一种快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片及其制备方法、检测方法与流程

本发明属于快速检测领域，涉及微生物检测技术，具体涉及一种快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片，以及该测试片制备方法、检测方法。

背景技术：

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在自然界分布广泛，在各种食品中的检出率也较高，造成这个现象的原因，往往是由于食品在食用前保存温度不当，放置时间过长，使污染在食品中的蜡样芽孢杆菌或残存的芽孢得以生长繁殖，由于蜡样芽孢杆菌会产生的热稳定毒素，从而会导致食物中毒事件发生。蜡样芽孢杆菌中毒的发病率较高，一般能达到60％～100％。国家质量监督检验检疫总局2014年已通过《食品微生物含量指引》，指出每克即食食品含超过十万个蜡样芽孢杆菌，就不宜供人食用，可能危害食用者的健康。

目前食品中蜡样芽孢杆菌的检测，主要采用国标《GB 4789.14-2014食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》的方法进行检测，该方法为平板法，是经典的微生物检测和鉴定方法，检测结果具有准确可靠的特点，但是该方法耗时长，需要现配置培养基，操作步骤繁琐，难以满足快速检测的实际需求。

纸片法的出现，弥补了平板法的缺点，逐步成为微生物检测和鉴定的主要方法和标准,2007年，Petrifilm^TM测试片被正式列为中国出入境检验检疫行业标准，该方法正逐渐被越来越多的食品生产加工企业及各类检测机构所认可。目前市场上现有测试片的培养基载体为无纺布，其存在目标菌落在无纺布上扩散生长使菌落边缘模糊的缺点，对结果判读有影响。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片及其制备方法、检测方法。

技术方案：

一种快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片，包括下层底板4，珍珠纸2，上层薄膜组件1和蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基，所述珍珠纸2中间具有圆形凹槽3，所述圆形凹槽3内均匀分布有蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基。

进一步蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基每100mL含有胰蛋白胨0.8～2.0g、牛肉浸出粉0.05～0.5g、氯化钠0.1～1.0g、磷酸二氢钾0.2～0.4g、磷酸氢二钾0.2～0.4g、冷水可溶性胶0.5～2.0g、抑菌剂混合物100～500IU/mL、显色酶解底物混合剂0.015～0.04g。

进一步显色酶解底物混合剂由5-溴-6-氯-3-吲哚辛酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基-D-葡糖苷酸环己胺盐、4-甲基伞型酮-beta-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基-beta-D-葡糖苷酸环己胺盐按重量比1:1:1:2混合组成。

进一步抑菌剂混合物为多粘菌素B、卡那霉素，头孢克洛按重量比为2:2:1的混合物。

进一步珍珠纸圆形凹槽3直径为50～65mm。

进一步测试片上层薄膜组件1上方粘贴有测试片标签5。

本发明的另一个目的还提供了一种快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片的制备方法，包括如下步骤：

a.配制蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基：每100mL按照以下方式配制，称量胰蛋白胨0.8～2.0g、牛肉浸出粉0.05～0.5g、氯化钠0.1～1.0g、磷酸二氢钾0.2～0.4g、磷酸氢二钾0.2～0.4g、冷水可溶性胶0.5～2.0g，于烧杯中加蒸馏水100mL加热搅拌溶解，在121℃高压灭菌锅条件下灭菌15min，冷却至室温后，依次加入经过滤灭菌的抑菌剂混合物10000～50000IU及显色酶解底物混合剂0.015～0.04g，得到蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基，在0～4℃下冷藏备用；

b.各组件的前处理

上层薄膜组件1：在上层薄膜组件1的反面均匀敷上冷水可溶性凝胶，在正面贴上测试片标签5，送辐照处理，辐照剂量为2KGy，使用前紫外灭菌30min；

下层底板4和珍珠纸2：下层底板4与珍珠纸2采用不干胶粘贴贴合在一起后，送辐照处理，辐照剂量为2KGy，使用前紫外灭菌30min；

c.蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基添加：将步骤b中经紫外灭菌后的下层底板4和珍珠纸2结合部件水平放置在水平台面上，珍珠纸2中间圆形凹槽3开口向上，吸取1～3mL蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基添加于圆形凹槽3内，使培养基均匀分布，无菌条件下35～85℃烘干4h后，置于0～4℃的无菌冷藏箱内，备用；

d.组装测试片：将经上述步骤c后得到的测试片组件上贴上经步骤a处理后的上层薄膜组件1，具有测试片标签5的一面向上，即得到快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片。

本发明还提供了一种用快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片检测样品中蜡样芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：

a.样品前处理；

b.用上述快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片进行接菌培养；

c.分析检测结果。

本发明快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片，利用微生物生化反应的特性，将微生物胞内酶的种类及反应条件作为微生物分类鉴定的主要依据，通过在分离培养基或选择性培养基中，加入微生物特异性酶显色底物，当目的菌在培养基上生长时，其特异性酶就能降解显色底物，并产生带有特殊颜色的代谢物，使菌落形成特定的颜色或形态，从而进行样品中微生物的培养和检测。本发明采用测试片形式，该测试片培养时间为18～24h,菌落显色清楚，易于判读和分析，可实现蜡样芽孢杆菌的检测，且准确度达国标90％以上，能够满足实际检测需求。

有益效果：

1.通过培养基优化，获得一种颜色均一，杂质少，培养效果好的培养基；通过将待测样品直接接种于测试片上，实现对待测样品中蜡样芽孢杆菌的快速培养和检测。

2.本发明所述的快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片，与现有蜡样芽孢杆菌测试片相比，菌落易于分辨，分布均匀，显色清楚，避免了因扩散严重而导致计数结果不准确，避免了人为操作不当引起的误差。

3.本发明测试片，具有使用简便，可以长期存放，应用灵活的特点，省去了培养基配置、培养皿灭菌、清洗等处理的步骤，大大缩短了检测时间，降低了劳动强度。同时，本发明测试片制备方法简单、易行，能够实现自动化生产，成本低廉，使用方便。

附图说明

图1为本发明测试片示意图；

1，上层薄膜组件；2，珍珠纸；3，圆形凹槽；4，下层底板；5，测试片标签。

图2为本发明测试片检测阳性蜡样芽孢杆菌样品的圆形凹槽内的显色图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明试剂如无特别说明，均为常规试剂。

实施例1快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片的组成

一种快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片，包括下层底板4，珍珠纸2，上层薄膜组件1，测试片标签5及蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基。下层底板4，珍珠纸2及上层薄膜组件1为长方形，珍珠纸2中间有圆形凹槽3，圆形凹槽3内均匀分布有蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基。每100mL蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基中含有胰蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、冷水可溶性胶、抑菌剂混合物、显色酶解底物混合剂。酶解底物混合剂由5-溴-6-氯-3-吲哚辛酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基-D-葡糖苷酸环己胺盐、4-甲基伞型酮-beta-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基-beta-D-葡糖苷酸环己胺盐按重量比1:1:1:2混合组成。抑菌剂混合物由多粘菌素B、卡那霉素、头孢克洛按重量比2:2:1组成。冷水可溶性凝胶为黄原胶和卡拉胶的混合物，重量比为1:1。

蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基的成分，100mL，见表1

表1蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基的成分，100mL

珍珠纸2，尺寸长宽厚为90×70×0.1mm，中间具有圆形凹槽3，中间圆形凹槽3的直径为50～65mm。

上层薄膜组件1为透明bopp薄膜，材质为bopp，尺寸长宽厚为90×70×0.1mm。

测试片标签5为不干胶贴纸，材质为bopp，尺寸长宽厚为70×15×0.1mm。

下层底板4为PVC底板，材质为pvc，尺寸长宽厚为90×70×0.7mm，下层底板4上与圆形凹槽3对应的部位为中空。

最下面为下层底板4，珍珠纸2紧贴下层底板4，中间具有圆形凹槽3，上层薄膜组件1贴在珍珠纸2上，测试片标签5贴在上层薄膜组件1上，相互之间用不干胶粘合，如图1所示，每份快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片检测一个样品。

实施例2快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片的制备

2.1蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基的制备

其中100mL蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基配制的方法：称量胰蛋白胨1.2g、牛肉浸出粉0.15g、氯化钠0.3g、磷酸二氢钾0.25g、磷酸氢二钾0.25g、冷水可溶性胶0.9g，于烧杯加蒸馏水100mL搅拌溶解，在121℃高压灭菌锅条件下灭菌15min，冷却至室温后，依次加入经过滤灭菌的抑菌剂混合物20000IU及显色酶解底物混合剂0.020g，得到蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基，在0～4℃下冷藏备用。

2.2测试片各组件前处理：

2.2.1上层薄膜组件1：在上层薄膜组件1的反面均匀敷上冷水可溶性凝胶，在正面贴上测试片标签5，送辐照处理，辐照剂量为2KGy，使用前紫外灭菌30min；

2.2.2下层底板4和珍珠纸2：下层底板4与珍珠纸2采用不干胶粘贴贴合在一起后，送

辐照处理，辐照剂量为2KGy，使用前紫外灭菌30min；

2.2.3蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基添加：将步骤2.2.2中经紫外灭菌后的下层底板4和珍珠纸2结合部件水平放置在水平台面上，珍珠纸2中间圆形凹槽3开口向上，吸取1～3mL蜡样芽孢杆菌特征显色液体培养基添加于圆形凹槽3内，使培养基均匀分布，无菌条件下35～85℃烘干4h后，置于0～4℃的无菌冷藏箱内，备用；

2.3组装测试片：将经上述步骤2.2.3后得到的测试片组件上贴上经步骤2.2.1处理后的上层薄膜组件1，具有测试片标签5的一面向上，分装于自封袋，置于铝箔袋中，抽真空包装，即得到快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片，制备好的快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片置于2～8℃环境下，保存期限1年。

实施例3待检样品中蜡样芽孢杆菌的检测

使用本发明快速检测蜡样芽孢杆菌测试片检测样品中蜡样芽孢杆菌时，主要有以下几个步骤：

首先样品处理：取样品25mL(g)放入含有225mL灭菌稀释液(灭菌磷酸盐缓冲液或生理盐水)的取样器或均质杯内，制成1:10的样品匀液，用1mL的灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL灭菌稀释液的试管内，摇匀后得到1:100的样品稀释液，按照上述操作步骤依次往下稀释，制备10倍递增系列的样品稀释匀液。一般样品选2～3个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品(如饮用纯水和矿泉水等)可直接吸取原液进行检测。

其次接菌培养：将测试片置于平坦台面，打开测试片上层薄膜组件，用灭菌枪头或滴管吸取1mL样品匀液加到测试片中间凹槽位置，缓慢盖上上层薄膜组件，避免有气泡产生，使样品匀液浸润整个培养基区域，即可培养。每个稀释度接种两片，同时取1mL无菌生理盐水接种另一测试片作空白对照。将接种好的测试片放置于37±1℃培养箱中培养18～24h。

上述磷酸盐缓冲液的配制：称取34.0g的分析纯磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用175mL的1mol/LNaOH调节pH至6.0，用蒸馏水稀释至1000mL后，取1.25mL,用蒸馏水继续稀释至1000mL，分装于干净的适量容器中，121℃高压灭菌15min。

上述生理盐水的配制：取8.5g分析纯氯化钠溶解到1000mL蒸馏水或纯净水中，充分混匀溶解，分装到适量容器后，121℃高压灭菌15min。

最后分析检测结果：

1.培养后培养基区域上呈现白点蓝圈菌落的计为蜡样芽孢杆菌阳性，蜡样芽孢杆菌阴性显蓝色。

2.计数

上述经培养后的测试片(选取10～150CFU数值之间的测试片进行计数)，蜡样芽孢杆菌在测试片上呈现白点蓝圈菌落。

1)若两个稀释度的菌落数均在10～150CFU之间，则取其平均菌落数乘以稀释倍数计算。

2)若所有测试片上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；若所有测试片均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如果为原液，则以小于1计数。

3)若所有测试片上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的测试片进行计数，其他测试片可记录为多不可计，结果按其平均菌落数乘以最高稀释倍数。单位CFU/mL或CFU/g。

为了更好的体现本发明的有益效果，发明人用本发明测试片法、国家标准检测法对样品中的蜡样芽孢杆菌进行检测：

将处理好的腐乳样品，用灭菌生理盐水将其稀释至10^-2、10^-3、10^-4三个梯度。用灭菌枪头或滴管吸取1mL待测样品稀释液均匀涂布在国标法推荐的平板上和本发明的测试片上，以1mL灭菌生理盐水作为空白对照，在37±1℃条件下，培养24h后，记录观察结果如下表2：

表2样品检测结果比对表1(培养时间24h，培养温度37±1℃)

检测结果标明本发明与国标有很好的符合度。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。