对铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜抑制作用的研究方法与流程

本发明涉及一种抑制生物被膜的方法，具体涉及一种体外抑制铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜的研究方法，属于生物相关技术领域。

背景技术：

铜绿假单胞菌及烟曲霉菌是自然界中较常见的细菌及真菌，且为较常见的条件致病菌。无论是慢阻肺继发肺内感染还是支扩肺内常见定植菌，亦或是近年发病率显注升高的肺结核合并细菌真菌感染，铜绿假单胞菌及烟曲霉菌均为培养所常见的菌类。细菌及真菌在人体内生长主要以形成生物被膜的方式存在，混合感染则可形成混合生物被膜使之发挥更强大的耐药性。目前国内外对于混合生物被膜的研究报导较少，国内外文献有关于铜绿假单胞菌及烟曲霉菌的研究仅限于铜绿假单胞菌对于烟曲霉菌的抑制作用的研究，而没有深入到两者所形成的混合生物被膜的研究领域，这就给了该项研究的很大空间。

密度感应系统是指细菌通过监测其群体的细胞密度，利用自身信号分子来调节特定的基因表达，以保证生物被膜中营养物质的运输和废物的排出，避免细菌过度生长而造成空间和营养物质缺乏。密度感应系统对于细菌的调节作用包括：生物膜形成，生物发光，独立基因的调节，抗生素的产生等等。

利用铜绿假单胞菌的密度感应系统对铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜的研究尚属空白。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种体外抑制铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜的方法，以弥补现有技术的不足。

铜绿假单胞菌的密度感应系统主要包括：las、rhl、pqs三个系统，其中las系统活化大量调节因子如rhlR.rhlI的转录，因而其在铜绿毒力决定因素的调节中占重要地位。其中las由lasR、lasI基因组成，rhl由rhlR、rhlI基因组成。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：

一种密度感应系统对铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜抑制作用的研究方法，包括以下步骤：

(1)烟曲霉孢子悬液的制备；

(2)铜绿假单胞菌野生菌株及其缺陷菌株菌液的制备：挑取铜绿假单胞菌野生菌株单菌落及铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌株单菌落，分别接种于RPMI-1640培养基中，再稀释；

(3)体外静止两种混合生物被膜模型的建立实验分为6组，依次是烟曲霉菌-野生型铜绿假单胞菌组(A·f+PAO1)，烟曲霉菌-铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组(A.f+P.a lasI/rhlI)，烟曲霉菌组(A.f)，野生型铜绿假单胞菌组(PAO1)，铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组(P.a lasI/rhlI)，RPMI-1640培养基作为空白对照组，每组接种于细胞培养板，其中每孔已事先各放置圆形玻璃细胞爬片，再将野生型铜绿假单胞菌液及铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌液分别加入相应组中，恒温孵育；

(4)对于上述步骤(3)中不同生物被膜形成后，进行定量分析。

进一步的，所述步骤(1)具体为：受试烟曲霉菌株接种至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，收集孢子，配置RPMI-1640培养基；将收集到的孢子液加入到该RPMI-1640培养基内，用血细胞计数板调节孢子浓度，作为建立体外混合生物被膜模型的孢子悬液。

进一步的，所述步骤(2)中经过稀释后，上述两种细菌的终浓度为1×10^{^8}CFU/mL。

进一步的，所述步骤(4)中，采用4结晶紫染色法进行定量分析。

一种体外抑制铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜的方法，该方法利用铜绿假单胞菌的密度感应系统对该生物被膜进行抑制。

进一步的，上述密度感应系统为lasI/rhlI型密度感应系统。

本发明的优点和技术效果：

本发明明确了铜绿假单胞菌密度感应系统对铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜的形成具有显著的抑制作用。可分别通过结晶紫原位染色法通过酶标仪测得OD值及正置显微镜镜下观察各组混合生物被膜的形态结构来得出铜绿假单胞菌密度感应系统对铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜的形成具有显著的抑制作用的结论。本发明利用密度感应系统对铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜的形成具有抑制作用。对于感染的治疗及相关抗生素的应用有着积极的参考和指导作用。

本实验方法也可用于其他类型的密度感应缺陷铜绿假单胞菌株和烟曲霉菌所形成的混合生物被膜的研究，观察其与野生型铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜的比较，从而发现铜绿假单胞菌的密度感应系统对野生型铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜具有抑制作用。亦可用于观察研究其它细菌的密度感应系统对于其他细菌-其他真菌类混合生物被膜有无抑制作用的研究。

附图说明

图1为本发明中各组别的吸光度值的比较分析图。

图2为本发明中各组别电镜图。

具体实施方式

以下通过具体实施例并结合附图对本发明进一步解释和说明。

实施例1：

一种验证铜绿假单胞菌的密度感应系统对体外抑制铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜的方法，包括以下步骤：

(1)烟曲霉孢子悬液的制备受试烟曲霉菌株接种至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，37℃恒温复苏72小时，用8mL无菌纯水冲洗马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基斜面收集孢子。配置用3-(N-吗啉基)丙磺酸-4-吗啉丙磺酸缓冲后pH为7.0的RPMI-1640培养基。将收集到的约8mL孢子液加入到约30mL该RPMI-1640培养基内，用血细胞计数板调节孢子浓度为1×10^{^6}CFU/mL,作为建立体外混合生物被膜模型的孢子悬液,于生物被膜混合前16小时配制；

(2)铜绿假单胞菌野生菌株及其缺陷菌株菌液的制备挑取铜绿假单胞菌野生菌株单菌落(如图标记为35)及铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌株单菌落(如图标记为42)，分别接种于20mL 3-(N-吗啉基)丙磺酸-4-吗啉丙磺酸缓冲后pH为7.0的RPMI-1640培养基中，37℃恒温摇床孵育20-24小时(转速220转/分)后，用3-(N-吗啉基)丙磺酸-4-吗啉丙磺酸缓冲后pH为7.0的RPMI-1640培养基稀释10倍，使这两种细菌的终浓度为1×10^{^8}CFU/mL；

(3)体外静止两种混合生物被膜模型的建立实验分为6组，依次是烟曲霉菌-野生型铜绿假单胞菌组(A·f+PAO1)，烟曲霉菌-铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组(A.f+P.alasI/rhlI)，烟曲霉菌组(A.f)，野生型铜绿假单胞菌组(PAO1)，铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组(P.a lasI/rhlI)，RPMI-1640培养基作为空白对照组。接种于灭菌24孔细胞培养板，每组3个复孔，各孔液体总量为1550μL,烟曲霉菌液量与野生型铜绿假单胞菌及铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌液量之比均为30：1。每孔已事先各放置一枚直径为13mm的灭菌圆形玻璃细胞爬片。已于16h前将制备好的烟曲霉孢子悬液及1640液各自放置于含有烟曲霉菌及空白组的孔中，并于37℃恒温箱中孵育。16h后将野生型铜绿假单胞菌液及铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌液分别加入相应组中。于37℃恒温孵育24h；

(4)4结晶紫染色法对不同生物被膜形成后的定量分析按照上述方法两种混合生物被膜建膜24h后，用灭菌棉签轻轻拭去各孔表面的浮游菌，然后弃去培养基，用无菌纯水轻轻漂洗各孔3次以去除浮游菌，并尽量用一次性2mL注射器抽净各孔内剩余无菌纯水。于各孔加入2％戊二醛溶液1mL室温固定2小时。吸净戊二醛后室温干燥。各孔加入0.5％结晶紫1mL染色15分钟。15分钟后用一次性2mL注射器抽净各孔内剩余结晶紫溶液。室温干燥。室温干燥后每孔加入1mL95％乙醇溶液脱色10min。各孔吸取100μL洗脱液加入96孔板。酶标仪590nm波长测定各孔吸光度值(OD 590)。每组每次分别设置3个复孔取其平均值，实验独立重复3次。

实施例2结果分析：

如图1所示，该组数据1—6组依次对应：1烟曲霉菌-野生型铜绿假单胞菌组；2烟曲霉菌-铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组；3烟曲霉菌组；4野生型铜绿假单胞菌组；5铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组；6RPMI-1640培养基作为空白对照组。由此组数据可以看出组1比组2的平均OD值明显减少且差异有统计学意义(采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差(X-±S)表示，多组间比较用单因素方差分析及SNK检验，P﹤0.05差异有统计学意义)。说明了，密度感应系统对铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜有显著的抑制作用。

如图2所示，其中，(1)为烟曲霉菌-野生型铜绿假单胞菌组，(2)为烟曲霉菌-铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组，(3)为烟曲霉菌组，(4)为野生型铜绿假单胞菌组，(5)为铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组，(6)为RPMI-1640空白对照组；(7)为放大后的烟曲霉菌-野生型铜绿假单胞菌组，(8)为放大后的烟曲霉菌-铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组，(9)为放大后的烟曲霉菌组，(10)为放大后的野生型铜绿假单胞菌组，(11)为放大后的铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组，(12)为放大后的RPMI-1640空白对照组。

从图中可以看出，烟曲霉菌-野生型铜绿假单胞菌组所产生的混合生物被膜量(致密程度)明显比烟曲霉菌-铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌组所产生的混合生物被膜量(致密程度)减少。同样可以说明密度感应系统对铜绿假单胞菌—烟曲霉菌混合生物被膜的形成具有抑制作用。