一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法与流程

文档序号:11126101阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法,其特征在于,所述的方法包含如下的步骤:

1)转基因载体构建:

应用无启动子的pEGFP-1质粒体作为载体,在外源基因之前插入β-actin基因启动子构建成转基因质粒;

2)制备脂质体和外源DNA质粒复合物:

将阳离子脂质体溶液与目的转基因质粒溶液混合制成脂质体和外源DNA质粒复合物;

3)转染牙鲆胚胎细胞:

待牙鲆胚胎细胞汇合度达70%—80%时,把脂质体和外源DNA质粒复合物加入到细胞培养基中对牙鲆胚胎细胞进行转染;

4)G418筛选牙鲆阳性胚胎细胞:

转染24h后用一定浓度的G418对荧光检测呈阳性的牙鲆胚胎细胞进行筛选,之后更换为含有G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤2)中细胞转染中阳离子脂质体溶液与目的质粒溶液的体积比为18~22:1。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤4)中用一定浓度的G418对荧光检测呈阳性的牙鲆胚胎细胞进行筛选,是用浓度为600μg/m L的G418对荧光检测呈阳性的牙鲆胚胎细胞进行筛选。

4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤4)中含有G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集,是使用含有300μg/mL G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集。

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