一种DNA甲基化检测试剂盒及其应用的制作方法
本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一种高灵敏度DNA甲基化检测试剂盒及其应用。
背景技术：
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表观遗传是指DNA序列没有发生变化但是基因表达发生了可遗传的变化。表观遗传是由非遗传机制引起，主要包括DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色质重塑、基因沉默和RNA编辑等调控机制，其中DNA甲基化是表观遗传研究的重要内容之一。
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase,DNMT)催化作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine,SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。DNA甲基化不改变DNA的一级结构，但是能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而在基因的表达调控、DNA的复制、细胞的生长发育、衰老以及人类疾病发生过程中发挥重要作用，因此DNA甲基化具有重要的生物学意义。
DNA甲基化检测分为全基因组DNA甲基化检测和特定基因的甲基化检测两个方面，全基因组DNA甲基化检测主要以高效液相色谱和质谱等化学方法为检测手段。特定基因的甲基化检测包括亚硫酸盐测序法(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)、甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)和甲基化敏感的高分辨率熔解曲线法(Methylation sensitive High Resolution Melting，MS-HRM)等多种检测方法，其中BSP和MSP是特定基因甲基化检测最广泛使用的方法。BSP被认为是特定基因甲基化检测的金标准，是目前最精准的甲基化检测方法，其基本原理是以亚硫酸盐修饰的DNA为模板序列，在待检测位点的两端设计一对引物，该引物以甲基化和未甲基化的模板都能扩增出目的片段，获得目的片度经纯化之后进行克隆和测序，通过分析测序结果判定待检位点是否发生甲基化。MSP基本原理是以亚硫酸盐修饰的DNA为模板序列，在待检位点设计两对引物，分别为甲基化特 异性引物和非甲基化特异性引物，待检位点若发生甲基化，甲基化特异性引物能扩增出目的片段，非甲基化引物未能扩增出目的条带，反之亦然。MS-HRM是一种新型高通量的甲基化检测的方法，其基本的原理是通过比较熔解曲线的熔解温度和峰型图达到检测的目的。单个CpG位点的甲基化水平和平均甲基化水平对熔解曲线的形成造成影响。以亚硫酸盐修饰的DNA为模板序列，在非CpG岛位置设计一对引物，这对引物中间包含一些CpG岛，一旦这些CpG岛发生甲基化，胞嘧啶不发生变化，未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶，样品中的GC含量发生了变化，最终体现在熔解曲线Tm值的差异。这三种检测方法各有优势，BSP是甲基化检测的金标准，是最精准的甲基化检测方法。MSP是一种定性检测，存在假阳性的现象。MS-HRM是一种高通量的适用于待检位点是否甲基化的初筛。BSP和MS-HRM的结果一般都需要经过BSP的进一步验证。
MSP、BSP和HS-HRM都是以亚硫酸盐修饰的DNA为模板序列，设计引物和PCR，所以DNA的亚硫酸盐修饰是特定基因甲基化检测方法的基础，DNA亚硫酸盐修饰具体是指焦亚硫酸钠或者偏重亚硫酸氢钠对单链DNA序列中的胞嘧啶修饰，未甲基化的胞嘧啶经修饰之后转化为胸腺嘧啶，甲基化的胞嘧啶经修饰之后仍为胞嘧啶。DNA亚硫酸盐修饰的效果将直接决定甲基化检测的精准度。另外，对经焦亚硫酸钠或者偏重亚硫酸氢盐修饰的DNA进行精准的去磺化以及高效率的回收和纯化也是保证甲基化检测精准度的关键。由于焦亚硫酸钠或者偏重亚硫酸氢钠对处于双链结构中的胞嘧啶不起作用，首先需要对双链DNA进行变性解链成单链，双链DNA的变性通常采用碱变性(0.3mol/L NaOH)或者热变性(98℃)，然后在pH5.0的偏亚硫酸氢钠溶液中经过两个小时以上的处理。从双链DNA的变性到偏重亚硫酸氢钠溶液的处理这些实验过程势必造成不同程度的DNA断裂、降解以及脱嘌呤等，导致修饰过的DNA是大小不同的DNA片段，所以如何从DNA修饰液中高效回收这些DNA片段是甲基化精准检测的关键一环。目前，市场上的甲基化检测试剂盒大部分采用硅胶膜吸附柱作为修饰DNA的吸附介质，但是硅胶膜吸附柱的回收实验证明其对小于200bp的DNA片段回收率很低，从而造成基因组DNA的部分片段损失。所以如何提高修饰DNA的回收率以及保证回收的修饰DNA信息的完整性是目前亟需解决的问题。
技术实现要素：
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本发明公开了一种DNA甲基化检测试剂盒及其应用，本发明的DNA甲基化检测试剂盒具有检测灵敏度高、完整性好，操作适合自动化和高通量化的特点。
PCR是BSP、MSP和MS-HRM通用的技术，然而PCR常用的Taq DNA Polymerase在扩增过程中不能区分甲基化和非甲基化的胞嘧啶。为了将DNA序列中甲基化和非甲基化的胞嘧啶区分开来，需要将适量的基因组DNA经碱变性或者热变性成单链DNA，单链DNA在一定条件下经过亚硫酸盐溶液修饰，未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不变。修饰过的DNA经纯化作为BSP，MSP和MS-HRM的模板，保证甲基化检测方法的有效性。
本发明的DNA甲基化检测试剂盒采用磁分离技术从修饰DNA溶液中回收DNA片段，具有回收效率高，回收片段完整性好，可与核酸自动提取仪配合使用实现高通量化的甲基化检测，节约大量时间和提高检测效率。
本发明首先提供了一种DNA甲基化检测试剂盒，包括CT转化液、抗氧化剂、结合液、洗涤液、去磺化液、洗脱液和磁珠悬液，各试剂包括：
CT转化液：1.0-2.7mol/L Na2S2O5，NaOH调节溶液pH至4.0-6.0。
抗氧化剂：5-50mM C6H4(OH)2(对苯二酚)
结合液：2-8mol/L Gu-HCl(盐酸胍)，0.5-5mol/L KAC,调节溶液pH至4.0-5.0。
洗涤液：50-85％乙醇水溶液(体积百分比浓度)
去磺化液：50-500mM NaOH，50-80％乙醇(体积百分比浓度)
洗脱液：5-15mM Tris，0.5-5mM EDTA，pH7.5-8.5
磁珠悬液：羧基磁珠，磁珠粒径为100-200nm
所述的CT转化液，抗氧化剂，结合液，去磺化液和洗脱液溶剂均为双蒸水。
较为优选的，CT转化液中，Na2S2O5浓度为1.5-2.5mol/L。
本发明第二方面提供了上述DNA甲基化检测试剂盒用于修饰DNA的用途。
所述修饰DNA是指将待修饰DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不变。
利用本发明的DNA甲基化检测试剂盒可以将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不变，达到精准检测特定位点是否发生甲基化。
利用本发明试剂盒获得高纯度的修饰DNA可以直接作为BSP、MSP和MS-HRM的模板DNA。
本发明第三方面提供了一种使用本发明的DNA甲基化检测试剂盒获得修饰DNA的方法，其包含如下步骤：
1)CT转化反应：将待处理的DNA样本与CT转化液和抗氧化剂混匀后进行CT转化反应获得含有修饰DNA的反应液；
2)磁珠结合：将反应液与结合液及磁珠悬液混匀使修饰DNA与磁珠结合；
3)磁分离并洗涤磁珠获得结合有修饰DNA的磁珠；
4)去磺化：将磁珠悬浮于去磺化液中去磺化；
5)磁分离并洗涤去磺化的磁珠；
6)洗脱：将去磺化的磁珠与洗脱液混匀反应；
7)将步骤6)的反应液磁分离后取上清获得纯化的修饰DNA溶液。
其中，
步骤1)中，每20μl待处理的DNA样本加入100-500μl CT转化液和10-50μl抗氧化剂。转化液中含有碱，因此可对双链DNA样本进行碱变性及CT转化。较佳的，对混合液在双链DNA热变性条件下处理后再进行CT转化。热变性条件可采用常规如98℃10min左右。CT转化可在60℃下进行约2小时。
步骤2)中，每20μl待处理的DNA样本对应混合200-500μl结合液和15-50ul磁珠悬液，可在室温下进行结合反应。结合反应时间可为3分钟左右。
步骤4)中，每20μl待处理的DNA样本对应采用100-500μl去磺化液。较佳的，去磺化反应的反应温度为37℃，反应时间为10-30min。
较佳的，步骤5)洗涤去磺化磁珠后进一步对去磺化磁珠进行干燥。干燥条件可以是室温干燥10min或者55℃加热干燥5min。
步骤6)中，每20μl待处理的DNA样本对应采用10-50μl洗脱液。洗脱条件优选65℃水浴5min。
相比目前市售的甲基化检测试剂盒，本发明的一大改进在于采用纳米磁珠代替硅胶膜吸附柱，该改进至少带来三方面的优势，其一是实验结果表明纳米磁珠对 核酸分子的吸附率受片段大小的影响比较小，尤其是对小于200bp以及大于3kb的核酸片段吸附率远远优于硅胶膜吸附柱；其二是纳米磁珠回收修饰DNA时无需反复离心，降低离心剪切力对DNA片段的损伤；最后是纳米磁珠可以和核酸自动提取仪配套使用，实现甲基化检测的高通量化和自动化。
附图说明
图1：BSP产物电泳图
条带从左到右依次为Marker，Marker右边两条带为采用本发明试剂盒回收CT转化产物为模板的BSP产物；最右边两条带为对照试剂盒回收CT转化产物为模板的BSP产物。
图2：BSP产物电泳图
条带从左到右依次为Marker，Marker右边每两条带为一组，分别为CT转化液(Na2S2O5 1.5mol/L)，CT转化液(Na2S2O5 2mol/L)和CT转化液(Na2S2O5 2.5mol/L)对应的以纯化的CT转化产物为模板的BSP产物。
图3：BSP产物电泳图
条带从左到右依次为Marker，Marker右边分别为实例3-1至3-10对应的以纯化的CT转化产物为模板的BSP产物。
图4：本发明阳性克隆子测序结果与对照试剂盒阳性克隆子测序结果的比对分析部分截图
Origin sequence是未经亚硫酸盐修饰的基因部分序列，BSP-A1至BSP-A5是本发明阳性克隆子测序结果，BSP-Z1至BSP-Z5是对照试剂盒阳性克隆子的测序结果。图4中显示碱基的位置表示与基因的原始序列不同，反之，不显示碱基。
图5：本发明范围内的CT转化液对应的阳性克隆子测序结果比对分析部分截图Origin sequence是未经亚硫酸盐修饰的基因部分序列，BSP-A1至BSP-A5是本发明中CT转化液(Na2S2O5 1.5mol/L)对应的阳性克隆子测序结果，BSP-B1至BSP-B5是是本发明中CT转化液(Na2S2O5 2.0mol/L)对应的阳性克隆子测序结果，BSP-C1至BSP-C5是是本发明中CT转化液(Na2S2O5 2.5mol/L)对应的阳性克隆子测序结果.图5中显示碱基的位置表示与基因的原始序列不同，反之，不显示碱基。
图6：本发明实施例3-1至3-10对应的阳性克隆子测序结果比对分析部分截图 Origin sequence是未经亚硫酸盐修饰的基因部分序列，BSP3-1-1至BSP3-1-5是实例3-1对应的5个阳性克隆子测序结果，后面以此类推。图6中显示碱基的位置表示与基因的原始序列不同，反之，不显示碱基。
具体实施方式
以下实例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到。
下面结合BSP方法的实例来充分说明本发明试剂盒的修饰效果和详细的实验操作。
实施例1
试剂盒的配制与准备：
CT转化液：2.5mol/L Na2S2O5，NaOH调节溶液pH至5.0
抗氧化剂：10mM C6H4(OH)2(对苯二酚)
结合液：4mol/L Gu-HCl(盐酸胍)，1mol/L KAC,调节溶液pH至4.5
洗涤液：70％乙醇
去磺化液：100mM NaOH，70％乙醇
洗脱液：10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0
磁珠悬液：羧基磁珠，磁珠粒径为200nm
CT转化液，抗氧化剂，结合液，去磺化液和洗脱液溶剂均为双蒸水。
上述试剂分别配置完成后装配试剂盒。
本发明的试剂盒操作时适用下列详细步骤：
步骤1、向PCR管中加入0.2-2μg human gDNA，如果DNA样品的体积小于20ul，加入ddH2O至20μl。
步骤2、向上述管中加入100-500μl CT转化液和10-50μl抗氧化剂，充分温和混匀，并按照下述程序进行反应：98℃10min；98℃30s；60℃150min。
步骤3、反应完成之后，将上述反应液转移至1.5ml EP管中。
步骤4、向上述反应液中加入200-500μl结合液和15-50ul磁珠悬液，充分振荡混匀，室温结合3min，间或混匀。
步骤5、将上述EP管置于磁分离架上，进行磁分离，吸弃上清，保留磁珠，从磁分离架上取出离心管。
步骤6、向上述磁珠中加入300-900μl洗涤液，充分振荡混匀。
步骤7、将EP管置于磁分离架上，进行磁分离，吸弃上清，保留磁珠，从磁分离架上取出离心管。
步骤8、向上述磁珠中加入100-500μl去磺化液，充分悬浮磁珠，37℃放置10-30min，间或混匀。
步骤9、将EP管置于磁分离架上，进行磁分离，吸弃上清，保留磁珠，从磁分离架上取出离心管。
步骤10、向上述磁珠中加入300-900μl洗涤液，充分振荡混匀。
步骤11、将EP管置于磁分离架上，进行磁分离，吸弃上清，保留磁珠，从磁分离架上取出离心管。
步骤12、重复步骤10-11一次。
步骤13、磁珠室温干燥10min或者55℃加热干燥5min。
步骤14、向干燥过的磁珠中加入10-50μl洗脱液，65℃水浴5min，间或混匀。
步骤15、将EP管置于磁分离架上，进行磁分离，吸取上清，即为纯化的DNA溶液。
上述的步骤4中，在室温下放置过程中需要每隔1min将离心管颠倒5次，以混匀溶液。
上述的步骤8中，37℃放置过程中需要每2-3min将离心管颠倒一次，保证磁珠处于悬浮状态，提高去磺化的效率。
上述的步骤8中，去磺化液的pH在10以上，所以选择耐碱性的磁珠很重要。
上述的步骤14中，在65℃水浴5min过程中需要每隔1-2min轻摇离心管3-4次，以使磁珠保持悬浮状态，提高洗脱效率。
在上述范围内使用试剂盒，效果没有明显差异。为平行比较，以下实例统一采用下列步骤：
步骤1、向PCR管中加入0.5μg human gDNA，加入ddH2O至20μl。
步骤2、向上述管中加入208μl CT转化液和12μl抗氧化剂，充分温和混匀， 并按照下述程序进行反应：98℃10min；98℃30s 60℃150min。
步骤3、反应完成之后，将上述反应液转移至1.5ml EP管中。
步骤4、向上述反应液中加入240μl结合液和30μl磁珠悬液，充分振荡混匀，室温结合3min，间或混匀。
步骤5、将上述EP管置于磁分离架上，进行磁分离，吸弃上清，保留磁珠，从磁分离架上取出离心管。
步骤6、向上述磁珠中加入700μl洗涤液，充分振荡混匀。
步骤7、将EP管置于磁分离架上，进行磁分离，吸弃上清，保留磁珠，从磁分离架上取出离心管。
步骤8、向上述磁珠中加入200μl去磺化液，充分悬浮磁珠，37℃放置20min，间或混匀。
步骤9、将EP管置于磁分离架上，进行磁分离，吸弃上清，保留磁珠，从磁分离架上取出离心管。
步骤10、向上述磁珠中加入700μl洗涤液，充分振荡混匀。
步骤11、将EP管置于磁分离架上，进行磁分离，吸弃上清，保留磁珠，从磁分离架上取出离心管。
步骤12、重复步骤10-11一次。
步骤13、磁珠55℃加热干燥5min。
步骤14、向干燥过的磁珠中加入15μl洗脱液，65℃水浴5min，间或混匀。
步骤15、将EP管置于磁分离架上，进行磁分离，吸取上清，即为纯化的DNA溶液。为了验证采用本发明获得的CT转化产物转化效果，进行实施例1-1。以获得CT转化产物为模板，进行BSP实验，通过对BSP产物测序结果分析说明CT转化产物的转化效果。
实施例1-1
本实例采用本发明的试剂盒检测人的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog，PTEN)启动子区的一段序列是否发生甲基化。PTEN是肿瘤抑制基因，可以负调控肿瘤细胞的生长。人的基因组DNA是采用磁珠法动物组织基因组抽提试剂盒(B518721)从胃癌培养细胞中抽提获得。
为了证实本发明试剂盒检测结果的可靠性，采用市购同类产品作为对照试剂 盒同时处理500ng人的细胞基因组DNA。
试验步骤：
BSP实验：
引物设计：以PTEN基因启动子区的序列为靶序列，采用ABI公司Methyl primer Express软件分析查找启动区的CPG岛，然后设计一对BSP引物，引物序列如下所示。
BSP-F：GGGTTAGGTGGTTTTTGAGAA(SEQ ID NO:1)
BSP-R：ACCTTTACCTAAAAATTCCCCC(SEQ ID NO:2)
BSP反应体系的建立
以从胃癌培养细胞中抽提的基因组DNA为起始样本，分别采用以实施例1的试剂盒和对照试剂盒对从胃癌细胞中获得DNA进行CT转化处理，获得纯化的CT转化产物用酶标仪测定纯化的DNA的浓度，浓度测定值如附表1所示。
表1
1.为采用本发明的试剂盒纯化的CT转化产物浓度值；
2.为对照试剂盒纯化的CT转化产物浓度值。
分别以实施例1的试剂盒和对照试剂盒纯化的CT转化产物为模板，建立如下反应体系：
BSP反应条件：
电泳与回收：
BSP产物采用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如附图1所示，PCR产物胶回收采用磁珠法DNA胶回收试剂盒(B518743)回收。
克隆与测序：
BSP产物按照T载体克隆试剂盒完成BSP产物连接、转化、培养和挑斑。菌落PCR鉴定为阳性克隆子进行扩大培养，质粒抽提，抽提的阳性质粒送至生工测序部测序，本发明试剂盒和对照试剂盒至少保证5个阳性克隆子测序成功。
本发明与对照试剂盒阳性克隆子测序结果比对分析部分截图如图4所示。统计分析表明本发明非CG二核苷酸中的C转化为T的转化效率为97％以上，与对照试剂盒相比转化效率相当；本发明与对照试剂盒的CG二核苷酸中的C转化为T的效率很低，说明序列中的CG二核苷酸的C碱基被甲基化。
实施例2
参考实施例1配制试剂盒，验证CT转化液中Na2S2O5的浓度在本专利公布的范围内的有效性。
CT转化液中Na2S2O5的浓度分别设置为1.5mol/L，2mol/L和2.5mol/L，0.3mol/L NaOH调节溶液pH至5.0。试剂盒中其他试剂与实施例1相同。具体的 实验操作步骤与实施例1相同。另外，为了验证本实施例获得CT转化产物的有效性，进行实施例2-1。
实施例2-1
本实例采用本发明的试剂盒检测人的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog，PTEN)启动子区的一段序列是否发生甲基化。PTEN是肿瘤抑制基因，可以负调控肿瘤细胞的生长。人的基因组DNA是采用磁珠法动物组织基因组抽提试剂盒(B518721)从胃癌培养细胞中抽提获得。
为了证实本发明中范围内的CT转化液有效性，选取本专利范围内的三个浓度梯度的Na2S2O5，配制成CT转化液，分别同时处理500ng人的细胞基因组DNA。
试验步骤：
BSP实验：
引物设计：以PTEN基因启动子区的序列为靶序列，采用ABI公司Methyl primer Express软件分析查找启动区的CPG岛，然后设计一对BSP引物，引物序列如下所示。
BSP-F：GGGTTAGGTGGTTTTTGAGAA(SEQ ID NO:1)
BSP-R：ACCTTTACCTAAAAATTCCCCC(SEQ ID NO:2)
BSP反应体系的建立
以从胃癌培养细胞中抽提的基因组DNA为起始样本，分别采用以实施例2-1的试剂盒对从胃癌细胞中获得DNA进行CT转化处理，获得纯化的CT转化产物用酶标仪测定纯化的DNA的浓度，浓度测定值如附表2所示。
表2
1.纯化的CT转化液(Na2S2O5 1.5mol/L)转化的CT转化产物的浓度值；
2.纯化的CT转化液(Na2S2O5 2mol/L)转化的CT转化产物的浓度值；
3.纯化的CT转化液(Na2S2O5 2.5mol/L)转化的CT转化产物的浓度值；
分别以实施例2的试剂盒纯化的CT转化产物为模板，建立如下反应体系：
BSP反应条件：
电泳与回收：
BSP产物采用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如附图2所示，PCR产物胶回收采用磁珠法DNA胶回收试剂盒(B518743)回收。
克隆与测序：
BSP产物按照T载体克隆试剂盒完成BSP产物连接、转化、培养和挑斑。菌落PCR鉴定为阳性克隆子进行扩大培养，质粒抽提，抽提的阳性质粒送至生工测序部测序，本发明中优化CT转化液的实验至少保证5个阳性克隆子测序成功。
本发明范围内的CT转化液对应的阳性克隆子测序结果比对分析部分截图如图5所示。统计分析本发明范围内的CT转化液处理胃癌细胞基因组DNA，非CG二核苷酸中的C转化为T的转化效率为97％以上，与实例1-1效果相当，说明CT转化液在本专利公布的范围内的有效性。
实施例3
为了验证本专利试剂盒中每种溶液的每种组分的有效范围，按照表3中每种溶液中各组分的浓度配制溶液，具体的实验操作步骤与实施例1相同。另外，为了验证本实施例获得CT转化产物的有效性，进行实施例3-1至3-10。
表3试剂盒中每种溶液的每种组分的浓度范围
实施例3-1至3-10
本组实例采用本发明的试剂盒检测人的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog，PTEN)启动子区的一段序列是否发生甲基化。PTEN是肿瘤抑制基因，可以负调控肿瘤细胞的生长。人的基因组DNA是采用磁珠法动物组织基因组抽提试剂盒(B518721)从胃癌培养细胞中抽提获得。
为了证实本发明每种溶液的有效范围，按照表3所示的每种溶液的每种组分含量配制溶液，分别同时处理500ng人的细胞基因组DNA。
试验步骤：
BSP实验：
引物设计：以PTEN基因启动子区的序列为靶序列，采用ABI公司Methyl primer Express软件分析查找启动区的CPG岛，然后设计一对BSP引物，引物序列如下所示。
BSP-F：GGGTTAGGTGGTTTTTGAGAA (SEQ ID NO:1)
BSP-R：ACCTTTACCTAAAAATTCCCCC(SEQ ID NO:2)
BSP反应体系的建立
以从胃癌培养细胞中抽提的基因组DNA为起始样本，采用表3所示的本组实施例对从胃癌细胞中获得DNA进行CT转化处理，获得纯化的CT转化产物用酶标仪测定纯化的DNA的浓度，浓度测定值如附表4所示。
表4
分别以实施例3-1至3-10的试剂盒纯化的CT转化产物为模板，建立如下反应体系：
BSP反应条件：
电泳与回收：
BSP产物采用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如附图3所示，PCR产物胶回收采用磁珠法DNA胶回收试剂盒(B518743)回收。
克隆与测序：
BSP产物按照T载体克隆试剂盒完成BSP产物连接、转化、培养和挑斑。菌落PCR鉴定为阳性克隆子进行扩大培养，质粒抽提，抽提的阳性质粒送至生工测序部测序，本发明中优化CT转化液的实验至少保证5个阳性克隆子测序成功。
本发明范围内的CT转化液对应的阳性克隆子测序结果比对分析部分截图如图6所示。统计分析本发明范围内的CT转化液处理胃癌细胞基因组DNA，非CG二核苷酸中的C转化为T的转化效率为97％以上，与实例1-1和2-1效果相当，说明本试剂盒中溶液在本专利公布的范围的有效性。
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gggttaggtg gtttttgaga a 21
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 引物
<400> 2
acctttacct aaaaattccc cc 22
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