棉花根际溶磷菌株的筛选及溶磷效率的鉴定方法与流程

本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及棉花根际溶磷菌株的筛选及溶磷效率的鉴定方法。
背景技术：
：磷是植物生长发育所必需的大量元素之一，几乎参与了植物所有的生命活动过程。植物所需磷素90％以上来自土壤，虽然土壤中总磷含量丰富，但是能被植物直接利用的有效磷含量通常在1μmol/L左右，远不能满足植物获取充足磷营养的需求。为了保证作物的产量，往往需要大量施用磷肥，但磷肥一般总利用率不超过25％。大量施用磷肥不仅增加了农业生产的成本，而且造成水体的富营养化，破环生态环境。同时，生产磷肥的不可再生磷矿资源，按目前生产和使用水平，将在2050年枯竭。土壤中有效磷不足和磷肥资源紧缺影响作物产量提高和品质改良已成为全球亟待解决的土壤养分问题之一。我国磷细菌的研究始于20世纪50年代。目前，有关植物根际溶磷菌的研究较多，已涉及到红树林、红三叶、枸杞、苜蓿、红豆草、小麦、水稻、大豆、玉米等多种植物。研究结果证明，土壤中磷细菌能将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，并促进植物的生长，但实际应用并不广泛。主要原因是解磷微生物种类繁多，不同植物根际解磷微生物种类不一，不同种类微生物解磷能力相差很大，且解磷的机制各不相同，加上耕作土壤类型复杂，很难找到可以满足所有土壤类型的菌株，因此有必要因地制宜，筛选分离特定土壤特定作物根际解磷微生物，为实际应用提供理论依据和技术支持。我国是棉花的主要生产国之一，土壤有效磷缺乏、磷肥资源紧缺、耕地资源有限等都制约我国棉花产量进一步的提高，而有关棉花根际溶磷细菌的筛选及其溶磷效率的鉴定研究还很薄弱，因此本发明拟对我国棉花根际土壤溶磷细菌进行分离、纯化、鉴定，以期筛选出优良的溶磷菌株，为我国棉花产量的提高和微生物菌肥的研制提供理论依据。技术实现要素：本发明的目的在于提供棉花根际溶磷菌株的筛选及溶磷效率的鉴定方法，通过初筛、复筛、提取菌株DNA、PCR扩增、序列对比以及定性和定量的方法，筛选出棉花根际具有高效溶磷效率的菌株，对于促进棉花对土壤中难溶无机磷的吸收利用效果明显，在菌肥的研究方面具有广阔的市场前景和利用价值。棉花根际溶磷菌株的筛选及溶磷效率的鉴定方法，包括如下步骤：1、棉花根际土壤的采集采集常用的棉花品种新陆早42号、45号、50号根际的土壤；2、棉花根际土壤理化性质的测定理化性质的测定包括：含水量、PH值、有机质、全氮、全磷、速效磷、全钾的测定；3、棉花根际溶磷菌株的分离纯化通过有关微生物分离、纯化、培养及功能鉴定的多种实验技术，对棉花根际的溶磷菌株进行分离纯化；4、溶磷菌种的鉴定通过对菌株的形态观察、革兰氏染色、抗酸性染色和采用CTAB法提取溶磷细菌的总DNA，利用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，将扩增产物回收纯化后，送生工公司测序，将菌株的测序序列在GenBank和EMBL核酸序列数据库进行序列比对；5、溶磷能力的鉴定溶磷能力的鉴定包括定性和定量两部分，每天测量并记录溶磷圈与菌落直径的比值(D/d)，大约测量10天；制备纯化各个菌株的发酵液。绘制磷标准曲线后，采用铝锑比色法测定发酵液中水溶性磷含量。有益效果：本发明对溶磷微生物在棉花方面的研究为棉花产量的提高和微生物菌肥的研制提供理论依据。附图说明图1是棉花根际溶磷菌株的分离纯化图；图2是菌液PCR电泳结果图；图3是菌液PCR产物Hha1酶切结果图；图4是有效磷标准曲线图。具体实施方式下面通过具体方式对本发明作进一步说明。实施例一种棉花根际高效溶磷菌株筛选的方法,包括如下步骤：1、棉花根际土样采集通过对角线法采集种植新陆早42号、新陆早45号和新陆早50号三个棉花品种的地下5-15cm的根际土壤，装入灭过菌的牛皮纸袋，黑暗4℃冷藏备用。2、棉花根际土壤理化性质测定(1)土壤水分含量测定：取小量土壤样品置于灭过菌的小铝盒中，于烘箱105℃烘烤4h。其中铝盒、烘干前后铝盒中的土壤样品分别称重，计算土壤水分含量。(2)土壤样品制备：将土壤样品置于报纸上，摊开，剔除植物残体，经常翻动土样以加速干燥，并用手捏碎土块土团，使其直径在1cm以下。风干的土样经碾碎后磨碎，过20目的筛子后装袋并标记备用。(3)土壤pH值测定：将10g土样样品置于添加有50ml去离子水的100ml三角瓶中，180rpm摇床摇30min后静置过滤，取滤液，用pH酸度计测其pH值。(4)土壤有机质测定：用重铬酸钾容量法测定土壤样品中的有机质含量。(5)土壤全氮量测定：使用凯氏定氮法测定土壤样品中的含氮量。(6)土壤全磷量测定：使用氢氧化钠消煮-钼锑抗比色法测定土壤样品中的全磷量。(7)土壤速效磷测定：依据土样pH值，采用碳酸氢钠法测定土壤样品中的速效磷含量。(8)土壤全钾测定：使用NaOH熔融—火焰光度计法测定土壤样品中的全钾量。表一棉花根际土壤理化性棉花品种PH值有机质含量全氮全磷有效磷全钾新陆早42号7.6660.873.440.24933.8515.40新陆早45号7.6750.633.220.36924.523.86新陆早50号7.6644.943.410.33529.005.453、棉花根际溶磷菌株的分离与纯化在无菌条件下称取土壤样品10g于90mL无菌水中，振荡30min后制备棉花根际土壤悬液，梯度为10-1-10-6。无菌操作下,分别取各浓度样品0.lml涂布于难溶磷平板培养基上,细菌选10-4-10-6三个梯度，每梯度重复3皿。细菌30℃，倒置培养。观察平皿的菌落生长情况，挑取具有溶磷圈的单个菌落进行转接，转接于牛肉膏蛋白胨平板上，连续转接纯化5次后，分别用牛肉膏蛋白胨斜面保存菌种和用甘油保存菌种。4、溶磷菌种鉴定(1)形态观察将纯化好的溶磷细菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃培养。观察菌株的生长情况和形态特征。将培养24h的菌株进行革兰氏染色和抗酸性染色。表二溶磷菌的形态观察和生理生化特征(2)分子水平鉴定采用CTAB法提取溶磷细菌的总DNA，利用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，将扩增产物回收纯化后，送上海生工公司测序。将菌株的测序序列在GenBank和EMBL核酸序列数据库进行序列比对。5、棉花根际溶磷细菌溶磷能力的鉴定(1)定性测定将纯化的菌株点接在难溶性无机磷的固体培养基上，倒置培养。每天测量并记录溶磷圈与菌落直径的比值(D/d)，大约测量10天。按照溶磷圈与菌落直径的比值的大小初步判断溶磷菌株溶磷能力的大小。(2)定量测量制备纯化各个菌株的发酵液。绘制磷标准曲线后，采用铝锑比色法测定发酵液中水溶性磷含量，确定溶磷菌株溶磷能力的大小，并每天测量发酵液中的pH值。综合分析定性测定和定量测定的溶磷能力测定结果，根据溶磷圈与菌落直径比(D/d)和发酵液中水溶性磷含量的大小筛选出高效的溶磷菌株。表三磷菌的溶磷能力当前第1页1 2 3