专利名称：肌肽分子印迹聚合物、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品技术领域，具体来说涉及一种肌肽分子印迹聚合物、该肌肽分子印迹聚合物的制备方法，及在分离富集生物和食品样品中肌肽方面的应用。
背景技术：
肌肽(L-carnosine)是一种天然二肽，极性很强，只溶于水不溶于任何有机溶剂，存在于脊椎动物的骨骼肌和大脑等组织中，其化学本质是由β_丙氨酰和组氨酸通过肌肽合成酶的作用而形成的。肌肽的含量约为(116 2016)umol/g，在猪肉、牛肉和鸡肉中的含量分别为418mmol、210 mmol和1510mmol，在人体肌肉中的含量为2 20mmol。在同一种动物不同部位肌肽含量不一样，如禽类中:胸肌比腿肌中含量高，鸡肉比鸭肉中含量高。由于肌肽易溶于水，在牛肉浸提液及工业废弃的牛肉预煮液中都含有大量肌肽。因此，从样液及牛肉预煮液中富集和浓缩肌肽能够带来很高的经济价值。目前所采用的分离材料较多的C18、弗罗里硅土及氧化铝等填料只能分离性质及结构相差较大的物质，对结构相似物缺乏专一性识别，严重干扰分离结果的准确性。分子印迹技术可使聚合物结构中形成对模板分子具有特殊性的结合位点及孔穴。在由自由基引发的聚合过程中，模板分子和功能单体形成聚合物，在洗去模板分子后，聚合物内部留下对模板分子具有特异性结合能力的位点及孔穴。分子印迹聚合物(MIPs)具有立体构型和作用位点的双重识别能力，是一种优良的吸附材料。分子印迹固相萃取不仅可以成为仪器分析的前处理方法，而且还能够对有营养价值和经济价值的功能性成分起到分离富集的作用。这些优势是普通色谱填料无法比拟的。关于肌肽的分离主要还是停留在分析检测阶段，对于它的分离富集未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种对肌肽具有专一性识别性能、可以对环境、生物样品和食品样品中的肌肽进行分离提纯的肌肽分子印迹聚合物。本发明的另一目的在于提供该肌肽分子印迹聚合物的制备方法。本发明的再一目的在于该肌肽分子印迹聚合物在分离富集生物和食品样品中肌肽方面的用途。本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的:本发明的肌肽分子印迹聚合物，由下述方法制得:将模板分子肌肽20 25 μ mol、甲基丙烯酸功能单体110 550 μ mol与I 2mL水-乙腈混合体系进行超声波处理混合，冲入氮气密封，O 4°C下充分反应10 14小时，然后将上述混合物加入交联剂乙二醇双甲基丙烯酸酯660 2420 μ mol、引发剂偶氮二异丁腈0.1 0.3mmol,混合均勻后冲入氮气3 6min密封,在容器中，O 4°C环境下，采用30W 250W紫外灯在24小时之内进行本体聚合；将聚合反应后的聚合物从反应容器中取 出，用研钵研磨后过80目标准筛，得到70 85 μ m粒径的分子印迹聚合物微球；用丙酮溶解精细颗粒并将其去除，然后用超纯水清洗聚合物，将模板分子肌肽去除掉，经冷冻真空干燥得到肌肽分子印迹聚合物颗粒；再经冷冻真空干燥得到纯净的肌肽分子印迹聚合物颗粒。本发明的一种肌肽分子印迹聚合物的制备方法，包括下述步骤:
(1)聚合:将模板分子肌肽20 25μ mol、甲基丙烯酸功能单体110 550 μ mol与I 2mL水-乙腈混合体系进行超声波处理混合，冲入氮气密封，0-4°C下充分反应10 14小时，然后将上述混合物加入交联剂乙二醇双甲基丙烯酸酯660 2420 μ mol、引发剂偶氮二异丁腈0.1 0.3mmol,混合均勻后冲入氮气3 6min密封,在容器中，0_4°C环境下,采用30W 250W紫外灯照射12 24小时进行本体聚合；
(2)研磨:将聚合反应后的聚合物从反应容器中取出，用研钵研磨后过80目标准筛，得到70 85 μ m粒径的分子印迹聚合物微球；
(3)洗脱:用丙酮溶解精细颗粒并将其去除，然后用超纯水清洗聚合物，将模板分子肌肽去除掉，经冷冻真空干燥得到肌肽分子印迹聚合物颗粒；
(4)再经冷冻真空干燥得到纯净的肌肽分子印迹聚合物颗粒。上述的一种肌肽分子印迹聚合物的制备方法，其中:洗脱的方法为用200 300mL丙酮去除掉未反应的功能单体丙烯酸、交联剂乙二醇双甲基丙烯酸酯及一些精细粒子，倾倒出去，然后加入500 600mL超纯水萃取模板分子，反复萃取，直到萃取液中不再检测出肌肽为止。 本发明的肌肽分子印迹聚合物分离富集生物和食品中肌肽的方法，包括:
将制得的分子印迹聚合物15 20g装填充到柱内装有筛板的SPE空管内，制成分子印迹固相萃取柱(MISPE)。将含有肌肽的生物和食品样品用超纯水提取出肌肽后，通过超滤装置过滤掉可见脂肪及杂质，最后得到的样品液中含有肌肽等其他氨基酸。将此样液作I 3mL为上样液，确保MISPE能最大限度的保留肌肽，首先用15 20mL有机相先淋洗出干扰物质，然后再用15 20mL超纯水洗脱肌肽，收集超纯水洗脱液，即得到含有肌肽的洗脱液。本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知:肌肽分子印迹聚合物的构建在水环境中进行，采用亲水性的功能单体和交联剂构建肌肽MIPs，采用非共价键分子印迹聚合法，通过本体聚合法构建的分子印迹聚合物，依靠非共价键固定并吸附目标物质，氢键是最为常用非共价键。在聚合过程中，单体与模板化合物之间产生氢键，在交联剂的作用下，单体固定在模板周围并形成了分子量较大的颗粒。将模板化合物洗脱掉，就会留下一个明显的孔穴结构，在这个结构中，单体依靠氢键作用力在样品溶液中吸附目标物质。因此分子印迹聚合物吸附目标物质依靠氢键作为主要作用力，由于氢键在孔穴中数量较少，且位置分布依据聚合时的分子排布和目标物质的形状，所以可以说聚合物内部形成的键合位点和孔穴都是为目标物质“量身打造”的，因此它对目标物质具有特异性吸附能力，即“位点虽少，但效率很高”，只有当目标化物浸透到孔穴中时，才会受到氢键的作用，分子结构不合适的物质就进入不了孔穴中，氢键键合作用就难以实现。在聚合过程中的任何变化，如pH、溶剂的离子强度、单体的浓度、聚合时的交联程度等，都会对最后聚合物的吸附特性造成很大的影响。因此增强氢键作用能够提高吸附效果。采用分子印迹技术结合固相萃取分离富集肌肽，将分子印迹技术应用于功能性成分的富集纯化，扩宽分子印迹技术的使用范围。因此，本发明所开发的制备肌肽分子印迹聚合物的方法以肌肽为模板分子，所得的分子识别材料具有良好的分子识别性能，为肌肽及肌肽结构类似物分子印迹聚合物的合成提供了一种可行的制备方案。对肌肽具有选择性，可以对环境、生物样品和食品样品中的肌肽进行分离提纯。本发明的具体实施方式
由以下实施例详细给出。实施例1
一种肌肽分子印迹聚合物的制备方法，包括下述步骤:
(1)聚合:将模板分子肌肽22μ mol、甲基丙烯酸功能单体220 μ mol与1.3mL水-乙腈混合体系进行超声波处理混合，冲入氮气密封，放在冰箱里(0-4°C )充分反应12小时，然后将上述混合物加入交联剂乙二醇双甲基丙烯酸酯1100 μ mol、引发剂偶氮二异丁腈
0.2mmol，混合均匀后冲入氮气3_6min密封，在容器中，0_4°C环境下，采用30W紫外灯照射24小时，进行本体聚合；
(2)研磨:将聚合反应后的聚合物从反应容器中取出，用研钵研磨后过80目标准筛，得到70-85 μ m粒径的分子印迹聚合物微球；
(3)洗脱:洗脱的方法为用200mL丙酮去除掉未反应的功能单体丙烯酸、交联剂乙二醇双甲基丙烯酸酯及一些精细粒子，倾倒出去，然后加入500mL超纯水萃取模板分子，反复萃取，直到萃取液中不再检测出肌肽为止。(4)再经冷冻真空干燥得到纯净的肌肽分子印迹聚合物颗粒。将所制备的肌肽分子印迹聚合物经典吸附试验证明能达到对肌肽标准物的最大吸附量0.45mg/g ο将所制备的肌肽分子印迹聚合物应用于分离富集生物和食品中肌肽中，具体方法为:将印迹微球干法装填到SPE空管内，制成分子印迹固相萃取小柱(MISPE)，将此色谱柱作为制备柱，离线对分别含有不同浓度的样品液中肌肽进行分离富集，最后用高效液相色谱仪对收集到的样液进行含量测定。MISPE富集步骤:先用30mL甲醇有机溶液活化MIP填料，接着将含有肌肽的生物样品ImL注入到MISPE小柱内，然后以色谱15mL甲醇为淋洗液，首先洗脱出样品中的干扰物质，然后用15mL超纯水做为洗脱液洗脱出肌肽。分离富集效果通过HPLC验证，将甲醇淋洗液和超纯水洗脱液中的肌肽进行比较，MISPE柱对生物样液中肌肽回收率达到达53.56%。表I所示。
权利要求
1.一种肌肽分子印迹聚合物，由下述方法制得:将模板分子肌肽20 25 μ mol、甲基丙烯酸功能单体110 550 μ mol与I 2mL水-乙腈混合体系进行超声波处理混合，冲入氮气密封，O 4°C下充分反应10 14小时，然后将上述混合物加入交联剂乙二醇双甲基丙烯酸酯660 2420 μ mol、引发剂偶氮二异丁腈0.1 0.3mmol，混合均匀后冲入氮气3 6min密封，在容器中，O 4°C环境下，采用30W 250W紫外灯在24小时之内进行本体聚合；将聚合反应后的聚合物从反应容器中取出，用研钵研磨后过80目标准筛，得到70 85μπι粒径的分子印迹聚合物微球；用丙酮溶解精细颗粒并将其去除，然后用超纯水清洗聚合物，将模板分子肌肽去除掉，经冷冻真空干燥得到肌肽分子印迹聚合物颗粒；再经冷冻真空干燥得到纯净的肌肽分子印迹聚合物颗粒。
2.—种肌肽分子印迹聚合物的制备方法，包括下述步骤: (1)聚合:将模板分子肌肽20 25μ mol、甲基丙烯酸功能单体110 550 μ mol与I 2mL水-乙腈混合体系进行超声波处理混合，冲入氮气密封，0-4°C下充分反应10 14小时，然后将上述混合物加入交联剂乙二醇双甲基丙烯酸酯660 2420 μ mol、引发剂偶氮二异丁腈0.1 0.3mmol,混合均勻后冲入氮气3 6min密封,在容器中，0_4°C环境下,采用30W 250W紫外灯照射12 24小时进行本体聚合； (2)研磨:将聚合反应后的聚合物从反应容器中取出，用研钵研磨后过80目标准筛，得到70 85 μ m粒径的分子印迹聚合物微球； (3)洗脱:用丙酮溶解精细颗粒并将其去除，然后用超纯水清洗聚合物，将模板分子肌肽去除掉，经冷冻真空干燥得到肌肽分子印迹聚合物颗粒； (4)再经冷冻真空干燥得到纯净的`肌肽分子印迹聚合物颗粒。
3.如权利要求2所述的一种肌肽分子印迹聚合物的制备方法，其中:洗脱的方法为用200 300mL丙酮去除掉未反应的功能单体丙烯酸、交联剂乙二醇双甲基丙烯酸酯及一些精细粒子，倾倒出去，然后加入500 600mL超纯水萃取模板分子，反复萃取，直到萃取液中不再检测出肌肽为止。
4.肌肽分子印迹聚合物在分离富集生物和食品样品中肌肽方面的用途。
全文摘要
本发明公开了一种肌肽分子印迹聚合物、其制备方法及应用，将模板分子肌肽、甲基丙烯酸功能单体与水-乙腈混合体系进行超声波处理混合，冲入氮气密封，0～4℃下充分反应10～14小时，然后将上述混合物加入交联剂、引发剂，混合均匀后冲入氮气密封，在容器中，0～4℃环境下，采用紫外灯在24小时之内进行本体聚合；聚合物过80目标准筛，得到70～85μm粒径的分子印迹聚合物微球；用丙酮溶解精细颗粒并将其去除，然后用超纯水清洗聚合物，将模板分子肌肽去除掉，经冷冻真空干燥得到肌肽分子印迹聚合物颗粒；再经冷冻真空干燥得到纯净的肌肽分子印迹聚合物颗粒。本发明对肌肽具有专一性识别性能、可以对环境、生物样品和食品样品中的肌肽进行分离提纯。
文档编号C08J9/26GK103254355SQ201310222740
公开日2013年8月21日 申请日期2013年6月6日 优先权日2013年6月6日
发明者朱秋劲, 霍萌 申请人:贵州大学