KCNQ1OT1基因、aHIF基因及其引物的应用以及用于诊断冠心病的试剂盒的制作方法

本发明涉及基因诊断技术领域，尤其是涉及一种kcnq1ot1基因、ahif基因及其引物的应用以及用于诊断冠心病的试剂盒。

背景技术：

目前，心血管疾病(高血压、冠心病、充血性心力衰竭、中风等)仍然是人类健康的头号杀手。据统计，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病。虽然已有一些预防及初步治疗心血管疾病的措施，但是从根本上预防和治愈心血管疾病仍然是医学与生物学的重大难题。因此，寻找心血管疾病的标志物并对其进行准确检测已成为心血管疾病早期诊断和治疗的紧迫任务。

大量的研究表明，非编码核酸(non-codingrna)在心血管系统疾病发生发展过程中起到非常重要作用，是预防和治疗的潜在靶点。非编码核酸包括microrna和lncrna等，非编码核酸的研究对于这些重大疾病具有非常重要的意义。非编码核酸参与心脏和血管的发育，其异常表达与动脉粥样硬化、冠心病、心力衰竭、心律失常、先天性心脏病及高血压等疾病密切相关。非编码核酸在各种心血管疾病中有特定的表达谱。

与常规的蛋白类多糖类标记物诊断相比，用非编码核酸进行疾病诊断具有灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短(在发病潜伏期或早期即可做出诊断)，且可进行定量检测，既可用于诊断，又能进行病情及疗效评估等显著优点。但是，非编码核酸在心脏疾病的诊断中的应用尚有不足，仍然需要进一步的探索和研究。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供kcnq1ot1基因的应用，本发明的第二个目的在于提供kcnq1ot1基因的引物的应用，本发明的第三个目的在于提供ahif基因的应用，本发明的第四个目的在于提供ahif基因的引物的应用，本发明的第五个目的在于提供用于诊断冠心病的试剂盒，以缓解现有技术中非编码核酸在冠心病的诊断中研究不足的现状。

本发明提供了kcnq1ot1基因在制备用于诊断冠心病的试剂盒中的应用。

另外，本发明还提供了用于特异性检测kcnq1ot1基因的引物在制备用于诊断冠心病的试剂盒中的应用。

进一步的，所述用于特异性检测kcnq1ot1基因的引物为：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)；

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)。

另外，本发明还提供了一种用于诊断冠心病的试剂盒，所述试剂盒包括kcnq1ot1基因的引物，所述kcnq1ot1基因的引物为：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)；

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)。

另外，本发明还提供了ahif基因在制备用于诊断冠心病的试剂盒中的应用，所述ahif基因具有如seqidno.4所示的序列。

另外，本发明还提供了用于特异性检测ahif基因的引物在制备用于诊断冠心病的试剂盒中的应用，所述ahif基因具有如seqidno.4所示的序列。

进一步的，所述用于特异性检测ahif基因的引物为：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

另外，本发明还提供了一种用于诊断冠心病的试剂盒，所述试剂盒包括ahif基因的引物，所述ahif基因的引物为：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

另外，本发明还提供了一种用于诊断冠心病的试剂盒，所述试剂盒包括kcnq1ot1基因的引物和ahif基因的引物，

所述kcnq1ot1基因的引物为：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)；

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)；

所述ahif基因的引物为：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

进一步的，应用所述kcnq1ot1基因的引物和所述ahif基因的引物，进行的聚合酶链反应条件为：模板变性条件为95℃，3分钟，然后按每个循环95℃，5秒，55℃，35秒，共40个循环，最后一次循环之后延伸时间为50秒，取出置于4℃保存。

使用本发明提供的kcnq1ot1基因和ahif基因进行冠心病的诊断，具有灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短的特点，在发病潜伏期或早期即可做出诊断，且可进行快速有效的定量检测，既可用于诊断，又能进行病情及疗效监测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为kcnq1ot1基因qpt-pcr定量分析图；

图2为ahif基因qpt-pcr定量分析图；

图3为kcnq1ot1基因在非cad的心脏疾病患者基因qpt-pcr定量分析图；

图4为ahif基因在非cad的心脏疾病患者基因qpt-pcr定量分析图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

尽管目前已有很多针对冠心病的研究，也发现了一些与冠心病相关的lncrna，但用于诊断的lncrna需要具有一定的特异性和灵敏性，因此，对于用于诊断冠心病的lncrna的相关研究，仍有不足。

发明人为解决上述技术问题，提出了本发明的方案。

本发明涉及的kcnq1ot1基因在ncbi的version编号为nr_002728.3，kcnq1ot1基因的长度为91671bp。鉴于kcnq1ot1基因序列过长，在本申请中，截取了kcnq1ot1基因的部分片段作为代表，kcnq1ot1基因的部分片段如seqidno.1所示。

seqidno.1所示序列作为kcnq1ot1基因的代表，也具有kcnq1ot1基因在本申请中的作用。即，seqidno.1所示序列也能够用于制备用于诊断冠心病的试剂盒；用于特异性检测seqidno.1所示序列的引物，也能够用于制备用于诊断冠心病的试剂盒。

本发明涉及的kcnq1ot1基因的引物，应当理解为能够特异性检测kcnq1ot1基因的所有引物，不仅包括能够检测kcnq1ot1基因全序列的引物，还包括能够检测kcnq1ot1基因部分片段的引物。其中，seqidno.2和seqidno.3所示的引物序列是检测效果较好的kcnq1ot1基因的引物，而不应当理解为对kcnq1ot1基因的引物的限制。

本发明涉及的ahif基因的引物，应当理解为能够特异性检测ahif基因的所有引物，不仅包括能够检测ahif基因全序列的引物，还包括能够检测ahif基因部分片段的引物。其中，seqidno.5和seqidno.6所示的引物序列是检测效果较好的ahif基因的引物，而不应当理解为对ahif基因的引物的限制。

本发明涉及的试剂盒，除了包括kcnq1ot1基因的引物，或者ahif基因的引物，或者kcnq1ot1基因的引物和ahif基因的引物之外，还可以包括用于qrt-pcr反应的其他相关试剂；优选的，还可以包括用于rna提取的相关试剂。

本发明涉及的cad(coronaryatheroscleroticheartdisease,cad)为冠心病。

除非另有说明，以下实施例中涉及的操作方法为常规的方法，涉及的试剂为常规的市售试剂。

实施例1kcnq1ot1基因和ahif基因的筛选

1.初步筛选与冠心病密切相关的lncrna

广泛查阅文献及lncrna相关数据库，从中初步筛选出与冠状动脉粥样硬化心脏病密切相关的lncrna(至少筛选出30个关键性lncrna)。

2.初步鉴定lncrna与冠心病的相关性

收集临床样本及建立病例排除标准。选择病例：接受冠脉造影的cad及对照组患者，病人的相关临床资料完整。

根据筛选出的目的lncrna，实时荧光定量pcr检测基因表达量范围指标：采用实时定量pcr方法在cad病人和对照组外周血单个核细胞(pbmc)样本里验证关键性lncrna显著性表达差异及特征曲线(roc)和曲线下面积(auc)等方法来评估血浆中lncrna作为cad检测的新型诊断工具的可行性。

3.验证关键的lncrna在冠心病中的准确性及特异性诊断

收集cad及非cad心脏疾病患者外周血单个核细胞(pbmc)样本：抽取待检测病人外周血5ml置于edta-抗凝管内，利用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞。

样本cdna模板获得：将分离的人pbmc细胞以trizol方法提取rna，反转录合成cdna模板。

通过实时荧光定量pcr检测对照组与cad组pbmc中基因表达差异，以及cad与非cad心脏疾病患者pbmc中基因表达水平比较，从而验证关键的lncrna作为诊断cad的准确性及特异性。

从中筛选出了2个关键性lncrna可特异性诊断出冠心病，分别为kcnq1ot1和ahif。

实施例2kcnq1ot1基因和ahif基因的引物确定

作为诊断用的引物探针必须具有结合和表达的特异性，稳定存在性、实验简单等特点，经多次重复试验均可获得一致结果。用引物探针对正常和病理样本进行rt-pcr，对比其表达变化情况(是否可以显著判断其表达差异)及其重复性(试验过程是否稳定)，从而判断其是否可以快速准确的进行诊断。综上，本实施例选用探针的标准是：

(1)在相应的对照组样本中可以检测到显著的表达差异，便于清晰明了的分析。

(2)样本间的表达差异经多次实验重复均呈现稳定的数值，不出现大幅度变化，否则将影响诊断的精确度。

(3)探针本身的特异性好，在自身基因组中不存在错配。

(4)具有通用的退火温度(55-60度)，简化实验过程，便于批量实验。

基于以上原则，本实施例确定了kcnq1ot1基因的引物，具体序列为：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)

以及ahif基因的引物，具体序列为：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

实施例3诊断冠心病的试剂盒

本实施例提供的试剂盒包括kcnq1ot1基因的引物，具体序列为：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)

实施例4诊断冠心病的试剂盒

本实施例提供的试剂盒包括ahif基因的引物，具体序列为：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

实施例5诊断冠心病的试剂盒

本实施例提供的试剂盒包括：kcnq1ot1基因的引物，和ahif基因的引物。

其中，kcnq1ot1基因的引物为：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)

ahif基因的引物为：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

实施例6诊断冠心病的试剂盒的使用方法

本实施例提供了包括实施例2、3和4在内的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

步骤(a)，待检测病人外周血单个核细胞模板dna的提取：抽取待检测病人外周血5ml置于edta-抗凝管内，利用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞。trizol方法提取rna，反转录合成cdna模板。

步骤(b)，聚合酶链反应：

反应体系：

反应条件：模板变性条件为95℃，3分钟，然后按每个循环95℃，5秒，55℃，35秒，共40个循环，最后一次循环之后延伸时间为50秒，取出置于4℃保存。

另外，本发明还提供了应用了以上实施例的实验，以更充分的说明本发明的效果，具体介绍如下。

应用实施例5提供的试剂盒，以及实施例6提供的方法，对对照组和cad患者进行检测。检测结果如图1和图2所示。

图1为kcnq1ot1基因qpt-pcr定量分析图，其中，对照组为正常对照组外周血单个核细胞中相对kcnq1ot1基因含量；cad为cad患者外周血单个核细胞中相对kcnq1ot1基因含量。由图1可以看出，cad患者外周血中kcnq1ot1基因的含量显著低于对照组，因此，可以作为判断病人是否患有冠心病的依据。

图2为ahif基因qpt-pcr定量分析图，其中，对照组为正常对照组外周血单个核细胞中相对ahif基因含量；cad为cad患者外周血单个核细胞中相对ahif基因含量。由图2可以看出，cad患者外周血中ahif基因的含量显著高于对照组，因此，可以作为判断病人是否患有冠心病的依据。

另外，还应用实施例5提供的试剂盒，以及实施例6提供的方法，对非cad患者进行检测。检测结果如图3和图4所示。

图3为kcnq1ot1基因在非cad的心脏疾病患者基因qpt-pcr定量分析图，其中，对照组为正常对照组外周血单个核细胞中相对kcnq1ot1基因含量；cad为cad患者外周血单个核细胞中相对kcnq1ot1基因含量；瓣膜病组为瓣膜病(非cad的其他类心脏疾病)患者外周血单个核细胞中相对kcnq1ot1基因含量。由图3可以看出，cad患者外周血中kcnq1ot1基因的含量显著低于对照组，但在瓣膜病患者外周血中kcnq1ot1基因的含量与对照组比较无统计学差异，因此，kcnq1ot1基因可作为判断特异性检测冠心病的依据。

图4为ahif基因在非cad的心脏疾病患者基因qpt-pcr定量分析图，其中，对照组为正常对照组外周血单个核细胞中相对ahif基因含量；cad为cad患者外周血单个核细胞中相对kcnq1ot1基因含量；瓣膜病组为瓣膜病(非cad的其他类心脏疾病)患者外周血单个核细胞中相对ahif基因含量。由图4可以看出，cad患者外周血中ahif基因的含量显著高于对照组，但在瓣膜病患者外周血中ahif基因的含量与对照组比较无统计学差异，因此，ahif基因可作为判断特异性检测冠心病的依据。

而且，kcnq1ot1基因和ahif基因的检测结果相互结合，可进一步提高检测的准确性。

使用本发明提供的kcnq1ot1基因和ahif基因进行冠心病的诊断，具有灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短的特点，在发病潜伏期或早期即可做出诊断，且可进行快速有效的定量检测，既可用于诊断，又能进行病情及疗效监测。本发明提供的诊断试剂盒，将填补国内冠心病诊断的行业空白。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>青岛大学

<120>kcnq1ot1基因、ahif基因及其引物的应用以及用于诊断冠心病的试剂盒

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