专利名称：角化细胞生长因子的类似物的制作方法
发明领域
本发明涉及重组DNA技术和蛋白工程。具体地说，应用重组DNA方法生成角化细胞生长因子(KGF)的多肽类似物，KGF是非成纤维上皮细胞生长的强力促细胞分裂剂，其中类似物具有比母体KGF增强的稳定性。
背景技术：
组织生成和再生地复杂过程由大量有时被称作软组织生长因子的蛋白因子介导。这些分子通常由一种细胞类型释放，影响其它细胞类型的增殖(Rubin等(1989)，美国国家科学院院刊，86802-806)。有些软组织生长因子由某种细胞类型分泌，影响多细胞生物体发育过程中应答细胞的增殖、分化和/或成熟(Finch等(1989)，科学，245752-755)。除了在正在发育的生物体中起作用，有些还对更成熟的系统的持续的健康与维持有重要意义。例如，哺乳动物中有许多系统的细胞更新很快。这些系统包括皮肤和胃肠道，二者均含上皮细胞。软组织生长因子包括了成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族。
目前已知八种FGF家族成员，它们在一级结构上有亲缘关系碱性成纤维细胞生长因子，bFGF(Abraham等(1986)，EMBO杂志，52523-2528)；酸性成纤维细胞生长因子，aFGF(Jaye等(1986)，科学，233541-545)；int-2基因产物，int-2(Dickson和Peters(1987)，自然，326833)；hst/kFGF(Delli-Bovi等(1987)，细胞，50729-737)和Yoshida等(1987)，美国国家科学院院刊，847305-7309)；FGF-5(Zhan等，(1988)，分子细胞生物学，83487-3495)；FGF-6(Marics等，(1989)，癌基因，4335-340)；角化细胞生长因子(Finch等，(1989)，科学，24752-755)；和富组亲动蛋白(Habazzettl等(1992)，自然，359855-858)。
FGF家族的蛋白中，角化细胞生长因子(KGF)是间质组织来源的非成纤维上皮(尤其是角化细胞)细胞增殖的专一效应物。术语“天然KGF”指SEQ ID NO2给出的氨基酸序列所描述的天然人类(hKGF)或重组(rKGF)多肽(带或不带信号序列)或其等位变异体。(除非有其它说明，本文描述的分子的氨基酸编号应当对应于SEQID NO2的氨基酸32至194给出的天然分子的成熟形式(即去掉信号序列)的编号)。
天然KGF可从天然的人类来源(hKGF)或用重组DNA技术(rKGF)生产得到(Finch等(1989)，引文见上；Rubin等(1989)，引文见上；Ron等(1993)，生物化学杂志，268(4)2984-2988；Yan等(1991)，体外细胞发育生物学，27A437-438)。
已知天然KGF在水溶液状态下相对不稳定，可发生化学的和物理的降解，导致在生产和贮存时生物活性损失(Chen等(1994)，医药研究，111582-1589)。升温时天然KGF倾向于聚集，酸性条件下倾向于失活(Rubin等(1989)，美国国家科学院院刊，86802-806)。天然KGF在水溶液中的聚集也使蛋白失活。这种活性损失是有害的，因为它使得长时间贮存天然KGF蛋白的水溶液制剂不可行，长时间用该蛋白给药也不可行。而且制备药物制剂特别成问题，因为聚集的蛋白有免疫原性(Cleland等(1993)，医用药物载体系统评论与综述，10307-377；Robbins等(1987)，糖尿病，36838-845；Pinckard等(1967)，临床实验免疫学，2331-340)。
天然KGF有5个半胱氨酸残基，即氨基酸1、15、40、102和106(Finch等(1989)，科学，24752-755)。虽然天然KGF的半胱氨酸含量已有报道，但半胱氨酸残基对活性(例如对生物活性的必需性)和三级结构(例如形成不需要的分子间和分子内二硫键的倾向性)所起的作用尚未见报道。因此没有现有技术说明，半胱氨酸残基(如果有的话)为不需要的二硫键形成所必需或参与二硫键形成，从而使蛋白易于聚集和/或不稳定。
为了改进或改变天然KGF的一个或多个特性，可以应用蛋白工程。重组DNA技术已被用于修饰天然KGF序列。
Ron等(1993，生物化学杂志，268(4)2984-2988)报道N末端3、8、27、38或49个氨基酸缺失的修饰KGF多肽。缺失3、8、或27个N末端残基的多肽保留肝素结合活性；其它的不保留该活性。而且缺失3和8个残基的多肽据报道具有全部活性，而缺失27个残基的多肽的促细胞分裂能力减少10到20倍，缺失38或49个氨基酸的形式没有促细胞分裂活性。修饰的KGF多肽的稳定性未被讨论或报道。
已出版的PCT申请90/08771号，引文见上，也报道生产了一种嵌合蛋白，其中天然KGF成熟形式的前40个N末端氨基酸与aFGF的C末端部分(约140个氨基酸)组合。据报道，该嵌合体象KGF一样靶向角化细胞，但对肝素不敏感，后者是aFGF的特征而非KGF的特征。嵌合体的稳定性未见讨论或报道。
因此尚没有这样一种修饰的KGF分子的报道，该分子的稳定性比天然KGF明显增高。而且文献中也未报道有足够的讲述与证据，使人们能合理地期待能成功地生成具有所需特征的KGF分子。
通常，任何氨基酸变化对蛋白生物活性的影响依赖许多因素而变化，包括蛋白三维结构，以及修饰是否在蛋白一级序列的受体结合区。由于三维结构或天然KGF的一级结构受体结合区未见于出版物，本领域已有知识不足以根据氨基酸修饰对普通归类的蛋白的效果归纳出氨基酸修饰对天然KGF的作用。
本发明的目的是提供编码比天然KGF稳定性升高(例如在典型pH、热和/或其它贮存条件下)的KGF类似物的多肽分子。
发明概述
本发明提供新的有生物活性的KGF多肽类似物。本发明中的术语“KGF”包括天然KGF和以肽序列基本与天然KGF肽序列相同为特征的蛋白，它保留对应于天然KGF的Cys1和Cys15(SEQ ID NO2)的Cys32和Cys46)的半胱氨酸残基，还保留天然KGF的部分或全部活性，特别是非成纤维上皮细胞增殖活性。“以肽序列基本与天然KGF肽序列相同为特征”指能优选地在严谨杂交条件下与SEQ ID NO1的核苷酸201到684杂交的DNA序列编码的肽序列。
要确定两段氨基酸序列的对应氨基酸位置，可以将两段序列并列，使残基匹配最大化，包括移动氨基端和/或羧基端，需要时在候选物中引入裂隙(gap)或去除作为插入序列的残基。可用著名且常用的序列同源性/一致性扫描算法程序(例如Pearson和Lipman(1988)美国国家科学院院刊，852444-2448；Altschul等(1990)，分子生物学杂志，215403-410；Lipman和Pearson(1985)，科学，2221435或Devereux等(1984)，核酸研究，12387-395)作数据库检索、序列分析与操作。
杂交时的严谨条件是杂交反应中盐，温度，有机溶剂和其它典型受控参数的严谨组合条件。严谨杂交条件的例子有4×SSC中62-67℃杂交，再用0.1×SSC 62-67℃洗约1小时。可选地，严谨杂交条件的例子为在45-55％甲酰胺，4×SSC中40-45℃杂交(见T.Maniatis等，分子克隆实验指南；冷泉港实验室(1982)，387至389页)。
因此，蛋白包括天然KGF片段、嵌合体或杂交分子的等位变异体或氨基酸缺失、替换，或插入。一种KGF的例子包括电荷变化多肽，其中天然KGF的氨基酸残基41-154中一个或多个(优选的是残基Arg41、Gln43、Lys55、Lys95、Lys128、Asn137、Gln138、Lys139、Arg144、Lys147、Gln152、Lys153或Thr154)缺失或被中性残基或带负电荷残基替换，以使蛋白正电荷减少(见共有的U.S.S.N.08/323,337，提交日期1994年10月13日)，具体包括R(144)Q，一种在天然KGF的氨基酸144位将谷酰胺替换成精氨酸的KGF。另一KGF的例子包括将具有高度环形成能力的至少一个氨基酸替换天然KGF的环形成区Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119中至少一个氨基酸得到的蛋白(见共有的U.S.S.N.08/327,473，提交日期1994年10月13日)，具体包括H(116)G，一种将天然KGF氨基酸116位的组氨酸替换成甘氨酸的KGF。另一个例子包括在天然KGF的123-133区(SEQ ID NO2的氨基酸154-164)含有一个或多个氨基酸替换、缺失或添加的蛋白，这些蛋白可能具有激动或拮抗活性。
人们惊奇地发现若含有对应于天然KGF的Lys1和Lys15(SEQ IDNO2的半胱氨酸残基32和46)的半胱氨酸残基(用上述技术确定)的KGF分子经修饰去掉了对应的半胱氨酸，得到的KGF类似物比母体KGF稳定性升高。优选地，本发明除了使稳定性升高外，还要得到与天然KGF相比表现全部生物活性(即至少有基本相似的受体结合或亲和活性)的类似物。
本发明另一方面描述了纯化并分离的编码各种有生物活性的KGF多肽类似物的核酸分子。在一个实施方案中这些核酸包括克隆到有生物功能的质粒或病毒载体的DNA分子。在另一实施方案中，核酸结构可能用于稳定转化原核或真核宿主细胞。在另一实施方案中，本发明涉及一个方法，其中用核酸分子稳定转化的原核(优选的是大肠杆菌)或真核宿主细胞在允许KGF类似物表达的适当营养条件下生长。表达后得到的重组多肽可被分离并纯化。
本发明的另一方面涉及含有治疗有效量的KGF类似物和药用载体的药物制剂。这种制剂将用于治疗患有上皮疾病和损伤的患者。
本发明另一方面涉及通过对患者施用治疗有效量的KGF类似物来刺激上皮细胞生长的方法。在一个实施方案中，非成纤维上皮细胞是被刺激增殖的细胞。这样的上皮细胞包括各种附件(adnexal)细胞、胰细胞、肝细胞和呼吸道与胃肠道的粘液上皮。
附图简述
图1给出天然KGF的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQID NO2)(编码天然KGF成熟形式的核苷酸由SEQ ID NO1的碱基201至684给出，KGF的成熟形式由SEQ ID NO2的氨基酸残基32至194给出)。
图2A、2B和2C分别给出pCFM1156，pCFM1656和pCFM3102的质粒图谱。
图3给出RSH-KGF构建体核苷酸(SEQ ID NO3)和氨基酸(SEQID NO4)序列。
图4给出包含于KGF质粒的构建体的核苷酸(SEQ ID NO5)和氨基酸(SEQ ID NO6)序列。
图5给出用于替换包含于KGF质粒的构建体的KpnI位点和EcoRI位点间DNA序列(SEQ ID NO6的氨基酸46至85位)以生产KGF(dsd)质粒中的构建体的化学合成OLIGO(OLIGO#6至OLIGO#11分别为SEQ ID NO12-17)。
图6给出用于构建KGF(密码子最优化)的化学合成OLIGO(OLIGO#12至OLIGO#24，分别为SEQ ID NO18-30)。
图7给出在天然KGF氨基酸位置1和15用丝氨酸替换半胱氨酸的KGF类似物C(1，15)S的核苷酸(SEQ ID NO31)和氨基酸(SEQ IDNO32)序列。
图8给出天然KGF的N末端前3个氨基酸缺失且氨基酸位置15的半胱氨酸被替换成丝氨酸的KGF类似物ΔN3/C(15)S的核苷酸(SEQ IDNO33)和氨基酸(SEQ ID NO34)序列。
图9给出天然KGF的N末端前3个氨基酸缺失且氨基酸位置15的半胱氨酸缺失的KGF类似物ΔN3/C(15)-的氨基酸(SEQ ID NO35)和氨基酸(SEQ ID NO36)序列。
图10给出天然KGF的N末端前8个氨基酸缺失且氨基酸位置15的半胱氨酸被替换成丝氨酸的KGF类似物ΔN8/C(15)S的核苷酸(SEQID NO37)和氨基酸(SEQ ID NO38)序列。
图11给出天然KGF的N末端前8个氨基酸缺失且氨基酸位置15的半胱氨酸缺失的KGF类似物ΔN8/C(15)-的核苷酸(SEQ ID NO39)和氨基酸(SEQ ID NO40)序列。
图12给出天然KGF的N末端前15个氨基酸缺失的KGF类似物ΔN15的核苷酸(SEQ ID NO41)和氨基酸(SEQ ID NO42)序列。
图13给出天然KGF的N末端前16个氨基酸缺失的KGF类似物ΔN16的核苷酸(SEQ ID NO43)和氨基酸(SEQ ID NO44)序列。
图14给出天然KGF的N末端前17个氨基酸缺失的KGF类似物ΔN17的核苷酸(SEQ ID NO45)和氨基酸(SEQ ID NO46)序列。
图15给出天然KGF的N末端前18个氨基酸缺失的KGF类似物ΔN18的核苷酸(SEQ ID NO47)和氨基酸(SEQ ID NO48)序列。
图16给出天然KGF的N末端前19个氨基酸缺失的KGF类似物ΔN19的核苷酸(SEQ ID NO49)和氨基酸(SEQ ID NO50)序列。
图17给出天然KGF的N末端前20个氨基酸缺失的KGF类似物ΔN20的核苷酸(SEQ ID NO51)和氨基酸(SEQ ID NO52)序列。
图18给出天然KGF的N末端前21个氨基酸缺失的KGF类似物ΔN21的核苷酸(SEQ ID NO53)和氨基酸(SEQ IDNO54)序列。
图19给出天然KGF的N末端前22个氨基酸缺失的KGF类似物ΔN22的核苷酸(SEQ ID NO55)和氨基酸(SEQ ID NO56)序列。
图20给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失的KGF类似物ΔN23的核苷酸(SEQ ID NO57)和氨基酸(SEQ ID NO58)序列。
图21给出天然KGF的N末端前24个氨基酸缺失的KGF类似物ΔN24的核苷酸(SEQ ID NO59)和氨基酸(SEQ ID NO60)序列。
图22给出天然KGF的氨基酸位置1和15的半胱氨酸被替换成丝氨酸且氨基酸位置144的精氨酸被替换成谷氨酸的KGF类似物C(1，15)S/R(144)E的核苷酸(SEQ ID NO61)和氨基酸(SEQ ID NO62)序列。
图23给出天然KGF的氨基酸位置1和15的半胱氨酸被替换成丝氨酸且氨基酸位置144的精氨酸被替换成谷酰胺的KGF类似物C(1，15)S/R(144)Q的核苷酸(SEQ ID NO63)和氨基酸(SEQ ID NO64)序列。
图24给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸位置144的精氨酸被替换成谷酰胺的KGF类似物ΔN23/R(144)Q的核苷酸(SEQID NO65)和氨基酸(SEQ ID NO66)序列。
图25给出天然KGF和C(1，15)S在20mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH7.0中37℃贮存27小时后剩余的可溶蛋白量。
图26给出天然KGF和C(1，15)S在20mMNaPO4，0.15M NaCl，pH7.0中37℃贮存27小时后剩余的可溶蛋白量。
图27给出天然KGF，ΔN15和C(1，15)S在50mM NaPO4，0.15M NaCl，pH7.0中37℃贮存27小时后剩余的可溶蛋白量。
图28给出体积排阻HPLC确定的可溶蛋白量作为37℃温育时间的函数。
图29给出天然KGF，C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E估计的熔解温度(Tm)作为pH的函数。
图30给出通过测量DNA合成时[3H]-胸苷掺入确定的与天然KGF标准曲线比较后得到的C(1，15)S促细胞分裂活性的典型图谱。
图31给出通过测量DNA合成时[3H]-胸苷掺入确定的与天然KGF标准曲线比较后得到的ΔN15促细胞分裂活性的典型图谱。
图32给出通过测量DNA合成时[3H]-胸苷掺入确定的与天然KGF标准曲线比较后得到的ΔN23促细胞分裂活性的典型图谱。
图33给出通过测量DNA合成时[3H]-胸苷掺入确定的与天然KGF标准曲线比较后得到的ΔN23/R(144)Q的促细胞分裂活性的典型图谱。
图34给出通过测量DNA合成时[3H]-胸苷掺入确定的与天然KGF标准曲线比较后得到的C(1，15)S/R(144)Q促细胞分裂活性的典型图谱。
图35给出通过测量DNA合成时[3H]-胸苷掺入确定的与天然KGF标准曲线比较后得到的C(1，15)S/R(144)E促细胞分裂活性的典型图谱。
图36给出C(1，15)S和ΔN23对血清化学的作用。
图37给出天然KGF氨基酸位置1，15和40的半胱氨酸被替换成丝氨酸的KGF类似物C(1，15，40)S的核苷酸(SEQ ID NO77)和氨基酸(SEQ ID NO78)序列。
图38给出天然KGF氨基酸位置1，15和102的半胱氨酸被替换成丝氨酸的KGF类似物C(1，15，102)S的核苷酸(SEQ ID NO79)和氨基酸(SEQ ID NO80)序列。
图39给出天然KGF氨基酸位置1，15，102和106位的半胱氨酸被替换成丝氨酸的KGF类似物C(1，15，102，106)S的核苷酸(SEQ ID NO81)和氨基酸(SEQ D NO82)序列。
图40给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸137位的天冬酰胺被替换成谷氨酸的KGF类似物ΔN23/N(137)E的核苷酸(SEQ D NO83)和氨基酸(SEQ ID NO84)序列。
图41给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸位置139的赖氨酸被替换成谷氨酸的KGF类似物ΔN23/K(139)E的核苷酸(SEQID NO85)和氨基酸(SEQ ID NO86)序列。
图42给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸位置139的赖氨酸被替换成谷酰胺的KGF类似物ΔN23/K(139)Q的核苷酸(SEQID NO87)和氨基酸(SEQ ID NO88)序列。
图43给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸位置144的精氨酸被替换成谷丙氨酸的KGF类似物ΔN23/R(144)A的核苷酸(SEQ ID NO89)和氨基酸(SEQ ID NO90)序列。
图44给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸位置144的精氨酸被替换成谷氨酸的KGF类似物ΔN23/R(144)E的核苷酸(SEQID NO91)和氨基酸(SEQ ID NO92)序列。
图45给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸位置144的精氨酸被替换成亮氨酸的KGF类似物ΔN23/R(144)L的核苷酸(SEQID NO93)和氨基酸(SEQ ID NO94)序列。
图46给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸位置147的赖氨酸被替换成谷氨酸的KGF类似物ΔN23/K(147)E的核苷酸(SEQID NO95)和氨基酸(SEQ ID NO96)序列。
图47给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸位置147的赖氨酸被替换成谷酰胺的KGF类似物ΔN23/K(147)Q的核苷酸(SEQID NO97)和氨基酸(SEQ ID NO98)序列。
图48给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸位置153的赖氨酸被替换成谷氨酸的KGF类似物ΔN23/K(153)E的核苷酸(SEQID NO99)和氨基酸(SEQ ID NO100)序列。
图49给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸位置153的赖氨酸被替换成谷酰胺的KGF类似物ΔN23/K(153)Q的核苷酸(SEQID NO101)和氨基酸(SEQ ID NO102)序列。
图50给出天然KGF的N末端前23个氨基酸缺失且氨基酸位置152的谷酰胺被替换成谷氨酸，153位的赖氨酸被替换成谷氨酸的KGF类似物ΔN23/Q(153)E/K(153)E的核苷酸(SEQ ID NO103)和氨基酸(SEQID NO104)序列。
图51给出ΔN23对Sprague-Dawley大鼠链脲佐菌素诱导的糖尿病的作用。
发明详述
本发明提供新的KGF类似物。已确定天然KGF的4个半胱氨酸残基(Cys1和Cys15，Cys102和Cys106)参与形成两个二硫桥。Cys40不参与形成分子内二硫键。因而KGF含有相隔几乎90个氨基酸的两个小二硫环。根据第一要点，对哪些半胱氨酸残基参与了二硫桥的确定表明这些半胱氨酸能自由地形成不需要的分子间交联或分子内键，从而使蛋白形成不需要的三级结构(例如一种减少蛋白活性的构象)。
人们惊奇地发现通过去除对应于KGF位置1和15的半胱氨酸残基(SEQ ID NO2的32和46位)或将其用其它氨基酸残基替换来修饰KGF得到稳定性提高相当多的KGF类似物(即不正常折叠，形成分子间二硫键和/或蛋白聚集造成的问题减少)。例如KGF类似物一般以产率提高的可溶和正确折叠的蛋白形式被纯化。而且该物质一旦被纯化，与母体分子相比，对pH，温度等的稳定性增大。不受理论所束缚，据信KGF的Cys1和Cys15除去形成分子内二硫桥的N末端二硫环外，在一定条件下以游离的半胱氨酸形式存在，能形成分子间二硫桥，使蛋白不稳定并聚集。而且发现N末端二硫环对受体结合或细胞分裂活性并不重要。
本发明中“KGF类似物”或“KGF多肽类似物”均指任何所述的天然或非天然存在的多肽，其与KGF的结构差别在于对应于KGF的N末端24个氨基酸(SEQ ID NO2的氨基酸32至55)的肽序列含有修饰，其中KGF的Cys1和Cys15(SEQ ID NO2的氨基酸32至46)被替换或缺失。半胱氨酸被替换或缺失的方式并不重要，包括例如多肽类似物含有一个或多个氨基酸缺失和/或替换。相应地，本发明提供一个新的角化细胞生长因子蛋白家族。该家族包括几组蛋白。
一组KGF类似物的分子中KGFl和15位半胱氨酸被氨基酸，包括不是天然存在于蛋白的氨基酸所替换。生成替换类似物的策略包括定点突变(Ho等(1989)，基因，7751-59；Innis等“PRC操作规程(PRC Protocols)”学术出版公司，圣迭戈，加州)。(含有氨基酸替换的KGF类似物表示法SEQ ID NO2给出的成熟蛋白(无信号序列)该位置的氨基酸，后面括号内是该氨基酸位置，再后面是新氨基酸。例如在KGF氨基酸15位(SEQ ID NO2的46位)半胱氨酸被替换成丝氨酸的类似物记作“C(15)S”。)优选地，半胱氨酸变成中性氨基酸如甘氨酸，缬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸和蛋氨酸，其中丝氨酸，苏氨酸和丙氨酸由于与半胱氨酸化学性质相似而最为优选。实施例1详述了用部分基因合成(与其它重组技术共用)，然后在稳定转化的细菌宿主中重组表达而生成C(15)S。
另一组KGF类似物分子去除了KGF第1位和15位的半胱氨酸。可用不同策略来研制这种KGF类似物，如N末端截短和定点缺失或二者组合。
“N末端截短”指这样一种KGF修饰，其中KGF的1至24N末端氨基酸残基(SEQ ID NO2的氨基酸32至55)，包括Cys1和Cys15缺失。(含氨基酸截短的KGF类似物可以这样表示由SEQ ID NO2给出的成熟蛋白(无信号序列)中该位置的缺失残基，缺失位点的起始和缺失的残基数。例如，KGFN末端24个残基(SEQ ID NO2的1-55残基)截短的KGF类似物被称为“ΔN24”类似物。)具体地说，该组包括天然KGF的ΔN23类似物，其中氨基酸残基41-154(SEQ ID NO2的氨基酸72-185)的一个或多个，特别地包括氨基酸残基123-133(SEQ ID NO2的氨基酸154-164，缺失或被中性残基或带负电荷的残基替换，这些残基可以降低蛋白的正电荷。优选的待修饰残基是Arg41、Gln43、Lys55、Lys95、Lys128、Asn137、Gln138、Lys139、Arg144、Lys147、Gln152、Lys153或Thr154，其中Gln138、Lys139、Arg144、Lys147、Gln152或Lys153更优选，Arg144最优选。该组还包括天然KGF的ΔN23类似物，在Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119(SEQ IDNO2的氨基酸146-150)的环形成区具有环形成修饰，优选地包括氨基酸残基116的电荷变化修饰，更优选的是116位被替换成甘氨酸。该组进一步包括天然KGF的ΔN23类似物，在天然KGF的123-133区(SEQ ID NO2的氨基酸154-164)有一个或多个氨基酸替换，缺失或添加。
实施例1详述用部分基因合成连同其它重组技术，在稳定转化的细菌宿主中重组表达而生成有系统的N末端截短，例举的这种N末端截短包括ΔN15至ΔN24。而且实施例3详述了在哺乳动物细胞培养物中表达编码天然KGF和异质N末端糖基化同型物(isoform)的DNA，以及优选的具有天然KGF成熟形式氨基酸1-23N末端截短的糖基化同型物的纯化。
与之对照，定点缺失指这样一种KGF修饰，其中一个或多个氨基酸残基(例如Cys1或Cys15)被去除。若特异性地去除KGF的Cys1或Cys15，则类似物比KGF少一个氨基酸。(含有氨基酸缺失的KGF类似物如下表示SEQ ID NO2给出的成熟蛋白(无信号序列)该位置的残基，后面是括号中的氨基酸位置，再后面是一个负号。例如该组类似物在KGF第15位有半胱氨酸缺失(SEQ ID NO2的第36位)，记作“C(15)-”。)可如上述用定点突变生成定点缺失。
该组还包括通过截短和缺失去除Cys1和Cys15的KGF类似物。例如代表性的KGF类似物在KGF前3个末端残基被截短(Cys-Asn-Asp)或KGF前8个末端残基(Cys-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln)被截短且KGF氨基酸第15位半胱氨酸缺失(这些类似物分别记作ΔN3/C(15)-和ΔN8/C(15)-)。由于天然KGF氨基酸第4和9位天然存在蛋氨酸残基，不需要另外的Met密码子以保证适当的翻译起始。
另一组分子的KGF第1和15位半胱氨酸通过截短和替换而被取代。例如代表性的KGF类似物是ΔN3/C(15)S和ΔN8/C(15)S。这样的类似物含有KGF前3个或前8个氨基酸残基截短且氨基酸位置15的半胱氨酸被另一种氨基酸例如丝氨酸替换。
若KGF类似物是生物生成的，即是细胞表达的产物而非固态合成的，或是天然产物的蛋白水解或酶解衍生物等，则编码这些多肽的核酸与天然KGF核苷酸序列相比将有一个或多个核苷酸不同。本领域专业人员可用许多重组技术的任一种表达这些核苷酸并纯化得到的多肽。
编码KGF类似物全部或部分的DNA序列可包括加入优选地在选定宿主细胞中表达的密码子(例如“大肠杆菌表达密码子”)；提供限制酶切割位点；提供另外的起始、终止或中间核苷酸序列(例如用于大肠杆菌细胞中表达的起始蛋氨酸残基)以协助构建易于表达的载体。
本发明还提供重组分子或载体，用于多肽表达。这种载体可由DNA或RNA组成，可为环型、线型、单链或双链，可以是天然存在的或是多种组分(无论它是天然存在的还是合成的)的组合体。
已知许多这种表达载体的例子。载体的组分，例如复制子、选择基因、增强子，启动子等可得自天然来源或由已知操作方法合成。各种情况下用于本发明的表达载体含有至少一个表达控制元件，与编码KGF多肽类似物的插入核酸分子功能相连。有用的控制元件包括例如lac系统、trp系统、λ噬菌体的操纵基因和启动子，糖酵解酵母启动子、酵母酸性磷酸酶基因启动子、酵母α交配因子、腺病毒，Epstein Barr病毒，多瘤病毒，猿猴病毒以及多种逆转录病毒来源的启动子。不过本领域已知的大量适于原核或真核表达的其它载体和控制元件也可用于本发明的实践。
适当的原核克隆载体的例子包括大肠杆菌的质粒(例如pBR322，colE1，pUC和F因子)，优选的质粒是pCFM1156(ATCC 69702)，pCFM1656(ATCC 69576)和pCFM3102(描述见下面实施例部分)。其它大量类型的本领域已知的用于哺乳动物、昆虫、酵母、真菌和细菌表达的合适载体也可用于此用途。这些载体转染适当的宿主细胞可得到KGF类似物多肽的表达。
用于本发明的宿主微生物可为原核或真核微生物。适当的原核宿主包括各种大肠杆菌(例如FM5、HB101、DH5α、DH10和MC1061)、假单胞菌、芽孢杆菌和链霉菌菌株，优选大肠杆菌。合适的真核宿主包括酵母和其它真菌、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞，例如COS(如COS-1和COS-7)和CV-1猴细胞系、Swiss来源的3T3细胞系、Balb-c或NIH细胞，Hela和L-929小鼠细胞，以及CHO，BHK或HaK仓鼠细胞。依据所用的宿主，生产的重组多肽可被哺乳动物或其它真核碳水化合物糖基化或非糖基化。
优选的生产方法依许多因素和考虑而变；本领域专业人员用最少的实验即可获知某一给定条件下的最优生产方法。然后可用本领域已知的方法将得到的表达产物纯化至近于同质。原核细胞生产的典型纯化方法涉及高压或其它手段裂解细胞壁，离心或过滤去除细胞碎片，然后对上清或滤过物作离子交换层析，最后作斥水作用层析。如果类似物以不溶形式表达，则另一纯化技术涉及将含有类似物的包涵体溶解，再离子交换层析，然后将蛋白再折叠，最后是斥水作用层析。纯化技术的例子见共有的U.S.S.N.08/323,339，提交日期1994年10月13日。一般说来，U.S.S.N.08/323,339讲授一种纯化角化细胞生长因子的方法，包括(a)得到含有KGF的溶液；(b)将步骤(a)的溶液的KGF结合阳离子交换树脂；(c)用洗脱液将KGF从阳离子交换树脂上洗脱；(d)将步骤(c)的洗脱液通过合适的分子量排阻基质或对步骤(c)的洗脱液作斥水作用层析；(e)从分子量排阻基质或斥水作用层析中回收KGF。
当然，可快速筛选类似物来评价其物理特性。实施例部分给出多种熟知的稳定性试验，但用哪种具体实验来检查该类似物并不重要。而且也可用多种试验检查生物活性水平(例如，结合受体和/或亲和性，促细胞分裂性，细胞增殖和/或体内活性)，其中一些由实施例部分给出。常见的多种试验可用于快速筛选KGF类似物以确定其是否具有可接受的生物活性。一种这样的试验特异性通过与125I-KGF结合竞争来检查KGF类似物结合KGF受体(KGFR)的能力(Bottaro等(1990)，生物化学杂志，26512767-12770；Ron等(1993)，生物化学杂志，2682984-2988)。一种检验KGFR/KGF类似物相互作用的可选方法涉及使用实时生物特异性相互作用分析(BIA)技术(Felder等(1993)，分子细胞生物学，131449-1455)。另外可用促细胞分裂剂试验检验KGF类似物激发DNA合成的能力(Rubin等(1989)引文见上)。最后，可用细胞增殖试验来检查KGF类似物激发细胞增殖的能力(Falco等(1988)，癌基因，2573-578)。用任一上述试验系统均可快速对KGF类似物筛选其生物活性。
在优选实施方案中，本发明针对保留天然KGF全部(即至少基本相似)体外或体内活性的KGF类似物。用一种或多种上述试验确定的具有这些特性的KGF类似物的示例有C(1，15)S、ΔN3/C(15)S、ΔN3/C(15)-、ΔN8/C(15)S、ΔN8/C(15)-、ΔN15、ΔN16、ΔN17、ΔN18、ΔN19、ΔN20、ΔN21、ΔN22、ΔN23、ΔN24或ΔN23/R(144)Q。
可进一步修饰KGF类似物，使其含有通常不是肽的一部分的其它化学基元。这类衍生基元可以提高KGF类似物的可溶性、吸附性、生物半衰期等。这些基元可去除或减弱蛋白的任何不利副作用等。能介导这类效应的基元见例如《雷氏医药科学》第18版，Mack出版公司，Easton，宾州(1990)。将肽的靶氨基酸残基与能与指定侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，在分子中引入共价修饰(T.E.Creighton(1983)《蛋白结构和分子性质》，W.H.Freeman公司，旧金山，79-86页)，聚乙二醇(PEG)是这样一种化学基元，可用于制备医疗用蛋白产品。某些蛋白连接聚乙二醇能防止蛋白水解，Sada等(1991)，发酵生物工程杂志，71137-139，并且已有连上某些聚乙二醇基元的方法。见美国专利4,179,337号，Davis等，“非免疫原性多肽”1979年12月18日公布；美国专利4,002,531号，Royer，“用聚乙二醇修饰酶及其产品”，1977年1月11日公布。综述见Abuchowski等，作为药物的酶，(Holcerberg和Roberts编，367-383页(1981))。可用许多方法将聚乙二醇分子连接蛋白。一般聚乙二醇分子通过蛋白上的反应性基团连接蛋白。如赖氨酸残基或N末端的氨基可方便地用于连接。例如Royer(美国专利4,002,531，见上)宣称用还原性烷基化将聚乙二醇分子连到酶上。EP 0,539,167，1993年4月28日出版，Wright“Peg亚氨酸酯及其蛋白衍生物”宣称用PEG的亚氨酸衍生物或相关的水溶性有机多聚体修饰肽和具有游离氨基的有机化合物。美国专利4,904,584，Shaw，1990年2月27日发布，涉及修饰蛋白上许多赖氨酸残基以通过活性氨基联上聚乙二醇分子。
在另一实施方案中本发明涉及一种可安全地肠胃外给药或口服来治疗温血动物(如人)的疾病的药物制剂的单剂量给药单位。这种制剂可以是冰冻干燥或其它方式脱水的医疗品或诊断用品形式，加入生理可接受溶剂后恢复原状。溶剂可以是任何能溶解干燥的组合物，与选定给药途径相容并且不会干扰所用的主要活性成分或重建稳定剂的任何介质，如无菌水、生理盐水、葡萄糖溶液或其它糖的水溶液(例如多醇如甘露醇，木糖醇或甘油)。在特定实施方案中，本发明涉及一种生产单剂量给药单位的试剂盒。该试剂盒含有容纳干蛋白的一个容器和含有重建稳定剂的水相制剂的另一容器。本领域专业人员均明了溶液中蛋白浓度，每个容器中溶液体积及容器容量(可适当修饰的相关参数，依赖于最终剂量单位中主要活性成分的所需浓度)，可以在很大范围内变化。
本发明的KGF类似物可用作治疗和诊断药剂以及研究试剂。因而KGF类似物可用于体外和/或体内诊断试验，对组织或器官样品的KGF定量或确定和/或分离表达KGFR的细胞(Bottano等，(1990)生物化学杂志，26512767-12770；Ron等(1993)，生物化学杂志，2682984-2988)。在组织或器官试验中，由于未标记的天然KGF结合KGFR，与125I-KGF类似物标准结合曲线相比，结合KGFR的125I-KGF的放射性要小。相似地，125I-KGF类似物可用于检测不同细胞类型中KGFR的存在。
本发明还考虑用KGF类似物生成抗肽的抗体，该抗体也结合天然KGF。本实施方案中抗体来源于为单克隆或多克隆，是用KGF生成的。得到的抗体优选地结合天然KGF，优选地该蛋白为天然(有生物活性)构型。这些抗体可用于检测或纯化天然KGF。
而且本发明考虑用KGF类似物来发现有医疗用途的高亲和性或低亲和性KGF结合分子，其应用如作为有效的KGF传输途径或作为KGF活性的抑制物。KGF类似物的热稳定性对于在生理条件下(即37℃)鉴定这种结合分子十分重要，因为其KGF亲和性可能导致强的温度依赖性，不能从在4℃观察到的亲和性预测出来。
KGF类似物可与添加剂配制用于体内。添加剂包括缓冲液、载体、稳定剂、赋形剂、防腐剂、渗透压调节剂、抗氧化剂等(例如粘性调节剂或伸展剂(extender))。选择某种添加剂要依赖KGF类似物的贮存形式(即液体或冰冻干燥的)及给药方式。本领域已知的合适配制法可见《雷氏医药科学》(最新版)，Mack出版公司，Easton，宾州。
KGF类似物可以以治疗有效量施给有损伤或临床非成纤维上皮细胞不足的组织。KGF类似物可以成功给药的范围包括但不限于烧伤或其它部分或全厚度损伤患者的附属结构如毛囊，汗腺和脂腺的激发，增殖与分化；大疱性表皮松解造成的损伤的快速再上皮化，该病是上皮与下面真皮粘附的疾病，导致频繁的裂口，可能导致严重病患；预防化疗引起的脱发和治疗男性的秃顶，或男性和女性的进行性脱发；治疗胃和十二指肠溃疡；治疗发炎性肠道疾病，如Crohn氏症(主要影响小肠)和溃疡性大肠炎(主要影响大肠)；防止或减少放射和化疗过程中消化道毒性(例如治疗前和/或治疗后)以诱导细胞保护效应或再生或同时诱导二者；激发整个胃肠道的粘液产生；诱导II型肺细胞的增殖与分化，帮助治疗或预防早产儿的疾病如玻璃膜症(即婴儿呼吸紧迫综合症和肺气管发育异常)；对于由呼吸损伤(包括高氧水平)、肺气肿、施用损伤肺的化疗药品、呼吸器官外伤及其它肺损伤条件造成的肺损伤或功能不全、刺激支气管和/或肺泡上皮的增殖和分化；增强肝功能以治疗肝硬化，急性肝衰竭，急性病毒性肝炎导致的损伤和/或肝中毒；诱导角膜细胞再生，例如治疗角膜擦伤；诱导上皮细胞再生以治疗进行性牙龈病；诱导鼓膜上皮细胞再生以治疗鼓膜损伤以及治疗或预防糖尿病发作或作为胰岛细胞移植定位的辅助物。
用有效量的KGF类似物对需要非成纤维上皮细胞增殖的患者给药。“有效量”指能在受治疗患者中引发所需反应的KGF类似物的量，通常由医师决定。影响KGF类似物给药量的因素包括患者年龄和一般状况，受治疗的病症等。典型的剂量范围为0.001-500mg/kg体重。
KGF类似物可以对温血动物(如人)安全地肠道外给药(例如通过静脉内、皮内、肌肉内、皮下或腹膜内途径)，口服或局部给药。KGF类似物可用一次或重复施用，依疾病和患者情况而定。某些情况下，KGF类似物可作为其它疗法的辅助物与其它药物制剂一起给药。
下列实施例用来更详细地说明本发明。应当理解在不偏离本发明的精神实质的条件下，可以对给出的方法进行修改。
实施例
下列实施例描述的许多操作规程的标准方法或合适的可选操作规程，由常见的分子生物学手册提供，如《分子克隆》第二版，Sambrook等，冷泉港实验室出版社(1987)和《分子生物学当代操作方法》Ausabel等，Green出版附属机构/Wiley交叉科学，纽约(1990)。实施例1制备编码KGF和KGF类似物的DNA
通过动物细胞RNA的聚合酶链式反应(PCR)和化学合成的(大肠杆菌最优化密码子)寡聚核苷酸(“OLIGO”)的PCR克隆全长人类KGF基因(编码具有天然KGF序列的多肽)。两种方法的描述如下
用从已知生产该多肽的细胞中分离的RNA作PCR扩增。首先用硫氰胍破碎人类成纤维细胞系AG1523A(得自医学研究用人类遗传变异细胞培养物保藏中心，Camden，新泽西)细胞，然后提取(根据Chomyzinski等(1987)，生化年刊，172156的方法)。用总RNA的标准逆转录酶操作方法生成KGF cDNA。用KGF cDNA作模板，引物OLIGO#1和OLIGO#2编码KGF基因5′和3′的DNA序列，进行KGF基因的PCR(PCR#1)扩增(9600型热循环仪(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，康涅迪格)；28个循环；每个循环为94℃变性1分钟，60℃退火2分钟，72℃延长3分钟)。PCR#1产物的等分试样用作第二轮KGF PCR(PCR#2)扩增的模板，扩增条件同上，仅是退火温度为50℃。对KGF基因的表达克隆用嵌套PCR引物制造KGF基因两端的方便的限制位点。用OLIGO#3和OLIGO#4修饰PCR#2的DNA产物，在基因的5′和3′端分别引入MluI和Bam HI限制位点(PCR#3，30个循环；每个循环包括94℃变性1分钟，60℃退火2分钟，72℃延长3分钟)。然后将DNA用Mlu I和Bam HI切割，酚抽提，乙醇沉淀。再重悬并(用T4连接酶)连接到含“RSH”信号序列的序列的pCFM1156质粒中(图2A)得到RSH-KGF构建体(图3)。
连接产物转化(根据Hanahan(1983)，分子生物学杂志，166557的方法)大肠杆菌FM5菌株(ATCC53911)，在LB+卡那霉素上28℃铺平板。选几个转化体，在含20μg/ml卡那霉素的小量液体培养物中生长。从每种培养物的细胞中分离RSH-KGF质粒，进行DNA测序。由于KGF基因内在的Nde I位点不可能将天然基因序列直接克隆到含有括号内的NdelI和Bam HI限制位点的所需表达载体中。用三步(three-way)连接可以做到。在专一的BsmI和SstI限制位点切割RSH-KGF质粒，用1％琼脂糖凝胶电泳后分离到～3kbp的DNA片段(含有KGF基因的3′端)。进行PCR(PCR#4)，如进行PCR#3时所述但将OLIGO#3换成OLIGO#5。然后用NdeI和BsmI切割PCR DNA产物，4％琼脂糖凝胶电泳后分离到311bp的DNA片段。连接用的第三段是pCFM1156用NdeI和SstI切割后1％琼脂糖凝胶电泳分离的1.8kbpDNA片段。如上述连接(T4连接酶)、转化、卡那霉素筛选和DNA测序，挑选含有图4的构建体和名为KGF的质粒的克隆。由于有产生截短产物的内在核糖体结合位点，用化学合成的OLIGO(OLIGO#6至OLIGO#11)取代专一性KpnI和EcoRI位点间的KGF DNA序列以最少使用内在起始位点(图5)。
OLIGO#1(SEQ ID NO7)5′-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3′
OLIGO#2(SEQ ID NO8)5′-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3′
OLIGO#3(SEQ ID NO9)5′-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3′
OLIGO#4(SEQ ID NO10)
5′-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3′
OLIGO#5(SEQ ID NO11)
5′-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3′
OLIGO#6(SEQ ID NO12)
5′-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3′
OLIGO#7(SEQ ID NO13)
5′-AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3′
OLIGO#8(SEQ ID NO14)
5′-GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3′
OLIGO#9 (SEQ ID NO15)
5′-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3′
OLIGO#10(SEQ ID NO16)
5′-ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3′
OLIGO#11(SEQ ID NO17)
5′-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3′
OLIGO用T4多聚核苷酸激酶磷酸化，再热变性。温度缓慢降至室温使单链(ss)OLIGO形成双链DNA片段。用T4连接酶将内在OLIGO粘末端和整个双链OLIGO片段共价连接到KpnI和EcoRI切割的KGF质粒上。将新质粒命名为KGF(dsd)。
用PCR扩增化学合成的OLIGO#12至24，构建完整的大肠杆菌密码子最优化的KGF基因。
OLIGO#12(SEQ ID NO18)5′-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3′
OLIGO#13(SEQ ID NO19)5′-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3′
OLIGO#14(SEQ ID NO20)
5′-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATG-
ACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3′
OLIGO#15(SEQ ID NO21)
5′-CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGT-
GTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3′
OLIGO#16(SEQ ID NO22)
5′-CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATC-
ATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA-3′
OLIGO#17(SEQ ID NO23)
5′-GGTGTTGAAT TGAATTCTACCTGGCATGAACAAAGAAGGTAAACT-
GTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3′
OLIGO#18(SEQ ID NO24)
5′-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGAC-
CCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3′
OLIGO#19(SEQ ID NO25)
5′-ATCCCGGTTCGTGGT-CCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTC-
ACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3′
OLIGO#20(SEQ ID NO26)5′-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3′
OLIGO#21(SEQ ID NO27)5′-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3′
OLIGO#22(SEQ ID NO28)5′-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3′
OLIGO#23(SEQ ID NO29)5′-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3′
OLIGO#24(SEQ ID NO30)5′-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3′
OLIGO#12至24被设计成无论是“Watson”还是“Crick”链编码天然KGF的整个DNA序列均由OLIGO表示，经PCR扩增能生产出需要的双链DNA序列(图6)(PCR#5，9600型热循环仪，Perkin-ElmerCetus；21个循环；每个循环包括94℃变性31秒，50℃退火31秒，73℃延伸31秒；21个循环完成后最后延伸7分钟终止PCR)。PCR扩增后用Xba I和Bam HI切割DNA片段，将521bp片段连接到用相同酶切割的表达质粒pCFM1156中。PCR#5用外在引物(100pmol/100μlrxn)OLIGO#12和OLIGO#13，1μl/100μl rxn的由连接(T4连接酶)OLIGO#14至OLIGO#19(OLIGO#15至OLIGO#18用T4多聚核苷酸激酶磷酸化)并且OLIGO#20至OLIGO#24作连接的band-aid寡聚核苷酸(Jayaraman等(1992)，生物技术12392)得到的KGF模板。最终的构建体称为KGF(密码子最优化)。
所有本文描述的KGF类似物部分地由见于KGF(dsd)或KGF(密码子最优化)或二者组合的DNA序列组成。在编码用一种或多种上述DNA片段合成技术制得的特定KGF氨基酸的DNA序列中方便的限制位点插入序列以进一步修饰这些序列。用上述技术可合成任一全部上述类似物。不过，作为一般OLIGO设计的一部分，适当时用最优化的大肠杆菌密码子，尽管在受检查的任一基因中部分或全部为大肠杆菌优化密码子并不会显著增大从培养的细菌细胞中得到的蛋白的产率。图7到24和37到50用合适的例子给出特定KGF类似物的核苷酸和氨基酸序列构建体C(1，15)S(图7)；ΔN3/C(15)S(图8)；ΔN3/C(15)-(图9)；ΔN8/C(15)S(图10)；ΔN8/C(15)-(图11)；ΔN15(图12)；ΔN16(图13)；ΔN17(图14)；ΔN18(图15)；ΔN19(图16)；ΔN20(图17)；ΔN21(图18)；ΔN22(图19)；ΔN23(图20)；ΔN24(图21)；C(1，15)S/R(144)E(图22)；C(1，15)S/R(144)Q(图23)；ΔN23/R(144)Q(图24)；C(1，15，40)S(图37)；C(1，15，102)S(图38)；C(1，15，102，106)S(图39)；ΔN23/N(137)E(图40)；ΔN23/K(139)E(图41)；ΔN23/K(139)Q(图42)；ΔN23/R(144)A(图43)；ΔN23/R(144)E(图44)；ΔN23/R(144)L(图45)；ΔN23/K(147)E(图46)；ΔN23/K(147)Q(图47)；ΔN23/K(153)E(图48)；ΔN23/K(153)Q 图49)和ΔN23/Q(152)E/K(153)E(图50)。本文描述的所有KGF类似物构建体均由DNA序列证实。实施例2在大肠杆菌中生产
用三种不同的表达质粒克隆KGF类似物基因，即pCFM1156(ATCC#69702)，pCFM1656(ATCC#69576)和pCFM3102(分别为图2A，2B和2C)。通过用PCR重叠寡聚物诱变作一系列定点碱基变化可从pCFM1156质粒得到p3102质粒。从质粒复制启动子PcopB紧邻5′的BglIII位点(pCFM1656质粒bp#180)开始前进至质粒复制基因，碱基对变化如下pCFM1656bp# pCFM1656中的碱基对在pCFM3102中碱基对变成
#204 T/AC/G
#428 A/TG/C
#509 G/CA/T
#617-- 插入2个G/C碱基对
#677 G/CT/A
#978 T/AC/G
#992 G/CA/T
#1002 A/TC/G
#1005 C/GT/A
#1026 A/TT/A
#1045 C/GT/A
#1176 G/CT/A
#1464 G/CT/A
#2026 G/C碱基对缺失
#2186C/G T/A
#2479A/T T/A
#2498-2501 AGTG GTCA
TCAC CAGT
#2641-2647 TCCGAGC碱基对缺失
AGGCTCG
#3441G/C A/T
#3452G/C A/T
#3649A/T T/A
#4556-- 插入的碱基对
(SEQ ID NO67)5′-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3′
(SEQ ID NO68)3′-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-5′
从上可见pCFM1156，pCFM1656和pCFM3 102十分相似且含有许多相同的限制位点。为方便起见选取了这些质粒，以便新构建体可简单地交换载体DNA组分。所有克隆操作均用宿主大肠杆菌菌株FM5(ATCC53911)，用Gene PulserTM转染仪(BioRad Labor atories INC.Hercules加州)。根据生产商的说明用电洗脱或根据Hanahan(1983，引文见上)的方法进行转化。
首先，将0.1ml适当菌株的冷冻甘油贮存物转移到含500ml Luria肉汤的2L烧瓶中，得到在3个pCFM载体之一含有所需构建体的所需重组大肠杆菌克隆的小量新鲜培养接种物。30℃振荡培养16小时，然后将培养物转移到含8L无菌分批培养基的15L发酵罐中(Tsai等(1987)，工业微生物学杂志2181-187)。
从用投料#1培养基送料开始批量送料发酵(Tsai等(1987)，引文见上)。OD600达到35时，迅速将培养物温度升至37℃诱导所需KGF类似物表达2小时，然后升温至42℃将CI阻遏物变性。停加投料1，改加投料2，开始送料的速率为300ml/小时。投料2含有175g/L胰蛋白胨，87.5g/L酵母提取物，260g/L葡萄糖。42℃1小时后，将培养物温度降至36℃，保温6小时。
然后终止发酵，通过离心至1L离心管中的塑料袋里收集细胞。400rpm离心60分钟得细胞沉淀，除去上清，-90℃冰冻细胞糊状物。
各种KGF类似物在大肠杆菌中表达后，用下述方法纯化天然KGF、C(1，15)S、C(1，15)S/R(144)E、C(1，15)S/R(144)Q、ΔN15、ΔN23和ΔN23/R(144)Q。高细胞密度发酵得到的细胞糊悬浮于4℃0.2M NaCl，20mM NaPO4、pH7.5中得10-20％溶液(重量/体积)，用合适的高剪切混合器完成。然后将溶液通过匀浆器(APV Gaulin，Inc.Everett，麻省)三次裂解悬浮细胞。用合适的热交换装置将流出的匀浆冷却至4-8℃。用J-6BTM离心机(Beckman仪器公司，Brea，加州)，JS4.2转头，4200rpm 4℃离心30-60分钟除去裂解物中的残片。然后将上清小心地脱水，上样到预先制好的4℃0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5平衡的450ml(5cm×23cm)S-琼脂糖Fast FlowTM树脂柱上(Pharmacia，Piscataway，新泽西)。接下来用5倍柱体积的0.4M NaCl，20mM NaPO4，pH7.54℃洗柱。用5L 0.5M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗脱下所需蛋白。收集50mL级分，持续监测洗脱液的A280。A280鉴定的含有洗脱物质的级分用14％凝胶作SDS-PAGE来验证所需多肽的存在。
然后收集含所需蛋白的级分，再加入等体积蒸馏水。将稀释的样品上样到先前制好的用0.4M NaCl，20mM NaPO4，pH6.84℃平衡的450ml(5cm×23cm)S-琼脂糖Fast Flow柱。用2250mL 0.4M NaCl，20mMNaPO4，pH6.8洗柱，再用20柱体积的从0.4M NaCl，20mM NaPO4，pH6.8到0.6M NaCl，20mM NaPO4，pH6.8的线性梯度洗脱蛋白。再收集50mL级分，持续监测洗脱液的A280。收集含有蛋白的级分(用14％SDS-PAGE确定)，再通过一个350cc搅拌室(Amicon Inc.Mayberry，麻省)中的YM-10膜(10,000截断分子量)浓缩至30-40mL体积。
预先制好1,300mL(44cm×85cm)Superdex-75TM树脂(Pharmacia)用含有1×PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，“D-PBS”，无钙无镁)或0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0的柱缓冲液平衡，将浓缩物加样。样品进入柱后，用柱缓冲液从凝胶过滤基质中洗脱蛋白。此后回收10mL级分，汇集含类似物(14％SDS-PAGE确定)的级分。典型的最终汇集物中蛋白浓度为约5-10mg/mL。除非另有说明，上述操作均在4-8℃下进行。
用可选的纯化方法纯化天然KGF、C(1，15)S和ΔN23。该方法包括下述步骤，除非特别说明，所有方法、溶液和物质均在23±5℃。
细菌发酵生产阶段完成后，将细胞培养物冷却至4-8℃，离心或用相似方法收集细胞。根据每单位重量细胞糊中预计的蛋白产量和需要纯化的蛋白量，将适当重量的细胞糊悬浮于5倍细胞糊重量的20mMNaPO4，0.2M NaCl，pH7.5温和缓冲液。用高剪切混合器将细胞分散成均质溶液。匀浆过程中保持细胞糊分散液的温度为4-8℃。
然后加压裂解细胞，例如将细胞浆分散液通过适当大小的细胞匀浆器两次。将匀浆低温保持于5±3℃。用预先制好的装备了具有适当量的滤器表面积的滤器，用适当体积的0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5平衡的深度滤器套(housing)(Cuno公司，Meriden，CT)使细胞裂解物澄清。平衡和澄清在5±3℃下进行。澄清前用适当量的合适的过滤助剂将滤器预包被并且与细胞裂解物彻底混合，之后将溶液通过滤器以澄清裂解物。用0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗滤器。将滤过液和任何后续清洗液收集于适当容积的冷冻容器中，所有操作均低于10℃。
澄清后的裂解物通过预先制好的SP-琼脂糖Fast Flow柱，每2g细胞裂解物至少1mL树脂。SP-琼脂糖Fast Flow柱用冷的(5±3℃)0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5平衡。保持柱的温度低于10℃。澄清后的裂解物(5±3℃)加样到离子交换树脂上，持续监测洗脱物的A280。样品上样后先用冷的0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗柱再用23±5℃的0.3M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗柱。
用范围为0.2-1M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5的线性梯度洗脱所需蛋白。根据洗脱物的A280收集几个级分的大量产品。洗脱后合并这些级分并记下体积。
进行氧化步骤以氧化游离的巯基。对于与天然KGF相比半胱氨酸模式改变的蛋白，加氧化剂(例如，胱胺二盐酸化物或其它合适的氧化剂如胱氨酸，氧化型谷胱甘肽或二价铜)至终浓度1-20mM，pH调至7-9.5，用胱胺二盐酸化物时优选pH9.0±0.3 10-30℃氧化适当长的时间。氧化天然KGF蛋白时加入适量的(NH4)2SO4，如1-2M(NH4)2SO4，调pH7.5±0.5，在一段时间内保持温度为23±5℃。
氧化后，将溶液pH调到6.5和9.5之间。必要的话在溶液中加入固体(NH4)2SO4，终浓度2M。将溶液通过适当的澄清滤器除去颗粒。
过滤的氧化产物作斥水作用层析(HIC)。HIC基质是丁基-650MToyopearlTM树脂(Tosohaas Inc.，Montgomeryville，宾州)。将含蛋白溶液上样到预先用2M(NH4)2SO4，0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0平衡的柱上。上样后用2M(NH4)2SO4，0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0洗柱。用0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0中递降线性2-0M的(NH4)2SO4梯度洗脱所需蛋白。洗脱液A280增加显示所需蛋白开始洗脱，收集这些级分。每级分的等分试样用SDS-PAGE分析。然后收集含所需蛋白的各级分，彻底混合，确定合并物体积及其中蛋白浓度。
合并的含蛋白HIC洗脱液被浓缩并更换洗脱缓冲液。典型地将蛋白浓缩至5.0-10.0mg/ml。用配备了PTGC PelliconTM盒式系统(Millipore公司，Bedford，麻省)和合适截止大小的膜的超滤系统作超滤。
浓缩后，将样品对合适的缓冲液透滤。浓缩步骤的留存物对0.15MNaCl，20mM NaPO4，pH7.0透滤直到留存物的电导在0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0溶液的电导的5％以内。
另外将浓缩透滤的含蛋白样品通过0.1μm PosidyneTM滤膜(PallInc.，Cortland，NY)去除可能存在的沉淀物和细菌毒素。确定了溶液的蛋白浓度并根据最终大量产品所需浓度，用0.15M NaCl，20mM磷酸钠，pH7.0将溶液稀释至所需终浓度。然后用0.22μm滤膜作最后的无菌过滤，将最终的大量产品转移至不含致热源的容器中贮存(约5℃)和进一步配制。B.分析
用来自大肠杆菌的天然KGF；C(1，15)S；C(1，15)S/R(144)Q；ΔN15；ΔN23和ΔN23/R(144)Q进行分析。
构象稳定性
比较多肽的贮存稳定性，热致去折叠温度(Tm)，及广泛范围pH条件下的稳定性。
贮存稳定性
天然KGF和C(1，15)S在37℃下温育约24小时，确定余下的可溶蛋白。结果由图24到26总结。
图25比较了贮存于20mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH7.0，37℃27小时的天然KGF和C(1，15)S。C(1，15)S比天然KGF的可溶蛋白量明显增多。
图26比较了贮存于37℃0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0中天然KGF和C(1，15)S。这里，C(1，15)S又比天然KGF稳定性高。
图27比较了贮存于PBS和50mM NaPO4，0.15M NaCl，pH7.0，37℃18小时的天然KGF，ΔN15和C(1，15)S的稳定性。在高磷酸盐中回收到的可溶蛋白比在PBS中的要多得多(100比60％)。与天然KGF相比，ΔN15和C(1，15)S稳定性显著升高。在高磷酸盐中ΔN15和C(1，15)S回收率约为100％，与从天然KGF结果作出的预计一致。
不过，在C(1，15，40)S和C(40)S(被SEQ ID NO1的残基201到684编码，但Ser40被AGA编码)以及在C(1，15，102)和C(102)S(被SEQ ID NO1的残基201到684编码，但Ser102被AGA编码)作了贮存稳定性的单一初步比较。结果(未给出)表明稳定性降低(即37℃贮存后可溶性蛋白较少)。但是从培养基中纯化到的可溶的正确折叠的C(1，15，40)S蛋白量比C(40)S的量大，表明C(1，15，40)S实际上更稳定并且实施例的比较结果不是决定性的。本发明优选地包括在Cys40、Cys102、Cys106之外存在替换的KGF类似物，更优选地不包括C(1，15，40)S，C(1，15，102)S和C(1，15，40，102，106)。
也检查了C(1，15)S/R(144)Q和ΔN23/R(144)Q防止高温聚集的能力。制备D-PBS中含0.5mg/mL蛋白的样品。每种样品的0.5mL分成等分试样装入3cc I型玻璃小管中。小管用橡胶瓶塞封口并卷上13mm的flip-off铝封。然后将小管放入37℃温育箱中。在预定的时间间隔取出小管分析可溶蛋白的损失。将250μl每种样品通过0.22μm Spin-XTM滤器单元(Costar，Cambridge，麻省)离心去除可见沉淀。滤过溶液的可溶蛋白再用排阻HPLC分析。将HPLC峰面积积分确定可溶蛋白量并将结果作为37℃温育时间的函数。结果由图27给出。
可溶单体蛋白损失的半衰期从这些动力学曲线上估计。表1给出这些蛋白在37℃下贮存的剩余可溶KGF的半衰期。
表1
可溶单体蛋白损失的半衰期
从上面表1和图28可以看出天然KGF很快聚集溶解度半衰期为0.6天。C(1，15)S/R(144)Q，ΔN23/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E溶解度半衰期有显著增长，分别为13.3，22.3和38天。
热致去折叠
用装备了PTC343 Peltier型温控系统的J-720TM偏振光度计(Jasco公司Easton，马里兰州)在230nm用圆二色(CD)监测热致去折叠。在D-PBS(Life Technologies Inc.Grand Island，纽约州)制备圆二色分析用的含0.1mg/mL多肽的各独立样品。将约2.5mL每个样品加样到10mm光径的长矩形SuprasilTM石英(Heraeus Quarzschmelze，GmbH，Hanau，德国)荧光池(Hellma Cells公司，Jamaica，纽约州)中。将池放入偏振光度计的Peltier型温控系统中。热致去折叠速率为50℃/hr。监测230nm椭圆率变化以指示去折叠过程。鉴定溶液中50％蛋白分子去折叠的温度来估计每个样品的Tm(生物物理化学，Cantor和Schimmel编，W.H.Freeman公司，旧金山(1980))。三种蛋白各自的估计Tm值列于表2。
表2
估计的熔解温度
结果显示C(1，15)S和ΔN15比天然KGFTm增加1℃。ΔN23Tm还高一度。但C(1，15)S/R(144)Q或ΔN23的R144Q替换比天然KGFTm增加大于6℃和7℃。而且C(1，15)S/R(144)E比天然KGF稳定9℃多。
pH
加入高浓度HCl或NaOH调D-PBS至不同pH值以比较C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E相对天然KGF的酸稳定性。在石英杯中将约2.35mL不同pH值的D-PBS与100μL的2.45mg/mL KGF蛋白混合。这些样品热致去折叠，速率为50℃/hr，230nm CD监测。图29给出天然KGF，C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E的Tm作为pH的函数。在检测的pH范围内C(1，15)S/R(144)Q和C(1.15)S/R(144)E的Tm总比天然KGF的高。
体外生物活性
通过测量Balb/MK细胞[3H]-胸苷摄入也可将C(1，15)S、ΔN15、ΔN23、ΔN23/R(144)Q、C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E的体外促细胞分裂活性确定为蛋白浓度和半最大浓度的函数(根据Rubin等(1989)的方法，引文见上)。通常用体外生物活性试验确定每种KGF类似物相对已知标准天然KGF的浓度。然后稀释每种KGF类似物并用Balb/MK促细胞分裂剂试验检验其生物活性。首先将样品稀释到含50％定制Eagle氏MEM50％定制F12，5μ/ml转铁蛋白，5ng/ml硒酸钠，0.0005％HSA和0.005％Tween 20的生物试验培养基。KGF样品加入接种了Balb/MK细胞的Falcon primeria 96孔板。测量DNA合成时[3H]胸苷的掺入并通过与天然KGF标准曲线比较，转换成输入的天然KGF浓度。结果由图30至35给出。从图中可见，图29至34描述的已检测KGF类似物与天然KGF活性相似。实施例3在哺乳动物细胞培养物中生产
本实施例描述在哺乳动物表达系统中生产的两种生物活性重组KGF(rKGF)形式的表达，分离和表征。
用PCR扩增得自正常人类真皮成纤维细胞(Clonetec公司，圣迭戈，加州)的cDNA，分离到人类KGF基因。用逆转录酶制得cDNA后用PCR扩增KGF基因。用OLIGO#25和OLIGO#26从cDNA中扩增出基因，第二次PCR扩增后用OLIGO#27和OLIGO#28在片段末端加上Hind III和BglII限制位点，如图1所述。
OLIGO#25(SEQ ID NO69) 5′-CAATCTACAATTCACAGA-3′
OLIGO#26(SEQ ID NO70) 5′-TTAAGTTATTGCCATAGG-3′
OLIGO#27(SEQ ID NO71) 5′-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3′
OLIGO#28(SEQ ID NO72) 5′-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3′
克隆和确证DNA序列后使用KGF基因DNA。用OLIGO#29和OLIGO#30进行扩增。
OLIGO#29(SEQ ID NO73)
5′-CGGTCTAGACCACCATGCAAATGGATACTGACATGG-3′
OLIGO#30(SEQ ID NO74)
5′-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3′
有义引物OLIGO#29在起始密码子ATG上游有XbaI位点和一致Kozak翻译序列(5′-CCACC-3′)。反义引物OLIGO#30含有SalI克隆位点和另一个终止密码子。PCR扩增(94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸40秒)18个循环后，用Xba I和SalI消化产物并与类似消化的pDSRα2的DNA连接(根据Bourdrel等(1993)，蛋白实验与纯化，4130-140和Lu等(1992)，Arch.Biochem.Biophys.，298150-158的方法)。这样得到KGF/pDSRα2质粒，其中人类KGF基因在SV40早期启动子和α-FSH多聚腺苷化序列之间。选出两个克隆，DNA序列分析证实构建到所需载体。
用PvuI线性化2微克KGF/pDSRα2DNA。然后用标准磷酸钙沉淀法(Bourdrel等，引文见上)用处理过的DNA转染前一天接种到0.8×106细胞/60mm的培养血中的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞里。两周后选出单个的克隆转移到24孔板上。细胞汇合后条件培养基被认为不含血清，用抗大肠杆菌表达的人类KGF的多克隆兔抗血清Western印迹法分析其等分试样。
Western印迹样品在12.5％(W/V)SDS聚丙烯酰胺上走胶，用半干转移仪(Hoefer Scientific Instruments，旧金山，加州)400mA1小时电印迹到硝酸纤维素膜上。转移缓冲液是20mM Tris，150mM甘氨酸，25％甲醇。用PBS中10％正常山羊血清温育，封闭硝酸纤维素膜。用抗大肠杆菌来源的KGF的兔抗血清作一抗。使用时用PBS中1％正常山羊血清稀释10,000倍，与封闭的硝酸纤维素膜室温温育12小时，然后用PBS洗3次，每次30分钟，除去多余的抗体。硝酸纤维素膜在100ml含VectastainTM生物素化山羊抗兔IgG (二抗，Vector Labs，Burlingame，加州)的PBS中1％正常山羊血清里室温温育30分钟。用PBS洗3次，每次10分钟。之后在100ml依制造商说明(Vector Labs)制备的含链亲合素(streptavidin)和生物素化过氧化物酶的1％正常山羊血清溶液中室温温育30分钟。用PBS洗3次后用100ml PBS中的60μL30％(W/V)H2O2和20mL甲醇中的50mg 4-氯萘酚混合物温育，将KGF交叉反应物质显色。10分钟后水洗终止反应。
分析印迹显示KGF特异性抗体与三个不同蛋白带相联系，其中两个紧密相关，分子量为约25-29KDa，另一个估计分子量为约17KDa，而163个氨基酸的成熟蛋白的估计分子量约为18.8KDa。另外，用Western分析确定分泌量大于2.0mg rKGF每升的几个高度表达克隆被选出并被移入摇瓶(根据Lu等人的方法，引文见上)以得到大体积的无血清的条件化培养基，用于阳离子交换层析和凝胶过滤纯化KGF，如下述。
纯化3升无血的条件化培养基中的KGF。将填充了450ml磺乙基阳离子交换柱，一种用20mM磷酸钠pH7.5预平衡过的S琼脂糖Fast Flow(Pharmacia)柱用培养基直接上柱。用5倍柱体积的20mM磷酸钠，0.2M NaCl pH7.5洗柱。然后用20倍柱体积的20mM磷酸钠，pH7.5中0.2至1.0M NaCl线性梯度洗脱rKGF。收集50mL级分并持续A280监测。用SDS-PAGE分析每一级分的等分试样以检测KGF蛋白。用预制的14％Tris-甘氨酸预制凝胶(根据Laemmli(1970)自然，227680-685的方法)在电泳系统(Novex，圣迭戈，加州)上作SDS-PAGE。上样前将样品与非还原性SDS样品缓冲液混合，不需加热。用考马斯蓝或银染检测蛋白。看到两个晚期洗脱峰含有蛋白带，对应Western印迹检测到的25-29KDa和17KDa带。含有这些峰的级分分别浓缩到小于1.0mL的体积中作凝胶过滤。
凝胶过滤用的Superdex-75TM树脂柱(HR10/30，Pharmacia)用PBS，pH7.2预平衡，用下述分子量标准(BioRad，旧金山，加州)甲状腺球蛋白(670KDa)，g球蛋白(158KDa)，卵清蛋白(44KDa)，肌球蛋白(17KDa)和维生素B-12(1.4KDa)标定。经过这些纯化步骤得到的rKGF约被纯化2000倍，特别包括由银染确定的17KDa和30KDa的物质。
由于是较高分子量的物质，rKGF被作为主要对称峰(用A280检测)洗出，该峰被称作KGF-a。用SDS-PAGE分析少量该物质(3μg/泳道对6μg/泳道)分辨出有1-2KDa分子量差异的两条带。将低分子量物质KGF-b凝胶过滤得到具有预计移动率的蛋白制备物。KGF-a和KGF-b的纯化后总回收率均为约30-40％。
还分析了KGF-a和KGF-b的氨基酸序列。仪器是自动测序仪(477A或470A型，应用生物系统公司，Foster城，加州)，装备有120A型在线PTH氨基酸分析仪和900A型数据收集系统(用Lu等(1991)，生物化学杂志，2668102-8107的方法)。KGF-a的Edman序列分析显示主要N末端序列为X1-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-X2-X3-S-[SEQID NO75]。从N末端第三个氨基酸天冬氨酸起始的次级序列占整个可测序蛋白的1.6％。由于序列分析时没有苯基乙内酰硫脲基(phenylthiohydantoinyl)(PHT)氨基酸信号，因此不能确定X1，X2和X3。由cDNA预测的KGF的N末端氨基酸序列显示X1和X3是Cys残基，X2是天冬酰胺。X1和X3不存在显示这些半胱氨酸可能形成二硫桥。根据一致N连糖基化序列Asn-X-Ser，对应于X2的预测的Asn残基不存在显示这是潜在的N连糖基化位点。
有趣的是，KGF-b N末端序列分析显示N末端氨基酸序列为S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V-(SEQ DNO76)表明它是KGF的N末端截短形式，在Arg23-Ser24肽键处被蛋白水解切割。
用已知方法(Sasaki等(1987)，生物化学杂志，26212059-12076；Takeuchi等(1988)，生物化学杂志，2633657-3663；Zsebo等(1990)，细胞，63195-201)用糖苷酶(唾液酸苷酶，O-聚糖酶和/或N-聚糖酶)处理蛋白来进一步将纯化的KGF-a和KGF-b定性。这些数据显示KGF-a含N连和O连糖而低分子量形式的KGF-b可能只含N连糖。糖苷酶处理并不能使KGF-b分子量减少，表明该分子未被糖基化。
用上述内蛋白酶Glu-C-产生的肽的质谱进一步确定KGF-a的糖基化模式。用质谱分析逐步开口(orifice)法阐明糖蛋白的糖结构已被成功地用于其它蛋白(Huddleston等(1993)，化学年刊，65877-884；Carr等(1993)，蛋白科学，2183-196)。分离到非糖基化肽证实Thr22看来被部分糖基化。对Asn14作相似的质谱分析表明糖基化有微异质性，有二，三和四天线结构及不同程度的唾液酸化。
表3A总结了以半最大速率激活角化细胞[3H]胸苷掺入的KGF浓度(根据Rubin等(1989)的方法，引文见上)。从制备自Balb/MK小鼠表皮角化细胞的分离KGF受体膜制备物检查与KGF受体的相互作用(用Massague(19932)，生物化学杂志，25813614-13620描述的方法)。具体地说，将各种形式的KGF用50mM Tirs-HCl，pH7.5含0.2％牛血清清蛋白稀释至浓度在每50μl0.8ng至100ng范围内。它们单独与膜制备物(75ng/mL)和125I标记的大肠杆菌来源的KGF(1.5ng)温育。在4℃下进行受体结合和竞争实验16小时，然后取样品，离心，用上述稀释缓冲液洗两遍除去未结合和非特异性结合的带标记的KGF。然后对样品的残余放射性进行计量。将非竞争百分比对每个KGF样品浓度作图得到KGF样品和标记KGF的受体结合竞争曲线。表3B归纳了实现标记的大肠杆菌来源的KGF(ng/mL表示)的60％非竞争所需的KGF浓度。
表3A
以半最大速率激活角化细胞的[3H]-胸苷
掺入的KGF浓度
表3B
以60％非竞争速率与I125标记的KGF竞争
受体结合的KGF浓度
如表3A所示，KGF-a和KGF-b激活相似的[3H]胸苷掺入，两种类似物的激活半最大速率约为30ng/mL。因此截短并不减小分子的生物活性。但两种类似物比大肠杆菌来源的全长KGF活性低约3倍。如表3B所示，放射性受体试验非竞争实验显示大肠杆菌来源的KGF，KGF-a，KGF-b有相似的受体结合活性。实施例4大肠杆菌和哺乳动物细胞培养物
生产的KGF多肽的体内生物试验
单个皮下KGF剂量显示能使小鼠血清胆固醇在24小时内以剂量依赖方式增大。对天然KGF、KGF-a、C(1，15)S、ΔN15和ΔN23也评价其以剂量依赖方式增大血清胆固醇水平的能力。
每个处理组包括5个从CRL得到的雌性Balb/c小鼠(18-20克)。蛋白用0.9％盐水稀释，最终注射体积为每只小鼠100μl。对每只小鼠以下列剂量单次皮下注射给药
注射24小时处死小鼠并通过心脏穿刺取血。处理血液样品以确定血清胆固醇。
如图35所示，发现每种受试KGF类似物均能以剂量依赖方式提高血清胆固醇。而且各受试KGF类似物之间的生物活性无明显差别。
糖尿病体内模型
不同动物中的化学诱导的糖尿病模型通常被用于研究该疾病及其治疗方法。链脲佐菌素在小鼠、大鼠、仓鼠、狗和猴中诱导糖尿病，但最常在大鼠和小鼠中做研究。Junod等，Proc.Soc.Exp.Pio.Med.126210-205(1967)；Rerup，医药学综述，22485-518(1970)；Rossini等，P.N.A.S.，742485-2489(1977)；Ar’Rajab and Ahren，Pancreas，850-57(1993)。大鼠中链脲佐菌素单静脉内剂量45-70mg/kg诱导稳定的疾病。45mg/kg剂量诱导暂时病症状态但该状态是可逆的。链脲佐菌素注射一天之内诱导高血糖状态。与正常大鼠相比，血液胰岛素水平基本保持不变；但胰内胰岛素和C肽总含量减少严重。大鼠表现人类糖尿病的典型症状血糖水平升高(高血糖)、尿糖(糖尿)、口渴(烦渴)、尿频(多尿)、食欲增大(嗜食)。
本发明公开描述的研究用Sprague-Dawley大鼠中链脲佐菌素诱导的糖尿病模型进行。用研究开始时体重200-260g的大鼠。每千克体重50mg溶于柠檬酸钠缓冲液的链脲佐菌素单次静脉注射诱导糖尿病。用非糖尿病对照大鼠接受单次柠檬酸钠缓冲液静脉注射作为对照。KGF每日皮下注射给药。根据实验，KGF的剂量为3或5mg/kg/天。第一个实验中，KGF疗法在诱导出糖尿病前两天开始，并持续其8次注射。在第二个和第三个实验中，在链脲佐菌素诱导出糖尿病一天后开始皮下给药的KGF疗法。在第四个实验中，在链脲佐菌素处理后第7天开始7天的KGF疗程，跟踪观察动物12周。所有实验，除第4个实验，用血糖水平、尿糖水平和尿量作分析用最终数值点。另外在一些实验中测量水的摄入量，尿C肽水平，或整个胰脏的胰岛素和C肽含量。第4个实验中只检测血糖作最终数据点。由于胰岛素大部分被肝从循环中除去，测外周胰岛素浓度反映肝代谢后事件而非胰脏的胰岛素分泌。因此通常测量C肽并用作胰岛素分泌的外周标记物。C肽在前胰岛素到胰岛素的加工过程中产生。胰岛素和C肽以等摩尔的量由β细胞分泌，仅有小部分C肽被肝提取(extract)。
本研究探讨了Sprague-Dawley大鼠中rKGF对链脲佐菌素诱导的糖尿病的作用。第0天各组大鼠接受45或50mg/kg链脲佐菌素(STZ)。在这些处理后每日监测不节食时的血糖水平以评价胰岛损伤的严重性。在第5天根据高血糖程度将STZ处理的动物分到两组中(每组20只)。分隔点定在血糖水平为300mg/dl。以一组未受STZ处理的动物作对照。在第7天对每个高血糖组中的10只动物通过皮下注射施用ΔN23(3mg/kg/天)或PBS，共7天。然后每天、每隔一天或每周监测血糖水平，如图51所示。注意到两组的接受ΔN23的STZ处理的动物在ΔN23给药期间血糖水平明显下降。重要的是，起始血糖＜300mg/dl的STZ处理的动物的平均血糖下降稳定在约150mg/dl，而起始血糖＞300mg/dl的组中血糖水平下降只是暂时的。注意天数标度是非线性的。
尽管本发明已被一般地以及用优选实施方案作了如上描述，本领域专业人员应当理解，基于上述描述，可有其它的变异形式或修饰存在。
权利要求
1.一种最多前24个N末端氨基酸被修饰的KGF多肽类似物，其中对应于KGF氨基酸位置1和15[SEQ ID NO2的氨基酸位置32和46(分别为Cys1和Cys15)]的半胱氨酸残基缺失或被其它氨基酸替换。
2.权利要求1的多肽类似物，其中Cys1和Cys15缺失。
3.权利要求1的多肽类似物，其中前15至24个N末端氨基酸被截去。
4.权利要求1的多肽类似物，其中Cys1缺失，Cys15被其它氨基酸替换。
5.权利要求1的多肽类似物，其中最多前14个N末端氨基酸被截去且Cys15被其它氨基酸替换。
6.权利要求1的多肽类似物，其中Cys1和Cys15被其它氨基酸替换。
7.权利要求4、5或6中任一权项的多肽类似物，其中半胱氨酸被选自丙氨酸、亮氨酸和丝氨酸的氨基酸替换。
8.权利要求7的多肽类似物，其中半胱氨酸被丝氨酸替换。
9.权利要求1的多肽类似物，其选自C(1，15)S、NΔ15、NΔ16、NΔ17、NΔ18、NΔ19、NΔ20、NΔ21、NΔ22、NΔ23和NΔ24、ΔN3/C(15)S、ΔN3/C(15)-、ΔN8/C(15)S-、ΔN8/C(15)-、C(1，15)S/R(144)E、C(1，15)S/R(144)Q和ΔN23/R(144)Q。
10.一种药物制剂，其含有治疗有效量的权利要求1的多肽类似物和药用载体。
11.一种药物制剂，其含有治疗有效量的冰冻干燥的权利要求1的多肽类似物。
12.权利要求11的药物制剂，其进一步包含一种药用载体。
13.一种选自DNA和RNA的核酸分子，其中该核酸分子编码最多前24个N末端氨基酸被修饰的KGF多肽类似物，该类似物中对应于KGF氨基酸位置1和15[SEQ ID NO2的氨基酸位置32和46(分别为Cys1和Cys15)]的半胱氨酸残基缺失或被其它氨基酸替换。
14.权利要求13的核酸分子，其编码Cys1和Cys15缺失的KGF多肽类似物。
15.权利要求13的核酸分子，其编码前15到24个N末端氨基酸被截去的KGF多肽类似物。
16.权利要求13的核酸分子，其编码Cys1缺失且Cys15被其它氨基酸替换的KGF多肽类似物。
17.权利要求13的核酸分子，其编码最多前14个N末端氨基酸被截去且Cys15被其它氨基酸替换的KGF多肽类似物。
18.权利要求13的核酸分子，其编码Cys1和Cys15被其它氨基酸替换的KGF多肽类似物。
19.权利要求16、17或18中任一权项的核酸分子，其中半胱氨酸被选自丙氨酸、亮氨酸和丝氨酸的氨基酸替换。
20.权利要求19的核酸分子，其中编码丝氨酸的密码子替换了编码半胱氨酸的密码子。
21.权利要求13的核酸分子，其中多肽类似物选自C(1，15)S、NΔ15、NΔ16、NΔ17、NΔ18、NΔ19、NΔ20、NΔ21、NΔ22、NΔ23和NΔ24、ΔN3/C(15)S、ΔN3/C(15)S-、ΔN8/C(15)S、ΔN8/C(15)-和ΔN23/R(144)Q。
22.一种含有权利要求13的核酸分子的有生物学功能的质粒或病毒载体。
23.一种用权利要求22的有生物学功能的载体稳定转染或转化的原核或真核宿主细胞。
24.权利要求23的原核宿主细胞，它是大肠杆菌。
25.权利要求23的真核宿主细胞，它是哺乳动物细胞。
26.权利要求25的真核宿主细胞，它是中国仓鼠卵巢细胞。
27.一种产生KGF多肽类似物的方法，该方法包括在适当的营养条件下生长用权利要求13的核酸分子稳定转化的原核或真核宿主细胞，所用的方式允许编码的多肽类似物表达，分离如此产生的多肽类似物。
28.一种刺激非成纤维上皮细胞产生的方法，该方法包括将所述细胞与有效量的权利要求1的KGF多肽类似物接触。
全文摘要
本发明涉及一种非成纤维上皮细胞生长的强力促细胞分裂剂——角化细胞生长因子(KGF)的多肽类似物,KGF最多前24个N末端氨基酸被修饰,其中对应KGF氨基酸位置1和15[SEQ ID NO:2]的氨基酸位置32和46(分别为Cys1和Cys15)的半胱氨酸缺失或被其它氨基酸替换。本发明还公开了编码这些类似物的核酸分子,以及用这些类似物激发非发纤维上皮细胞增殖的方法。
文档编号C07K14/50GK1169733SQ95196749
公开日1998年1月7日 申请日期1995年10月12日 优先权日1995年10月12日
发明者C·莫列斯, W·C·肯尼, B·L·陈, E·W·徐 申请人:安姆根有限公司