位的本发明的多肽进行处理的一个实例。我们能够显示利用本发明的这些多肽进行处理导致LCLs和若干伯基特淋巴瘤细胞系中特异性的T细胞激活。
[0071]实施例2.2确定利用本发明的多肽进行处理激活的T细胞杀死其靶细胞的潜力
[0072]因为本发明的多肽可以有效地激活肽特异性的T细胞，我们想确定这些激活的T细胞是否能够特异性地杀死呈递来自免疫原性肽的表位的B细胞。在本文中，我们进行51Cr释放测定以证明激活的T细胞确实可以杀死其靶标。图4显示了这在LCLs中的一个实例。
[0073]实施例2.3:小鼠淋巴瘤模型的体内研究
[0074]产生了本发明的一组多肽，其是含有来自普通小鼠病原体的T细胞表位的“武装抗体”形式。靶向B细胞表位受体⑶-19、-20、-21和-22并将抗体与pp89肽偶联，所述PP89肽是来自小鼠巨细胞病毒(MCMV)的IEl蛋白质的免疫显性T细胞表位。在小鼠淋巴瘤的A20模型中研究这些抗体。将A20细胞系注射到MCMV-阳性BALB/c小鼠中导致与人弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)相似的疾病发生。
[0075]在开始研究之前通过血清学评估动物对MCMV的serostatus。用MCMV感染血清阴性动物，以保证血清转化并针对MCMV pp89肽引发T细胞。在用A20淋巴瘤细胞1.v.攻击之前用病毒再次感染所有动物4周(图5)。在淋巴瘤细胞递送后第5天和第15天，用含有pp89肽的重组AgAbs处理动物。随后在淋巴瘤细胞攻击后监测小鼠的存活和肿瘤发生120天。当出现痛苦的外部病征(如降低的灵活性和改变的行为)时，根据Society ofLaboratory Animal Science (GV-S0LAS)推荐的指导方针处死小鼠，或者如果没有不良症状出现，注射细胞后120天时处死小鼠。对于该实验方案的图示，参考图5。
[0076]使用分子共振成像(MRI)，以在研究过程中的两个时间点上监测肿瘤发展。MRI允许可视化肿瘤并进行肿瘤的体积分析。当肿瘤发展的征兆在未处理组中明显时和在处死之前再次进行所有小鼠的成像。此外，在小鼠处死后进行解剖学和组织学检查。
[0077]使用图5中概要的实验方案，研究一组抗体和处理方案。首先，使用抗体和佐剂(Poly 1:C)共同处理测试针对全组的B细胞表面受体⑶19、-20、-21和-22的抗体。在靶向这些表面受体方面比较肽装载的和未装载的抗体。肿瘤生长和动物存活作为处理效率的标志物被监测，并且相对于未处理的对照动物和没有淋巴瘤的动物进行比较。其他实验包括:i)确定最有效剂量的抗体处理；和ii)评估利用武装抗体和CD20/利妥昔单抗共同注射进行处理的效率。确实，已经发现针对CD21或CD19的抗体表明低细胞毒性性质，其可以改由抗CD20抗体提供并因而针对淋巴瘤细胞组合两个不同角度的攻击。
[0078]一旦已经在A20淋巴瘤模型中测试了一组抗体，那么可以将研究扩展到其他淋巴瘤模型中。这包括BCLl模型(其中根据接种的途径(分别为1.p.或1.v)，BCLl细胞可以诱导DLBCL-样或CLL-样淋巴瘤)和使用来自B6-myc转基因小鼠的伯基特淋巴瘤样模型。
[0079]实施例3
[0080]在B淋巴细胞的表面上呈递微生物抗原引发对这些抗原特异的通过T细胞的识别和破坏。这些T细胞存在于先前被普通病毒，如疱疹病毒感染的大多数个体中。患有慢性丙型肝炎或HIV感染的个体携带增加比例的激活B细胞，其可以有效地呈递抗原(Moir 和 Fauci, 2009，Nat Rev Tmmunol ；Sugalski, Rodriguez, Moir, Anthony, 2010, J.1mmunology)。这些传染物具有修饰其表面抗原的内在能力并且随后它们能够比宿主的免疫系统可以适应地的速度更快的进化。结果，被感染的患者不能清除其感染。
[0081]为了克服该问题，产生多肽文库，其包含与具有长期感染的患者中发现的丙型肝炎抗原文库偶联的抗CD21抗体，其涵盖在感染过程中出现并包括病毒进化所有阶段的病毒抗原谱。向近期患有获得性丙型肝炎的患者施用该抗体文库并因此针对所有可能的病毒变体引发患者的免疫系统并因而能够进行其清除。
[0082]使用在具有长期感染的患者中发现的HIV抗原文库向近期感染了 HIV的患者应用相同的方法，其涵盖在感染过程中出现并包括病毒进化所有阶段的病毒抗原谱。
[0083]实施例4
[0084]产生抗体融合蛋白质，其包含融合到来自普通病毒或细菌病原体的免疫显性肽，例如来自EBV的EBNA3C上并根据常规方法产生的抗⑶21抗体。向患有B-细胞淋巴瘤的患者施用抗体融合蛋白质，其中它们由淋巴瘤细胞吸收。淋巴瘤细胞呈递包含在EBNA3C肽中的T细胞表位并因此激活EBNA3C特异性的T-细胞，其继而清除所呈递的淋巴瘤细胞。⑶4+T细胞也可以充当“细胞毒性”T细胞，以配合靶细胞的杀死。也具有交叉呈递到⑶8+T细胞的可能性。
[0085]实施例5
[0086]产生抗体融合蛋白质，其包含融合到髓磷脂碱蛋白质(MBP)上的抗⑶22抗体。以高剂量向患者应用融合蛋白质。因此，诱导对MBP的耐受性并因此减慢多发性硬化症的进展。
【权利要求】
1.多肽，其包含 a)结合选自⑶22、⑶19、⑶20和⑶21的至少一种蛋白质的结合肽，和 b)包含至少一个T-细胞表位的免疫原性肽， 所述多肽用于针对B-细胞过度增殖接种受试者。
2.权利要求1的多肽，其中所述结合肽是抗体。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述免疫原性肽包含选自通常感染所述受试者的病毒的蛋白质或所述受试者已经针对其接种的病毒的蛋白质的至少一个T-细胞表位。
4.权利要求1-3任一项的多肽，其中所述免疫原性肽包含来自EB病毒(EBV)的潜在基因的至少一个T-细胞表位。
5.权利要求1-4任一项的多肽，其中所述免疫原性肽包含来自肿瘤抗原的至少一个T-细胞表位。
6.多肽，其包含 a)结合选自⑶22、⑶19、⑶20和⑶21的至少一种蛋白质的结合肽，和 b)包含至少一个T-细胞表位的免疫原性肽， 所述肽用于在受试者中调节免疫应答。
7.权利要求6的多肽，其中所述结合肽是抗体。
8.权利要求6或7的多肽，其中所述免疫原性肽包含来自肿瘤抗原的至少一个T-细胞表位。
9.权利要求6-8任一项的多肽，其中所述免疫原性肽包含来自EB病毒(EBV)的潜在基因的至少一个T-细胞表位。
10.权利要求6-9任一项的多肽，其中所述免疫应答的调节是激活。
11.权利要求10的多肽，其中所述结合肽是针对⑶21的抗体或包含EBVgp350的⑶21结合肽的肽。
12.权利要求6-9任一项的多肽，其中所述免疫应答的调节是抑制。
13.权利要求12的多肽，其中所述结合肽是针对CD22的抗体。
14.权利要求1-13任一项的多肽，其中所述结合肽是单链抗体。
15.权利要求1-14任一项的多肽，其中所述结合肽的至少一部分在氨基酸序列上与所述免疫原性肽或与结合所述免疫原性肽的衔接分子邻近。
16.多核苷酸，其编码权利要求15的多肽。
17.载体,其包含权利要求16的多核苷酸。
18.宿主细胞，其包含权利要求16的多核苷酸或权利要求17的载体。
19.用于刺激抗原特异性T-细胞的方法，其包括 a)使抗原呈递细胞(APC)与权利要求1-15任一项的多肽、权利要求16的多核苷酸，或权利要求17的载体接触， b)使所述APC与T-细胞接触，和 c)由此刺激对所述至少一个T-细胞表位特异的抗原特异性T-细胞。
20.权利要求19的方法，其中所述APC是B-细胞。
21.权利要求20的方法，其中所述APC是类淋巴母细胞细胞系(LCL)。
22.权利要求19-21任一项的方法，其中所述方法是体外方法。
23.用于针对B-细胞过度增殖免疫受试者的方法，其包括， a)使所述受试者与包含强T-细胞表位作为免疫原性肽的多肽、与包含编码强T-细胞表位的序列的权利要求16的多核苷酸，或与包含编码强T-细胞表位的序列的权利要求17的载体接触，和 b)由此针对B-细胞过度增殖免疫所述受试者。
24.用于针对传染物免疫受试者的方法，其包括 a)使所述受试者与权利要求6-15任一项的多肽池、权利要求16的多核苷酸池,或权利要求17的载体池接触，和 b)由此针对传染物免疫所述受试者。
25.用于在受试者中诱导耐受性的方法，其包括 a)使所述受试者与权利要求12或13的诱导耐受性的多肽、与编码权利要求12或13的诱导耐受性的多肽的多核苷酸，或与编码权利要求12或13的诱导耐受性的多肽的载体接触，和 b)由此在受试者中诱导耐受性。
【文档编号】C07K14/05GK104168918SQ201380013417
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2012年3月19日
【发明者】H-J·德勒克鲁斯, R·菲德勒, E·巴特莱特 申请人:德国癌症研究中心