基于喹啉骨架的铜离子和硫离子双靶点荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物荧光探针领域，更具体地，涉及一种基于喹啉骨架的铜离子和硫离子双靶点荧光探针及其制备方法，以及该双靶点荧光探针在细胞成像中的应用。

背景技术：

人体内铜元素绝大多数都以Cu²⁺表现，同时铜元素又是人体内最丰富的微量元素之一。铜离子在生理代谢过程中扮演着至关重要的角色，例如可以充当活性氧的解毒物种、神经传递素生物合成和降解。然而，细胞内铜离子的紊乱将会严重危害人类的健康，特别是会诱发严重的神经退行性疾病，如Alzheimer、Menkes以及Wilson疾病。同样，硫离子广泛应用于硫酸工业、化肥生产，以及染料、化妆品的制造等领域，人体内硫化细菌的代谢以及含硫氨基酸的代谢都会产生硫离子。人体内硫离子浓度的升高也会严重影响人类的健康，例如会造成人体肌肉损伤、疼痛、粘膜组织损害，严重时可以导致窒息。因此检测人体细胞内的铜离子和硫离子有着重要的意义。

荧光检测具有高灵敏度、高选择性、操作简易、快速响应等优势。细胞荧光成像作为生物和药物科学领域里一种高效的探测手段备受关注。尽管近年来，大量的有关铜离子、硫离子的荧光探针被大量报道，但是尚未有能同时检测这两种离子并将其用于细胞内成像、识别这两种离子的荧光探针。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于喹啉骨架的铜离子和硫离子双靶点荧光探针，以及提供该双靶点荧光探针的制备方法和其在细胞成像中的应用。

喹啉是一个大的共轭体系，可以很容易地产生π到π*的电子跃迁，喹啉基衍生物不仅具有较强的荧光，而且其杂环氮原子能参与配位，即同时具有识别和荧光功能。本发明的发明人依据此特性，设计、合成了一个简单的喹啉骨架类探针，可以高效识别、检测铜离子和硫离子，并同时实现在细胞内识别这两种离子。操作简单、方便，重复性好、稳定性高。

本发明的第一方面是提供一种基于喹啉骨架的铜离子和硫离子双靶点荧光探针(以下简称QLBA)，该双靶点荧光探针具有式I所示的结构：

本发明的第二方面是提供上述双靶点荧光探针的制备方法，该方法包括：

在有机溶剂存在下，将式II所示化合物与喹哪啶酸酰氯接触进行反应，得到式I所示化合物，

本发明的第三方面是提供所述的双靶点荧光探针在细胞成像中的应用。

本发明的特点表现在：

(1)荧光探针QLBA合成简单。

(2)QLBA对Cu²⁺具有高灵敏度和高选择性识别检测。

(3)得到的QLBA-Cu²⁺复合物可以进一步识别硫离子。

(4)运用高分辨质谱、核磁、DET计算等技术手段详细分析了探针对铜离子的识别机理。

(5)可以在活细胞内识别铜离子和硫离子。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1(a)和图1(b)为QLBA的氢谱。

图2(a)和图2(b)为QLBA的碳谱。

图3(a)和图3(b)分别为QLBA在CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液体系中的紫外吸收谱图和荧光发射谱图。

图4(a)为将50μM的不同金属离子加入QLBA(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液后的荧光发射谱图。图4(b)为QLBA(10μM)在CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液中与Cu²⁺(30μM)，和其他金属离子(30μM)的荧光发射谱图，1,QLBA；2,Cu²⁺；3,Cu²⁺+Na⁺；4,Cu²⁺+K⁺；5,Cu²⁺+Mg²⁺；6,Cu²⁺+Ca²⁺；7,Cu²⁺+Co²⁺；8,Cu²⁺+Zn²⁺；9,Cu²⁺+Mn²⁺；10,Cu²⁺+Fe³⁺；11,Cu²⁺+Al³⁺；12,Cu²⁺+Cr³⁺；13,Cu²⁺+Pb²⁺；14,Cu²⁺+Hg²⁺；15,Cu²⁺+Cd²⁺(λex＝370nm)。

图5(a)示出了在QLBA(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液中不断滴加Cu²⁺的荧光发射谱图，其中插图为在QLBA(10μM)在CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液中不断滴加Cu²⁺在508nm处的荧光值与Cu²⁺滴加浓度的滴定曲线。图5(b)示出了铜离子浓度在0～10μM的荧光强度(435nm)与铜离子浓度的关系。

图6(a)示出了在QLBA-Cu²⁺(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH7.2)溶液中加入不同常见阴离子的荧光图谱，1,QLBA；2,QLBA+Cu²⁺；3,QLBA+Cu²⁺+S^2-；then addition of 4,F^-；5,Cl^-；6,Br^-；7,NO₃^-；8,NO₂^-；9,SO₄^2-；10,SO₃^2-；11,OAc^-；12,H₂PO₄^-；13,ClO₄^-；14,赖氨酸；15,半胱氨酸)。图6(b)示出了QLBA-Cu²⁺(10μM)在CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液中加入30μM S^2-，然后加入(4,F^-；5,Cl^-；6,Br^-；7,I^-；8,NO₂^-；9,SO₄^2-；10,SO₃^2-；11,OAc^-；12,H₂PO₄^-；13,ClO₄^-；14,赖氨酸；15,半胱氨酸)的CH₃OH-HEPES缓冲溶液(1/9,v/v,pH 7.2)的荧光发射谱图。(λex＝370nm)

图7(a)示出了在(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)缓冲溶液中不断滴加硫离子的荧光发射谱图。图7(b)示出了硫离子浓度在0～10μM范围内与其荧光强度(435nm)与呈线性关系。

图8为QLBA与2当量Cu²⁺的质谱。

图9(a)为QLBA的核磁氢谱，图9(b)为QLBA+0.5当量Cu²⁺的核磁氢谱，图9(c)为QLBA+1.0当量Cu²⁺，及图9(d)为QLBA+2.0当量Cu²⁺在DMSO-d₆溶剂中的核磁氢谱。

图10(a)和图10(b)示出了DFT计算分析的QLBA/QLBA-Cu²⁺最优化结构。

图11示出了不同浓度QLBA的细胞毒性。

图12a为HeLa细胞作为对照组实验的共聚焦显微镜成像；图12b为HeLa与20μM QLBA共孵育4h后的共聚焦显微镜成像；图12c为HeLa与20μM QLBA共孵育4h，加入20μM Cu²⁺的共聚焦显微镜成像；图12d为HeLa与20μM QLBA共孵育4h，加入20μM Cu²⁺孵育30min，然后加入10μM硫离子的共聚焦显微镜成像；图12e为HeLa与20μM QLBA共孵育4h，加入20μM Cu²⁺孵育30min，然后加入20μM硫离子的共聚焦显微镜成像。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然附图中显示了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

本发明提供一种基于喹啉骨架的铜离子和硫离子双靶点荧光探针，该双靶点荧光探针具有式I所示的结构：

本发明还提供上述双靶点荧光探针的制备方法，该方法包括：

在有机溶剂存在下，将式II所示化合物与喹哪啶酸酰氯接触进行反应，得到式I所示化合物，

所述有机溶剂可以为本领域常规的非质子有机溶剂，优选为二氯甲烷、甲苯和正己烷中的至少一种。在有机合成过程中，所用上述有机溶剂均需要经过干燥处理。

优选地，所述式II所示化合物与喹哪啶酸酰氯的摩尔比为1：0.8-1.2。

优选地，所述方法包括：将喹哪啶酸酰氯与有机溶剂的混合溶液滴加至式II所示化合物与有机溶剂的混合溶液中。

优选地，所述滴加在低温条件下进行，优选为冰浴搅拌。

优选地，所述反应的温度为-4至5℃，时间为4-8小时。

优选地，所述反应的条件为冰浴搅拌。

本发明所述式II所示化合物和喹哪啶酸酰氯均可通过商购获得。

本发明的方法还可以包括常规的后处理步骤，例如冷却、旋蒸溶剂、柱层析等。

本发明还提供所述的双靶点荧光探针在细胞成像中的应用。

根据本发明一种优选实施方式，所述方法的反应方程式如下所示，

包括以下步骤：

将式II所示化合物溶于二氯甲烷，加入反应瓶中，常温搅拌，然后置于冰浴条件下搅拌。将喹哪啶酸酰氯溶于二氯甲烷，用恒压滴液漏斗逐滴滴加到以上反应瓶中。滴加完毕，冰浴条件下搅拌。随后，旋蒸除去溶剂二氯甲烷，得到褐色固体出产品，并通过柱层析分离纯化，得到浅黄色固体粉末的QLBA。

通过以下实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

将式II所示化合物(1.05g,5mmol)溶于二氯甲烷(30mL)，加入到200mL的两口瓶中，放入磁力转子，常温搅拌10分钟，然后置于冰浴条件下搅拌。将事先制备的等物质量的喹哪啶酸酰氯溶于20mL二氯甲烷，用恒压滴液漏斗逐滴滴加到以上反应瓶中。滴加完毕，冰浴条件下搅拌5小时。随后，旋蒸除去溶剂二氯甲烷，得到褐色固体出产品，并通过柱层析分离纯化，得到1.12g浅黄色固体粉末QLBA，产率为62％。

图1(a)和图1(b)为QLBA的氢谱。图2(a)和图2(b)为QLBA的碳谱。

测试例1

1QLBA的光物理表征

1.1测试QLBA的吸收谱图。配置10μM的QLBA的CH3OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液，取2mL加入石英比色皿中，使用紫外-可见分光光度计测试其吸收谱图。

测试QLBA的荧光发射谱图。配置10μM的QLBA溶液于CH3OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液，取2mL加入比色皿中，在荧光分光光度计上测试QLBA的荧光发射谱图。激发波长为360nm，发射区间为390-700nm。

测试例2

2QLBA对不同金属离子的选择性研究

2.1检测体系中，比色皿中有2毫升CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液。检测时每个比色皿中含有不同的金属离子，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Fe²⁺，Mn²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Al³⁺，Pd²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺盐溶液浓度均为30μM，同时含有10μM的QLBA。在荧光分光光度计上进行荧光强度的检测(激发波长为360nm)。

2.2采集并处理数据。

测试例3

3Cu²⁺和S^2-的滴定实验

3.1配置10μM QLBA溶液，溶剂为CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液，取1mL加入比色皿中。

3.2配置20mM的CuCl₂和20mM的Na₂S水溶液。

3.3向比色皿中分别滴加Cu²⁺，Cu²⁺的浓度范围为0～30μM，在荧光分光光度计上依次测试荧光发射谱图。

3.4同法，向比色皿中分别滴加10μM Cu²⁺，然后依此溶液体系为基础，逐滴加入S^2-，测试荧光发射谱图。

3.5采集并处理数据。

测试例4

4QLBA与Cu²⁺的作用机制分析

4.1配置QLBA和5当量的CuCl₂的溶液，进行质谱分析。质谱分析得到QLBA与Cu²⁺的结合比例。

4.2配置QLBA的D6-DMSO溶液，测核磁氢谱，然后逐滴加入CuCl₂的D6-DMSO溶液，每滴加一次，测试一次氢谱。将测试所得的核磁纵向比对，找出变化规律。

4.3在计算机上利用高斯09软件进行密度泛函理论(DFT)计算分析。

测试例5

5细胞培养方法

将HeLa细胞放置于37℃，二氧化碳含量为5％的培养箱中。培养基为含10％FBS的RPMI-1640。在细胞密度约为90％时使用胰酶细胞消化液进行传代，平均2天传代一次。

测试例6

6细胞毒性检测

收集对数期HeLa细胞，调整细胞溶液浓度至50000个/mL，在96孔板中每孔加入100μL。在5％CO₂，37℃的培养箱培养过夜后，加入不同浓度梯度的QLBA100μL，使各梯度浓度为(0，2，5，10，20，50，100μM)。每个梯度五个复孔。培养24h后，每孔加入20μL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的PBS溶液(5mg/mL)，共孵育4h。吸去上清，每孔加入150μL的DMSO，置摇床上低速震荡10分钟，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 570nm处测量各孔的吸光值。

测试例7

7细胞成像

7.1QLBA与HeLa细胞作用成像实验。将HeLa细胞传代至直径为20mm的共聚焦玻底培养皿，在5％CO₂，37℃的培养箱培养24h后。将QLBA加入培养基中，QLBA的浓度为20μM，孵育6h后，移去培养液，用1×PBS清洗细胞六次。在共聚焦显微镜下(Olympus FV1000-IX81confocallaser scanning microscope)观测。激发光选用汞激光器(72.0％405nm)。

7.2细胞内检测QLBA与Cu²⁺和S^2-细胞成像实验。将HeLa细胞传代至直径为20mm的共聚焦玻底培养皿，在5％CO₂，37℃的培养箱培养24h后。将QLBA加入培养基中，QLBA的浓度为20μM，孵育4小时后，加入20μM Cu²⁺孵育30min后移去培养液，用1×PBS清洗细胞4次。在共聚焦显微镜下(Olympus FV1000-IX81confocal laser scanning microscope)观测。激发光选用汞激光器(72.0％405nm)。进行上述平行实验两组，加入铜离子孵育30min结束后，再分别向这两组平行实验中加入10μM和20μM硫离子，孵育30min后移去培养液，用1×PBS清洗细胞4次。在共聚焦显微镜下观测。

8整理数据与分析

8.1QLBA在CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液体系中的紫外吸收和荧光发射谱图。如图3(a)和图3(b)所示，QLBA拥有300～400nm的吸收范围。508nm处为其最大发射波长。

8.2QLBA与不同金属离子的选择性研究

QLBA基于喹啉骨架设计而成，其杂环氮原子的喹啉衍生物可以作为金属离子的螯合位点，所以进行QLBA与不同金属离子之间的选择性研究，本发明共选取了14种常见金属离子(Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Cr³⁺，Mn²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Al³⁺，Pd²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺)。

如图4(a)和图4(b)所示，加入了不同的金属离子后，Cu²⁺对QLBA的荧光显示出了显著的淬灭，而对其他离子并没有明显的变化。然后在此体系中继续加入其他离子并没有引起其他明显变化，此结果说明QLBA对Cu²⁺有特异响应，且在其他离子存在的条件下，不会干扰QLBA对Cu²⁺的特异响应。

8.3Cu²⁺对QLBA的滴定实验

如图5(a)和图5(b)所示，在QLBA(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液体系中，随着Cu²⁺的滴加浓度不断增加，QLBA的最大发射波长(435nm)处的荧光值不断下降，当Cu²⁺的滴加浓度达到10μM时，QLBA的荧光强度基本淬灭。当Cu²⁺的滴加浓度在0～10μM时，QLBA的最大发射波长(435nm)和Cu²⁺浓度呈现较好的线性。通过LOD＝3*Sb/S计算其检测限，QLBA对Cu²⁺的检测限为2.2×10^-7M。

8.4QLBA-Cu²⁺体系对S^2-的检测

如图6(a)所示，QLBA-Cu²⁺(10μM)体系中加入了不同的阴离子后，S^2-可以使QLBA-Cu²⁺原先已淬灭的荧光显著增强，而其他离子并没有明显的变化。然后在此体系中继续加入其他离子并没有引起其他明显变化，如图6(b)所示，此结果说明QLBA-Cu²⁺对硫离子特异响应，且在其他离子存在的条件下，不会干扰QLBA对Cu²⁺的特异响应。

如图7(a)和图7(b)所示，在QLBA-Cu²⁺(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液体系中，随着硫离子的滴加浓度不断增加，体系在435nm处的荧光值逐渐增强，当硫离子的滴加浓度达到10μM时，QLBA-Cu²⁺体系的荧光强度基本达到最大值。并且，在0～10μM范围内时，体系的最大发射波长(435nm)和硫离子浓度呈现较好的线性。通过LOD＝3*Sb/S计算其检测限，QLBA对Cu²⁺的检测限为0.46μM。

8.5QLBA与Cu²⁺和Fe³⁺的作用机制研究

图8的质谱结果显示，m/z 365.1389(计算值365.1397)对应于[QLBA+H]⁺,m/z 426.0533(计算值426.0536)对应于[QLBA+Cu-H]⁺，此质谱实验结果可以明确显示探针QLBA与铜离子之间是1:1的配位关系。

图9表明苯并咪唑上的杂原子N、喹啉单元中的N以及酰胺键中的N参与到与铜离子的配位结合。

通过DFT计算分析，QLBA与Cu²⁺的结合位点如图10(a)和图10(b)所示。Cu²⁺和QLBA结构上的N(1)，N(2)，N(3)原子的距离分别为。图10中的QLBA，及复合物QLBA-Cu²⁺结构均为最优结构。

8.6细胞成像

8.6.1细胞毒性

通过MTT法研究QLBA的细胞毒性，结果如图11所示，当QLBA浓度达到20μM时孵育24h后，细胞存活率达90％以上。

8.6.2QLBA的细胞内识别铜离子以及进一步识别硫离子

图12a-图12e中的结果显示当QLBA与HeLa细胞共孵育后4h后进行共聚焦显微成像，细胞显示蓝色荧光，加入等量铜离子后荧光被淬灭，然后加入硫离子共培养，荧光又会恢复。此结果显示QLBA能够用作细胞内识别Cu²⁺，同时又可以进一步识别硫离子。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。