本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一株三氮唑降解芽孢杆菌及其在废水生物处理和环境污染修复中的应用。
背景技术：
三氮唑因其杂环结构而具有较强的水溶性，很容易转移到土壤和地下水中，在土壤和地下水中普遍存在，是一种典型的难降解含氮杂环化合物。三氮唑具有生物毒性、致畸变和致癌特性，进入环境中，将严重危害人体健康。因此，需对含三氮唑的废水进行处理后排放。
目前针对三氮唑废水的处理方法主要有物理法、化学法、生物法等。其中物理手段如吸附法、萃取法等不能真正有效的将三氮唑完全去除，需要辅以其他工艺，才可达到理想的去除率；化学法中高级氧化法及电化学法耗能高，成本也高，且部分中间产物的毒性更大，容易产生二次污染。因此，研究处理效果好、处理成本小、无二次污染的含三氮唑废水的处理技术和工艺，具有重要的理论和实际意义。
微生物处理法与物理、化学方法相比，具有经济、高效的优点，更重要的是可以实现污染的无害化治理。生物法无二次污染、处理量大，是目前应用最广的废水处理技术。但由于三氮唑结构稳定，生物毒性大，可生化降解程度不高，普通的生物处理无法作用或效率低下。因此，驯化和筛选对三氮唑降解效率高、降解效果好的微生物，是解决三氮唑废水污染的有效途径。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对目前三氮唑降解菌株的缺乏，提供一株三氮唑降解芽孢杆菌bacillussp.njust43。
发明人从实验室长期降解含三氮唑废水的生化处理系统的污泥中分离筛选得到三氮唑降解菌株njust43，经鉴定为bacillussp.，命名为bacillussp.njust43，genbank登陆号为mf966511，菌株已于2017年3月9日在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctccno：m2017102。
本发明还提供上述三氮唑降解芽孢杆菌bacillussp.njust43在含三氮唑废水处理中的应用。
上述的氮唑降解芽孢杆菌bacillussp.njust43在含三氮唑废水处理中的应用，具体方法为：将氮唑降解芽孢杆菌bacillussp.njust43种子液接种到含三氮唑废水中，培养ph为6.0-8.0，培养温度为25-35℃。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的bacillussp.njust43，可以以三氮唑为唯一碳源、氮源进行生长。筛选得到的bacillussp.njust43，可在15d左右实现浓度约为150mg/l的三氮唑废水的处理，三氮唑的降解率达到90％以上。在三氮唑浓度为0-150mg/l的范围内，bacillussp.njust43可正常生长并实现三氮唑的完全降解。在ph为6.0-8.0的范围内，bacillussp.njust43可实现三氮唑的完全降解，低浓度易降解碳源的加入可对三氮唑降解起促进作用。
附图说明
图1是废水中三氮唑浓度对菌株bacillussp.njust43降解三氮唑性能的影响。
图2是废水ph对三氮唑降解性能的影响。
图3是废水中易降解碳源的存在对三氮唑降解性能的影响。
具体实施方式
下面的实施例和附图可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：三氮唑降解菌bacillussp.njust43的筛选分离及其对三氮唑的降解性能
⑴菌株的分离
实验室长期降解含三氮唑废水的生化处理系统的污泥中取污泥混合样，取50ml污泥混合样加入100ml三氮唑浓度为100mg/l的液体无机盐培养基(msm)，装入250ml三角瓶中，30℃条件下以180转/分的转速摇床培养，3h后取出三角瓶静置，待泥水分离后取2ml上清液，转接入50ml三氮唑浓度为100mg/l的液体无机盐培养基(msm)中，装入100ml三角瓶中，30℃条件下以180转/分的转速摇床培养，实现三氮唑降解菌的富集培养。15天后，2ml液体培养基转接入50ml新鲜培养基，并摇床培养。经过连续3次转接后，用无菌蒸馏水将液体培养基稀释104-108倍，涂布于三氮唑浓度为100mg/l、以三氮唑为唯一碳源和氮源的无机盐固体培养基平板上，放入30℃培养箱进行培养。一周后挑取在菌落特征上有明显差异的菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化，连续纯化三次后，得到单一菌株，并进行斜面保存。
无机盐培养基(msm)的组成如下：na2hpo4·12h2o(3.057g/l)，kh2po4(0.760g/l)，mgso4·7h2o(0.2g/l)，cacl2(0.05g/l)，微量元素溶液sl-4(10ml/l)。微量元素sl-4组成：edta(0.5g/l),feso4·7h2o(0.2g/l)，微量元素sl-6(100ml/l)。微量元素sl-6组成：znso4·7h2o(0.01g/l)，mncl2·4h2o(0.03g/l)，h3bo4(0.3g/l)，cocl2·6h2o(0.2g/l)，cucl2·2h2o(0.01g/l)，nicl2·6h2o(0.02g/l)，na2moo4·2h2o(0.03g/l)。
⑵菌株的筛选
挑取分离所得到的单菌落，分别接种于三氮唑浓度为100mg/l、以三氮唑为唯一碳源和氮源的msm中，摇床培养15d。用高效液相色谱法测定培养基中三氮唑浓度变化，如果培养基中三氮唑浓度显著降低，即可表明三氮唑发生了降解。在分离得到的单菌落中，命名为njust43的菌株降解性能最为优异，在15d的培养期内，三氮唑完全降解，因此选取该菌株作后续的鉴定。
⑶菌株的鉴定
对细菌进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16srdna序列，将菌株的16srdna基因序列与国际genbank数据库中的序列进行网上同源性比较，最终从分子水平上确定该菌的种属。
①形态特征：njust43菌落呈白色，圆形，边缘整齐，中心有褶皱。
②生理生化特征：革兰氏阳性，催化酶阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性，不能水解淀粉，最适降解ph范围为6.5-7.5，最适生长温度为25-35℃。
③分子生物学鉴定：以njust43菌的核dna为模板，以16srdna基因的pcr扩增的通用引物为引物，进行pcr扩增，测定其全序列，该菌株的16srdna基因序列见序列表。将菌株的16srdna基因序列提交至genbank数据库(genbank登陆号为mf966511)，与genbank数据库中的序列进行网上同源性比较，结果表明，njust43与bacilluscereusstrainhls1200907和bacillussp.strainfjat-25493的序列相似度高达99％以上。
根据njust43的形态学、生理生化测试以及分子生物学分析，njust43鉴定为芽孢杆菌bacillussp.，命名为bacillussp.njust43。
⑷菌株对三氮唑的降解及在三氮唑废水处理中的应用
将三氮唑降解菌株njust43接种至添加100mg/l三氮唑的msm培养基，30℃条件下以180转/分的转速摇床培养，进行njust43的富集培养，待菌体进入对数生长期后期(约7d)，将所得菌体用3,000×g的转速离心分离5分钟，撇去上清液，采用涡旋震荡的方法将菌体重新悬浮于无菌液体msm，离心。重复洗涤过程四次后，将菌体重新悬浮于无菌液体msm(调节加入的msm量，控制菌悬浮液光密度od600约为0.2)，得到种子液。
配制以100mg/l三氮唑为唯一碳源和氮源的液体msm作为模拟废水，将上述种子液加入模拟三氮唑废水中，30℃条件下以180转/分的转速摇床培养，观测降解过程中废水中三氮唑浓度，观测细菌生长情况。设立未接种njust43的空白对照。由图1可知，100mg/l三氮唑可于9d内被驯化后的三氮唑特效降解菌完全降解。而在未接种njust43的对照样中，三氮唑未得到明显降解。
本实施例说明分离得到的bacillussp.njust43可以利用三氮唑为唯一碳源和氮源进行生长繁殖，并可实现三氮唑的完全降解。
实施例2三氮唑浓度对三氮唑降解性能的影响
配制三氮唑浓度分别为50mg/l、100mg/l、150mg/l和200mg/l的液体msm作为模拟废水，将bacillussp.njust43种子液以2％的接种量接入模拟废水。由图1所示，bacillussp.njust43可实现三氮唑浓度高达150mg/l的模拟废水中三氮唑的完全降解。在三氮唑浓度为50mg/l、100mg/l和150mg/l的条件下，分别可在7d、12d和16d内实现模拟废水中三氮唑的完全去除，在三氮唑浓度达到200mg/l的条件下三氮唑不能有效的被降解。由于三氮唑的高毒性和难降解特性，在高浓度条件下，尽管可以实现三氮唑的完全降解，细菌生长延滞期明显延长。
本实施例说明虽然bacillussp.njust43可实现较高浓度三氮唑的降解，但处理效率有待改进。
实施例3ph值对三氮唑降解性能的影响
配制三氮唑浓度为100mg/l，初始ph为6.0、7.0和8.0的三氮唑模拟废水，将bacillussp.njust43种子液以2％的接种量接入模拟废水。由图2所示，在初始ph为6.0-8.0的条件下，bacillussp.njust43可实现三氮唑的高效率降解；在初始ph为7的条件下，bacillussp.njust43也可实现三氮唑较快的完全降解，；而在ph为6.0和8.0的条件下，三氮唑降解极为缓慢，在长达14天的时间里，不能降解完全。
本实施例说明bacillussp.njust43的降解三氮唑的最佳ph值条件为中性；在ph为7的条件下，三氮唑降解速率相对较高；偏酸和偏碱性的ph条件都不利于三氮唑的降解。
实施例4易降解有机碳源的存在对三氮唑降解性能的影响
配制三氮唑浓度为100mg/l、外加易降解有机碳源(葡萄糖)浓度分别为500mg/l、1000mg/l和1500mg/l的模拟废水，将bacillussp.njust43种子液以2％的接种量接入模拟废水。由图3所示，500mg/l葡萄糖的加入对于三氮唑的降解速率的提升最明显；而1000mg/l、1500mg/l葡萄糖的加入则延缓了三氮唑的降解。
本实施例说明低浓度的易降解碳源的存在有利于bacillussp.njust43的生长，从而促进了三氮唑的降解过程；高浓度的易降解碳源的存在消耗了氧气和营养元素，对三氮唑的降解产生竞争性抑制。
序列表
<110>湖北臻润环境科技股份有限公司
<120>三氮唑降解芽孢杆菌及其应用
<130>2017
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1311
<212>dna
<213>bacillussp.
<400>1
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