哺乳动物细胞表达启动子及其制造和使用方法与流程

本发明涉及一种哺乳动物细胞表达启动子，特别是涉及一种哺乳动物细胞表达启动子及其制造和使用方法。

背景技术：

哺乳动物启动子序列在质粒和病毒载体中具有重要应用，广泛用在生命科学、医学等领域的基因表达方面。在蛋白表达、质粒构建、病毒构建、目的基因表达和传递、基因治疗等领域具有重要应用。目前普遍使用的基因表达载体包括质粒载体和病毒载体所使用的启动子序列多为病毒性启动子，如CMV，这些载体在哺乳动物细胞中的表达量比较高，但是属于瞬时表达，表达时间较短。针对这些问题，科学家开发了一些哺乳动物源性的启动子，例如人血清白蛋白Human Serum Albumin启动子序列，这些真核动物源性的启动子序列明显延长了外源载体在细胞和动物体内的表达时间，但是他们也有两个缺点，第一、表达量明显比病毒性启动子载体低，第二、这一类的启动子序列直接从哺乳动物细胞中复制下来，一般比较长，应用在一些病毒载体中会受到局限性，例如AAV载体最多只能容纳4.7KB的外源DNA片段，过长的启动子序列限制了目的基因的长度和，降低了AAV载体的应用广度。针对病毒和哺乳动物启动子的局限性，我们利用生物信息学手段，通过大量的计算模拟、细胞和动物筛选，获得了一个表达量高、表达时间长的启动子序列。该序列可以作为质粒载体的启动子，应用于外源基因在哺乳动物细胞、动物成体、和人体的表达。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种哺乳动物细胞表达启动子及其制造和使用方法，其获得一个能够在哺乳动物细胞中长效、高量表达外源基因的且包含较少碱基数目的启动子序列，其长度为226bp。本启动子可以为基于质粒载体的基因治疗提供一个优质的启动子，大大提高现有质粒的表达效率。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种哺乳动物细胞表达启动子，其特征在于，其采用够在哺乳动物细胞中长效、高量表达外源基因的且包含较少碱基数目的核酸序列。

本发明还提供一种哺乳动物细胞表达启动子的制造和使用方法，其特征在于，所述长效哺乳动物细胞表达启动子核酸序列的制造和使用方法包括以下步骤：

步骤一，通过化学合成的方式合成引物一：5’-ACGGGGTACCTCACTCTTGGCACGGGGAAT-3’；引物二：5’-GGAAGATCTCATTGACGTCAATCAAAATGTCGTAACAACTCC-3’ ；

步骤二，通过PCR反应，获得哺乳动物细胞表达启动子序列；

步骤三，通过限制性酶切位点：BglII 和Kpn1，上述哺乳动物细胞表达启动子序列插入包含有ori、卡纳抗性基因、sv40、sv40 polyA、多酶切位点序列的质粒骨架中，得到质粒；

步骤四，转染入E.Coli大肠杆菌进行质粒扩增，提取质粒，进行测序；

步骤五，将新获得的质粒插入SEAP和IL10目的基因，通过CsCL密度梯度离心法提取纯净质粒；

步骤六，将10ug质粒融入生理盐水中，通过液动基因传递方式导入昆明小鼠的肝脏中；

步骤七，在第12小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天、42天、56天、90天，通过小鼠尾静脉取血，提取血浆；

步骤八，通过碱性磷酸酶试剂盒，检测血液中的SEAP含量。

优选地，所述哺乳动物细胞表达启动子序列适合于所有哺乳动物细胞表达的质粒和病毒载体。

优选地，所述哺乳动物细胞表达启动子为人源序列。

优选地，所述哺乳动物细胞表达启动子为短转录因子结合位点。

本发明的积极进步效果在于：一，本启动子 (pHep/L1)适合于哺乳动物细胞表达的质粒和病毒载体，对于体外细胞转染、动物体内外源基因表达、人体内的基因治疗都有重要应用；二，该启动子 (pHep/L1)为人源序列，适合于针对人类疾病的基因治疗；三，该启动子 (pHep/L1)为短转录因子结合位点，包含较少的碱基数量，有利于作为病毒载体的启动子序列；四，该启动子具有较高的组织特异性，适合于肝脏的靶点基因表达；五，该启动子能有效延长外源基因的表达时间和表达量。

附图说明

图1表示新启动子序列和CMV启动子引导的小鼠IL10 基因在小鼠体内的表达曲线图。

图2表示新启动子序列和CMV启动子引导的SEAP基因在小鼠体内的表达曲线图。

图3为启动子序列插入包含有ori、卡纳抗性基因、sv40、sv40 polyA、多酶切位点序列的质粒骨架的示意图。

图4为本发明涉及到的核酸序列图。

具体实施方式

下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。

本发明哺乳动物细胞表达启动子，其特征在于，其采用够在哺乳动物细胞中长效、高量表达外源基因的且包含较少碱基数目的核酸序列，涉及到的启动子序列如下：cattgacgtcaat caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaagagtga（如图4所示）。

本发明哺乳动物细胞表达启动子的制造和使用方法包括以下步骤：

步骤一，通过化学合成的方式合成引物一：5’-ACGGGGTACCTCACTCTTGGCACGGGGAAT-3’；引物二：5’-GGAAGATCTCATTGACGTCAATCAAAATGTCGTAACAACTCC-3’ ；

步骤二，通过PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）反应，获得启动子序列；

步骤三，通过限制性酶切位点：BglII 和Kpn1，上述启动子序列插入包含有ori、卡纳抗性基因、sv40、sv40 polyA、多酶切位点序列的质粒骨架（图3）中，得到 pHep/L1质粒；

步骤四，转染入E.Coli大肠杆菌进行质粒扩增，提取质粒，进行测序。

步骤五，将新获得的质粒插入SEAP和IL10目的基因，通过CsCL密度梯度离心法提取纯净质粒；

步骤六，将10ug质粒融入生理盐水中，通过液动基因传递方式导入昆明（KM）小鼠的肝脏中；

步骤七，在第12小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天、42天、56天、90天，通过小鼠尾静脉取血，提取血浆；

步骤八，通过碱性磷酸酶试剂盒，检测血液中的SEAP含量。

本发明搜索能够在人和动物肝脏中表达的转录因子，并筛选这些转录因子的特异性结合位点，建立转录因子结合位点库。将这些转录因子结合位点序列通过化学合成的方式合成，插入包含有ori、卡纳抗性基因、sv40、sv40 polyA、多酶切位点序列的载体骨架中，构建成新的表达载体。然后将SEAP、IL10等目的基因插入该载体的多酶切位点，通过液动基因传递的方式导入昆明（KM）小鼠体内，在不同时间点取血，然后利用商业化试剂盒检测SEAP、IL10等外源基因在血液中的浓度，测定其表达量和表达时间。

图1表示新启动子序列和CMV启动子引导的小鼠IL10 基因在小鼠体内的表达曲线。新启动子的表达时间比CMV启动子延长了2个月，长时间表达量提高了1000倍。

图2表示新启动子序列和CMV启动子引导的SEAP基因在小鼠体内的表达曲线。新启动子的表达时间比CMV启动子延长了2个月，长时间表达量提高了1000倍。

以上所述的具体实施例，对本发明的解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。