本发明涉及苯丙氨酸二肽苯乙酰胺衍生物及其制备方法，以及含有它们的药物组合物并涉及所述苯丙氨酸二肽苯乙酰胺衍生物的应用。
背景技术：
β2-肾上腺素能受体(β2AR)已经成为研究G蛋白偶联受体(GPCR)调控机制的模型系统，并在了解心血管疾病和哮喘病理方面具有重要作用。β2AR由七个跨膜α螺旋形成三个细胞外环(包括一个氨基末端)和三个细胞内环(包括一个羧基末端)。β2AR在第三个内环和近端细胞质尾部有磷酸化位点。这些位点的磷酸化会触发由激动剂引起的受体脱敏、内化和降解。β阻滞剂是正构竞争性拮抗剂，能够阻断交感神经系统受体与内源性儿茶酚胺肾上腺素(肾上腺素)以及β肾上腺素能受体与去甲肾上腺素(去甲肾上腺素)结合。β阻滞剂在临床上用于治疗心律失常、高血压、以及其它多种疾病。但是，所有已知β-肾上腺素配体都是正构作用，因此，变构调节分子由于信号偏差，有可能具有增强的活性、选择性，或其它新的治疗特性。这样的配体也有利于特定受体构象的分离和表征，用于生物物理研究。最近，我们发现了第一个这样的小分子负向别构调节剂CPD-15。CPD-15结合在β2AR胞面的G蛋白结合位点附近，抑制β2AR所引起的cAMP刺激，但不抑制由其它G-偶联受体引起的刺激。CPD-15同样抑制对β2AR的β-arrestin蛋白招募，因此，在抑制G蛋白或抑制β-arrestin蛋白信号传导方面，CPD-15没有显示偏好。
技术实现要素：
本发明的目的在于制备苯丙氨酸二肽苯乙酰胺衍生物，以开发高活性和高选择性的β2肾上腺素受体(β2AR)的别构拮抗剂，创制心血管病和哮喘新药。
一种苯丙氨酸二肽苯乙酰胺衍生物，结构如式(I)所示：
其中，R1是溴原子，氟原子，氯原子，或氢原子；R2是溴原子，氟原子，氯原子，或氢原子；R3是环己基，环戊基，环丁基，异丙基，3-戊基；R4是氢原子，甲基，溴原子，氟原子，或氯原子。
作为优选，结构式(I)右侧苯丙氨酸部分中，R1是溴原子，氟原子，氯原子，或氢原子；R2是溴原子，氟原子，氯原子，或氢原子；苯丙氨酸中手性碳原子是S构型。
结构式(I)中间(4-甲酰胺)苯丙氨酸部分中，苯丙氨酸中手性碳原子是S构型。
结构式(I)左侧苯乙酰基部分中，R3是环己基，环戊基，环丁基，异丙基，3-戊基；R4是氢原子，甲基，溴原子，氟原子，或氯原子。
该类苯丙氨酸二肽苯乙酰胺衍生物是β2肾上腺素受体(β2AR)的别构调控剂，既能够抑制β2AR所引起的cAMP刺激，也同样抑制对β2AR的β-arrestin蛋白招募。
本发明提供了用于制备苯丙氨酸二肽苯乙酰胺衍生物的合成路线如下：
本发明上述苯丙氨酸二肽苯乙酰胺衍生物制备过程中，所用偶联试剂是O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)；所用溶剂为常用溶剂，如二甲基甲酰胺，四氢呋喃，二氯甲烷，1,4-二氧六环等。
本发明的优点是：(1)提供了一种制备苯丙氨酸二肽苯乙酰胺衍生物的方法；(2)这些苯丙氨酸二肽苯乙酰胺的新衍生物能够作为β2肾上腺素受体(β2AR)的别构调控剂。
具体实施方法
合成线路中结构式6的合成通法
第一步：在一个100mL圆底烧瓶中，称取二苯甲酮(3g，16.46mmol)和甘氨酸叔丁酯(1.8g，13.72mmol)，接着，加入三氟化硼乙醚络合物(0.12mL)和甲苯(18mL)。反应混合物在130゜C下加热搅拌8h。反应完毕，将反应混合物用旋转蒸发仪蒸除溶剂，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取，有机相用H2O(2×50mL)，饱和食盐水(50mL)洗涤，然后干燥，用旋转蒸发仪蒸干。粗产物经过快速柱层析分离纯化，得到二苯亚胺甘氨酸叔丁酯(600mg)。
第二步：氮气保护下,向50mL单口烧瓶中加入二苯亚胺甘氨酸叔丁酯(458mg,1.55mmol),取代苄基溴(7.76mmol),O-烯丙基-N-9-蒽甲基溴化辛可宁(Cat-A)(93.9mg,0.15mmol,10mmol％)的PhMe/CHCl3(15mL:7.5mL)混合溶液,降温至-40℃,搅拌10min后,向混合溶液中滴加50％aq.KOH(0.44mL,7.8mmol)溶液,反应72h后,升至室温,加水(100mL),用乙酸乙酯萃取(3×80mL)后,用饱和食盐水(2×50mL)洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压蒸馏得黄色液体,粗产物经柱层析纯化,得到(S)-3-(取代苯基)亚甲基-2-二苯亚胺甘氨酸叔丁酯。
第三步：在50mL三口烧瓶中,加入(S)-3-(取代苯基)亚甲基-2-二苯亚胺甘氨酸叔丁酯(1mmol)与6M盐酸(10mL)，于100℃加热反应3h。冷却至室温后,置于冰浴,有白色固体析出,抽滤得(S)-取代苯丙氨酸盐酸盐。
第四步：在25mL三口烧瓶中,加入(S)-取代苯丙氨酸盐酸盐(0.5mmol),1,4-二氧六环(10mL)和10％aq.Na2CO3(1mL),冰浴条件下,向混合液中缓慢滴加氯甲酸-9-芴基甲酯(Fmoc-Cl)(0.5mmol)的1,4-二氧六环(1mL)溶液。在0℃下搅拌4h后，再在室温下搅拌18h。用2N HCl酸化至pH＝1,有白色固体析出,加水(40mL),用乙酸乙酯(2×100mL)萃取,饱和食盐水(2×60mL)洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压蒸馏得白色固体,粗产物经柱层析纯化,得到目标混合物(S)-9-芴基甲酯-取代苯丙氨酸。
实施例1.Fmoc-(S)-(3,5-二溴)苯丙氨酸(6a,R1＝R2＝Br)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.85(m,1H),3.12(dd,J＝13.7Hz,3.8Hz,1H),4.21(m,4H),7.27-7.88(m,12H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ46.6,55.0,65.8,120.2,122.2,125.2,125.3,127.1,127.7,131.3,131.5,140.7,143.0,143.7,143.8,156.0,172.9；MS(ESI positive):541.9[M+H]+.
实施例2.Fmoc-(S)-(3-溴)苯丙氨酸(6b,R1＝Br,R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.85(m,1H),3.11(dd,J＝10.3Hz,2.8Hz,1H),4.21(m,4H),7.27-7.88(m,13H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ46.6,55.0,65.8,120.2,122.2,125.2,125.3,127.1,127.7,131.3,131.5,140.7,143.0,143.7,143.8,156.0,172.9；MS(ESI):m/z 466[M+H]+.
实施例3.Fmoc-(S)-(3-氟)苯丙氨酸(6c,R1＝F,R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.75-3.05(dd,J＝13.2,3.9Hz,2H),4.15(m,4H),6.95-8.02(m,13H)；MS(ESI):m/z 406[M+H]+.
合成线路中结构式7的合成通法
在100mL烧瓶中，将(S)-9-芴基甲酯-取代苯丙氨酸(0.64mmol)溶DMF(6mL)中，在N2保护下，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)(174mg,1.3mmol)，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(488mg,1.3mmol)，室温下搅拌10min。加入甲胺盐酸盐(87mg,1.3mmol)，冰浴至0℃，缓慢滴加N,N-二异丙基乙胺DIEA(250mg,2mmol)，在冰浴下搅拌半小时，移至室温，在室温下搅拌12h后，减压蒸馏得粗产物，粗产物溶于乙酸乙酯(120mL)中，分别用0.5M NaHSO4(2×30mL)，饱和NaHCO3(2×30mL)和饱和食盐水(2×30mL)分别洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂得粗产物，加入少量乙酸乙酯，有不溶于乙酸乙酯的白色固体，抽滤，得目标产物。
实施例4.(S)-9-芴基甲酯-(3,5-二溴)苯丙氨酸甲酰胺(7a,R1＝R2＝Br)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.60(d,J＝4.5Hz,3H),2.71-2.98(dd,J＝13.6,4.1Hz,2H),4.15(m,4H),7.25-8.02(m,12H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.5,25.7,37.4,55.8,56.2,110.0,120.2,121.6,127.5,128.5,128.6,129.1,129.2,130.3,130.4,132.1,132.2,137.6,139.6,141.4,141.6,142.7,157.1,172.2,173.7；MS(ESI):m/z 581[M+Na]+.
实施例5.(S)-9-芴基甲酯-(3-溴)苯丙氨酸甲酰胺(7b,R1＝Br,R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.60(d,J＝4.5Hz,3H),2.72-3.02(dd,J＝14.0,4.4Hz,2H),4.20(m,4H),7.19-8.01(m,13H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.5,25.7,37.4,55.8,56.1,110.0,120.2,121.5,127.4,128.5,128.6,129.1,129.2,130.3,130.4,132.1,132.2,137.6,139.5,141.4,141.6,142.7,157.0,172.2；MS(ESI):m/z 479[M+H]+,501[M+Na]+.
实施例6.(S)-9-芴基甲酯-(3-氟)苯丙氨酸甲酰胺(7c,R1＝F,R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.60(d,J＝4.4Hz,3H),2.76-3.02(dd,J＝13.3,4.2Hz,2H),4.15(m,4H),6.99-8.00(m,14H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.7,37.3,46.6,56.2,65.8,113.0,113.3,115.9,116.2,120.2,125.5,127.1,127.7,129.9,130.0,140.8,141.3,141.4,143.8,143.9,155.9,160.5,163.7,171.7；MS(ESI):m/z 419[M+H]+.
实施例7.(S)-9-芴基甲酯-苯丙氨酸甲酰胺(7d,R1＝R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.59(d,J＝4.5Hz,3H),2.72-3.02(dd,J＝14.0,4.4Hz,2H),4.12(m,4H),7.17-7.87(m,15H)；MS(ESI):m/z 401[M+H]+.
合成线路中结构式8的合成通法
在50mL烧瓶中，将(S)-9-芴基甲酯-取代苯丙氨酸甲酰胺(0.21mmol)溶解于DMF(4mL)中，滴加2mL哌啶，在室温下搅拌3h，减压蒸馏得粗产物，粗产物经过柱层析纯化，得浅黄色固体为目标产物。
实施例8.(S)-2-胺基-3-(3,5-二溴苯基)-N-甲基乙酰胺(8a,R1＝R2＝Br)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.57(d,J＝4.7Hz,3H),2.60(dd,J＝13.5,8.4Hz,1H),2.90(dd,J＝13.1,4.9Hz,1H),3.35(dd,J＝8.3,5.0Hz,1H),7.17-7.82(m,4H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.5,40.8,56.3,121.5,128.5,129.0,130.2,132.1,142.1,174.7；MS(ESI):m/z 334[M+H]+.
实施例9.(S)-2-胺基-3-(3-溴苯基)-N-甲基乙酰胺(8b,R1＝Br,R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.56(d,J＝4.7Hz,3H),2.61(dd,J＝13.4,8.3Hz,1H),2.89(dd,J＝13.3,5.0Hz,1H),3.35(dd,J＝8.2,5.0Hz,1H),7.17-7.82(m,5H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.5,40.8,56.3,121.5,128.5,129.0,130.2,132.1,142.1,174.7；MS(ESI):m/z 257[M+H]+,289[M+Na]+.
实施例10.(S)-2-胺基-3-(3-氟苯基)-N-甲基乙酰胺(8c,R1＝F,R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.56(d,J＝4.7Hz,3H),2.64(dd,J＝13.3,8.1Hz,1H),2.93(dd,J＝13.4,4.5Hz,1H),6.98-7.87(m,5H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.4,25.7,56.2,113.46,116.20,125.30,125.81,129.65,130.37,141.78,141.88,160.59,163.76,174.34.MS(ESI):197[M+H]+.
实施例11.(S)-2-胺基-3-苯基-N-甲基乙酰胺(8d,R1＝R2＝H)
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.59(m,1H),2.75(d,J＝5.0Hz,3H),3.22(dd,J＝13.7,4.0Hz,1H),3.54(dd,J＝9.5,4.0Hz,1H),7.13-7.28(m,6H)；MS(ESI):m/z 179[M+H]+.
合成线路中结构式9的合成通法
在50mL烧瓶中，将芴基-L-4-甲酰氨基苯丙氨酸(226mg,0.52mmol)溶于DMF(4mL)中，在N2保护下，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)(71mg,0.52mmol)，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(199mg,0.52mmol)，室温下搅拌10min。加入(S)-2-胺基-3-取代苯基-N-甲基乙酰胺(0.44mmol)的DMF(2mL)溶液，冰浴至0℃，缓慢滴加N,N-二异丙基乙胺DIEA(169mg,1.3mmol)，缓慢升至室温，反应12h后，减压蒸馏得粗产物，加入少量乙酸乙酯，有不溶于乙酸乙酯的白色固体，抽滤，得目标产物。
实施例12.(9H-芴基甲酯-9-基)((S)-1-(((S)-3-(3,5-二溴苯基)-1-(甲酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)胺基)-3-(4-苯酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)氨基甲酸酯(9a,R1＝R2＝Br)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.57(d,J＝3.9Hz,3H),2.67-3.02(m,4H),4.10-4.48(m,5H),7.32-8.36(m,17H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.7,46.6,48.7,53.3,56.3,65.8,110.0,120.2,121.4,121.6,122.1,122.2,124.1,127.2,127.4,127.6,127.7,127.9,129.1,129.2,129.7,131.5,131.6,135.6,143.0,143.8,143.9,155.8,167.9,170.9；MS(ESI)：m/z 771[M+Na]+.
实施例13.(9H-芴基甲酯-9-基)((S)-1-(((S)-3-(3-溴苯基)-1-(甲酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)胺基)-3-(4-苯酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)氨基甲酸酯(9b,R1＝Br,R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.57(d,J＝4.4Hz,3H),2.72-3.05(m,4H),4.11-4.50(m,5H),7.18-8.23(m,18H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.6,46.6,53.9,54.2,56.0,65.8,120.2,121.5,125.4,126.4,127.2,127.4,127.7,128.2,128.4,129.2,129.3,130.3,132.0,132.4,137.7,140.6,140.8,141.6,141.7,143.8,143.9,155.8,167.9,170.9,171.2,171.3；MS(ESI):m/z 691[M+Na]+.
实施例14.(9H-芴基甲酯-9-基)((S)-1-(((S)-3-(3-氟苯基)-1-(甲酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)胺基)-3-(4-苯酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)氨基甲酸酯(9c,R1＝F,R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.56(d,J＝4.5Hz,3H),2.72-3.03(m,4H),4.11-4.20(m,5H),6.97-8.26(m,18H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.6,46.6,53.9,56.0,65.8,113.1,113.4,115.9,116.2,120.2,125.3,125.4,127.1,127.4,127.7,129.1,129.9,130.0,132.4,140.6,140.7,140.8,141.6,143.8,143.9,155.8,160.5,163.7,167.9,171.0,171.3；MS(ESI)631[M+Na]+.
实施例15.(9H-芴基甲酯-9-基)((S)-1-(((S)-3-(3-苯基)-1-(甲酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)胺基)-3-(4-苯酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)氨基甲酸酯(9d,R1＝R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.55(d,J＝4.5Hz,3H),2.72-2.99(m,4H),4.11-4.50(m,5H),7.14-7.86(m,21H)；MS(ESI):m/z 591[M+H]+.
合成线路中结构式10的合成通法
在50mL烧瓶中，将(9H-芴基甲酯-9-基)((S)-1-(((S)-3-(取代苯基)-1-(甲酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)胺基)-3-(4-苯酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)氨基甲酸酯(0.4mmol)溶解于DMF(4mL)中，滴加2mL哌啶，在室温下搅拌3h，减压蒸馏得粗产物，加入少量乙酸乙酯，有不溶于乙酸乙酯的浅黄色固体，抽滤，得浅黄色固体为目标产物。
实施例16.((S)-2-胺基-3-(((S)-3-(3,5-二溴苯基)-1-(甲酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)胺基)-3-羰酰氨基)苯甲酰胺(10a,R1＝R2＝Br)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.57(d,J＝4.3Hz,3H),2.77-3.30(m,5H),4.46(m,1H),7.18-8.30(m,10H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.7,37.3,40.7,53.2,56.4,122.1,127.5,129.2,131.4,131.6,132.3,132.1,132.3,142.3,143.1,168.0,170.9,174.1；MS(ESI):549[M+Na]+.
实施例17.((S)-2-胺基-3-(((S)-3-(3-溴苯基)-1-(甲酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)胺基)-3-羰酰氨基)苯甲酰胺(10b,R1＝Br,R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.57(d,J＝4.5Hz,3H),2.86-3.35(m,5H),4.47(m,1H),7.14-8.14(m,10H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.7,37.7,40.6,53.3,56.2,121.5,127.5,128.5,129.2,129.3,130.3,132.1,132.3,140.7,142.3,170.9,171.0,174.0；MS(ESI):m/z 447[M+H]+；469[M+Na]+.
实施例18.((S)-2-胺基-3-(((S)-3-(3-氟苯基)-1-(甲酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)胺基)-3-羰酰氨基)苯甲酰胺(10c,R1＝F,R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.56(d,J＝3.5Hz,3H),2.72-2.95(m,4H),3.38(m,1H),4.48(m,1H),6.98-8.16(m,10H),；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.6,37.8,40.6,53.3,56.2,113.1,113.4,115.9,116.2,125.5,127.4,129.2,130.0,130.1,132.2,140.7,140.8,142.3,160.5,163.7,167.9,171.1,174.0；MS(ESI):409[M+Na]+.
实施例19.((S)-2-胺基-3-(((S)-3-苯基-1-(甲酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)胺基)-3-羰酰氨基)苯甲酰胺(10d,R1＝R2＝H)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ2.57(d,J＝4.5Hz,3H),2.86-3.35(m,5H),4.47(m,1H),7.14-8.14(m,11H)；MS(ESI):m/z 369[M+H]+.
合成线路中结构式11的合成通法
在50mL烧瓶中，将取代苯乙酸(0.56mmol)溶于DMF(2mL)中，在N2保护下，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)(75mg,0.56mmol)，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(211mg,0.56mmol)，室温下搅拌10min。加入((S)-2-胺基-3-(((S)-3-(取代苯基)-1-(甲酰胺)-1-羰酰氨基-2-基)胺基)-3-羰酰氨基)苯甲酰胺(0.28mmol)的DMF(2mL)溶液，冰浴至0℃，缓慢滴加N,N-二异丙基乙胺DIEA(108mg,0.84mmol)，缓慢升至室温，反应12h后，减压蒸馏得粗产物，加入少量乙酸乙酯，有不溶于乙酸乙酯的白色固体，抽滤，得白色固体为目标产物。
实施例20.4-((2S)-3-(((S)-3-(3,5-二溴苯)-1-甲氨基-1-丙氧-2-基)氨基)-2-(2-环己基-2-苯乙酰胺)-3-丙氧)苯甲酰胺(11a,R1＝R2＝Br,R3＝环己基,R4＝H)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.92-1.89(m,11H),2.55(d,J＝4.7Hz,3H),2.78-3.19(m,5H),4.37(m,2H),6.94-8.51(m,12H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ25.7,30.3,31.3,37.2,37.4,53.8,53.9,53.8,53.9,58.0,122.2,126.5,127.2,127.4,128.1,128.3,128.5,128.9,129.3,131.5,132.0,132.1,139.5,139.6,141.0,141.5,142.7,142.9,167.8,167.9,170.7,170.9,171.2,172.2,172.5；MS(ESI):m/z 749[M+Na]+.
实施例21.4-((2S)-3-(((S)-3-(3-溴苯)-1-甲氨基-1-丙氧-2-基)氨基)-2-(2R-环己基-2-苯乙酰胺)-3-丙氧)苯甲酰胺(11b,R1＝Br,R2＝R4＝H,R3＝环己基)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.86-1.54(m,11H),2.55(d,J＝4.5Hz,3H),2.78-3.17(m,5H),4.43(m,2H),6.95-8.15(m,13H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ25.6,26.2,30.3,31.3,37.6,53.4,53.5,53.8,53.9,57.9,121.5,126.4,127.2,128.1,128.3,128.4,128.5,129.0,129.4,130.3,132.0,132.2,139.4,140.8,167.8,170.7,170.8,172.5；MS(ESI):m/z 647[M+H]+.
实施例22.4-((2S)-3-(((S)-3-(3-溴苯)-1-甲氨基-1-丙氧-2-基)氨基)-2-(2S-环己基-2-苯乙酰胺)-3-丙氧)苯甲酰胺(11c,R1＝Br,R2＝R4＝H,R3＝环己基)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.84-1.51(m,11H),2.58(d,J＝4.5Hz,3H),2.80-3.19(m,5H),4.40(m,2H),6.95-8.22(m,13H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ25.6,27.4,30.5,31.4,37.6,53.4,53.5,53.8,54.1,57.8,121.5,126.9,127.2,127.9,128.3,128.4,128.5,128.9,129.4,130.3,132.0,132.2,139.4,140.8,167.8,170.7,171.2,172.5；MS(ESI):m/z 647[M+H]+.
实施例23.4-((2S)-3-(((S)-3-(3-溴苯)-1-甲氨基-1-丙氧-2-基)氨基)-2-(2-异丙基-2-苯乙酰胺)-3-丙氧)苯甲酰胺(11d,R1＝Br,R2＝R4＝H,R3＝异丙基)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.87(d,6H),2.00(m,1H),2.80(s,3H),3.25-3.65(m,5H),4.95(t,2H),7.05(d,2H),7.20-7.50(m,9H),7.90(d,2H)；MS(ESI):m/z 608[M+H]+.
实施例24.4-((2S)-3-(((S)-3-(3-溴苯)-1-甲氨基-1-丙氧-2-基)氨基)-2-(2-环丁基-2-苯乙酰胺)-3-丙氧)苯甲酰胺(11e,R1＝Br,R2＝R4＝H,R3＝环丁基)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.50-1.75(m,6H),2.82(s,3H),3.20-3.68(m,5H),4.90(t,2H),7.02(d,2H),7.22-7.53(m,9H),7.76(d,2H)；MS(ESI):m/z 620[M+H]+.
实施例25.4-((2S)-3-(((S)-3-(3-氟苯)-1-(甲氨基)-1-丙氧-2-基)氨基)-2-(2-环己基-2-苯乙酰胺)-3-丙氧)苯甲酰胺(11f,R1＝F,R2＝R4＝H,R3＝环己基)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ1.09-1.98(m,11H),2.54(d,J＝4.3Hz,3H),2.67-3.20(m,5H),4.42(m,2H),6.95-8.20(m,14H)；MS(ESI):m/z 587[M+H]+.
实施例26.4-((2S)-3-(((S)-3-苯基-1-甲氨基-1-丙氧-2-基)氨基)-2-(2-环己基-2-苯乙酰胺)-3-丙氧)苯甲酰胺(11g,R1＝R2＝R4＝H,R3＝环己基)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ0.86-1.54(m,11H),2.53(d,J＝4.6Hz,3H),2.68-3.24(m,5H),4.43(m,2H),6.95-8.42(m,15H)；MS(ESI,positive):m/z 571[M+1]+.
实施例27.4-((2S)-3-(((S)-3-(3-溴苯)-1-(甲氨基)-1-丙氧-2-基)氨基)-2-(2-环己基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺)-3-丙氧)苯甲酰胺(11h,R1＝Br,R2＝H,R3＝环己基,R4＝MeO)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.85-1.6(m,11H),2.55(d,J＝4.5Hz,3H),2.67-3.11(m,5H),4.39(s,3H),4.40-4.43(m,2H),6.99-8.15(m,15H)；MS(ESI,positive):m/z 701[M+Na]+.
实施例28.4-((2S)-3-(((S)-3-(3-溴苯)-1-(甲氨基)-1-丙氧-2-基)氨基)-2-(2-环己基-2-(4-羟基苯基)乙酰胺)-3-丙氧)苯甲酰胺(11i,R1＝Br,R2＝H,R3＝环己基,R4＝OH)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.83-1.58(m,11H),2.55(d,J＝4.4Hz,3H),2.68-3.07(m,5H),4.40(m,2H),6.99-9.46(m,14H)；MS(ESI,positive):m/z 685[M+Na]+.
实施例29.4-((2S)-3-(((S)-3-(3-氯苯)-1-(甲氨基)-1-丙氧-2-基)氨基)-2-(2-环己基-2-苯乙酰胺)-3-丙氧)苯甲酰胺(11j,R1＝Cl,R2＝R4＝H,R3＝环己基)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ1.11-1.96(m,11H),2.54(d,J＝4.3Hz,3H),2.65-3.25(m,5H),4.42(m,2H),6.88-8.18(m,14H)；MS(ESI):m/z 603[M+H]+.
实施例30.3-((2S)-3-(((S)-3-(3-溴苯)-1-(甲氨基)-1-丙氧-2-基)氨基)-2-(2-环己基-2-苯乙酰胺)-3-丙氧)苯甲酰胺(11k)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ0.45-1.99(m,11H),2.56(d,J＝4.4Hz,3H),2.68-3.19(m,5H),4.43(m,2H),6.95-8.15(m,17H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ25.5,25.8,37.6,53.4,53.7,54.0,58.0,121.4,124.5,126.9,127.4,127.6,127.8,128.1,128.3,128.5,128.8,129.1,129.6,132.1,139.4,140.4,140.6,140.9,167.7,167.8,170.7,170.8,171.0,172.3,172.5；MS(ESI):m/z649[M+H]+.
测量cAMP生成
cAMP的水平主要是利用Glosensor-一种基于化学发光的cAMP生物传感器(Promega)-来监测。将能稳定表达Glosensor的HEK-293细胞放入96孔板中，每孔80,000个细胞。第二天，加入Glosensor试剂(Promega)，并于27℃下孵育约1h。接着，细胞用0.5％二甲基亚碸(DMSO)或不同浓度CPD-15衍生物的HANK溶液(Sigma)处理。该溶液中加入了20mM HEPES,pH 7.4和0.05％牛血清白蛋白(BSA)，还有100uM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX,Sigma)，继续孵育20min。然后，细胞用G蛋白偶联受体激动剂，包括异丙肾上腺素(isoproterenol)，在室温激活5min，用NOVOstar酶标仪读取荧光的变化。
测量β-arrestin蛋白招募
β-arrestin蛋白招募的程度主要是利用”PathHunger”-一种基于化学发光的酶片段互补法(DiscoveRx)-来监测。能稳定表达β-arrestin 2和ProLink标记受体的U2OS细胞放入96孔板中，每孔25,000个细胞。第二天，细胞用0.5％二甲基亚碸(DMSO)或CPD-15衍生物溶液进行预处理。然后，细胞用激动剂在37℃下激活30-45min，加入PathHunter检测试剂终止。27℃下孵育1h后，用NOVOstar酶标仪读取荧光数值。
表1部分新合成衍生物对β2AR的别构调控作用的比较
a数值表示为相对于CPD-15的阻断活性