编码B7蛋白质的溶瘤腺病毒的制作方法

本发明涉及一种溶瘤腺病毒，其包含编码至少一种b7蛋白质(如cd80)或其活性片段的转基因；包含所述溶瘤腺病毒的组合物和所述病毒和组合物在治疗中，尤其癌症治疗中的用途。
背景技术：
：就患者和其关切者的困难和痛苦而言，并且就治疗、照看和支持患者的的高财务费用而言，癌症对社会来说仍为巨大社会负担。当前认为健康个体的免疫系统按常规会清除癌细胞。然而，在患有癌症的那些患者中，与这一清除作用有关的防御机制中的一种或多种会下调或关闭。当前已知肿瘤会改变其微环境以使所述微环境容许其生长。这通过肿瘤释放细胞外信号来进行，所述细胞外信号例如会促进肿瘤血管生成和/或诱导局部免疫抑制或免疫耐受。从许多不同临床前和临床研究清楚可知，肿瘤中的微环境可抑制抗肿瘤免疫应答的产生和活性，伴随显示多种机制在潜在地发挥作用。确切地说，免疫抑制机制根本上防止t细胞应答介导杀灭肿瘤细胞。抑制机制可包括排斥t细胞进入肿瘤组织、抑制进入肿瘤的t细胞活化和调节降低t细胞识别或对肿瘤细胞蛋白起反应的能力的肿瘤细胞蛋白。此类免疫抑制路径在支持肿瘤进展方面的重要性已通过临床功效尤其突显，所述临床功效由受体在两个此类抑制路径，ctla4和pd-1/pdl1中的抗体显示，其已获得用于治疗黑素瘤和其它癌症的市场批准。b7为在活化抗原呈递细胞(apc)上发现的外周膜蛋白的类型，当分别与t细胞上的cd28或cd152(ctla-4)表面蛋白配对时，可产生共刺激信号或共抑制信号以增强或降低抗原呈递细胞(apc)与t细胞之间的mhc-tcr信号的活动。除存在于活化apc上以外，b7还可发现于t细胞自身上。存在活化针对抗原的免疫系统的若干步骤。t细胞受体必须首先与结合到主要组织相容性复合体(mhc)表面蛋白的其特异性肽抗原(ag)的复合体相互作用。t细胞表面上的cd4或cd8蛋白与mhc相互作用以帮助稳定mhc/ag与t细胞受体复合体相互作用，所述复合体包含抗原结合链二聚体(α/β或γ/δ)和cd3信号传递复合体(包含包含γ、δ、ε和ζ链)。这也被称作“第1信号”并且其主要目的在于提供初始信号传递并且保证t细胞活化的抗原特异性。然而，mhc结合本身不足以刺激完全效应t细胞分化和活化。实际上，其他刺激信号的缺乏可致使t细胞无反应性。延续免疫应答所需的共刺激信号可来自b7-cd28和cd40-cd40l相互作用。存在在免疫应答中发挥一定作用的其它活化信号。举例来说，在分子的tnf家族中，t细胞上的蛋白质4-1bb(cd137)可结合于apc上的4-1bbl。b7(cd80/b7-1和/或cd86/b7-2)蛋白质存在于apc表面上，并且其与t细胞表面上的cd28受体相互作用。这是“第2信号”的一个来源(细胞因子也可促成t细胞活化，可被称作“第3信号”)。这一相互作用产生一系列下游信号，其促进效应细胞中标靶t细胞存活、活化和分化，所述效应细胞可介导免疫应答问题，如杀灭经病毒感染的细胞或肿瘤细胞和炎性细胞募集。通常为了引发t细胞应答，会通过抗原呈递细胞提供刺激信号和共刺激信号以诱导cd4和cd8t细胞应答。但效应cd8t细胞识别其与mhci类分子相关的ag，所述mhci类分子存在于大多数成核细胞，包括肿瘤细胞上。然而，本发明人有理由相信活化t细胞的信号不需要来自同一细胞或细胞类型。因此，向免疫系统，例如在癌细胞的表面上提供这些信号(即刺激信号和/或共刺激信号)中的一个或多个将为有用的。当前，抑制pd-1(程序性细胞死亡蛋白质1)和/或其配体pdl1(也被称作b7-h1)活性受到大量关注，因为这一路径被认为在下调免疫应答方面，例如癌症方面发挥重要作用。然而，已经完成的一些工作表明cd80(b7-1)不仅通过结合于t细胞上的cd28充当t细胞共刺激因子，其还可结合于pdl1，例如当表达于同一细胞膜中时，并且阻断pdl1-pd1抑制性信号传递相互作用。因此，通过以两种不同方式作用，cd80可为用于恢复或增强人类t细胞活化的切实可行的和潜在更有用的分子。cd80的可溶性形式也似乎能够抵抗pdl1-pd1介导之t细胞抑制，参见例如haile等人《可溶性cd80恢复t细胞活化并且克服肿瘤细胞程序性死亡配体1介导之免疫抑制(solublecd80restorestcellactivationandovercomestumorcellprogrammeddeathligand1-mediatedimmunesuppression)》《免疫学杂志2013(jimmunol2013)》；191:2829-2836。已生成cd80-fc融合蛋白并针对安全性和功效加以测试，参见《免疫学杂志》,2014,193:3835-3841。本发明人认为，例如在癌细胞的表面上通过溶瘤病毒递送和表达的b7蛋白质或其活性片段将可用于激活患者自身免疫系统以与癌症抗争。此外，b7蛋白质，如cd80，如果简单地以全身性方式给予，那么其具有以不合需要之方式全身性地刺激免疫应答的可能。本发明人认为，需要以更复杂方式递送这些蛋白质以形成合适的治疗窗，在所述治疗窗中有益治疗作用会得到实现且偏离目标的影响会降到最低。技术实现要素：因此，提供一种对癌细胞具有选择性的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含处于内生于病毒的启动子的控制下的转基因，其中所述转基因包含编码b7蛋白质或其活性片段的dna序列这为有益的，因为根据本发明的溶瘤病毒优先感染癌细胞并且由此渗透由癌症产生的微环境。处于癌细胞中之后，由病毒编码的b7蛋白质可表达于细胞表面(即癌细胞表面)上。这为有利的，因为b7蛋白质随后会处于使其可呈生物活性的所需位置处。在一个实施例中，经编码的b7蛋白质包含能够将蛋白质锚定在细胞表面上的序列，例如跨膜域序列、gpi锚定物或其类似物。因此，在一个实施例中，用表达b7蛋白质或分子，确切地说，在癌细胞表面上表达b7蛋白质或分子的本发明病毒感染癌细胞，其中所述b7蛋白质适于至少提供共刺激信号，即第2信号以活化t细胞，和/或可结合于癌细胞或局部微环境中的其它细胞的表面上所表达的pd-l1并抑制pd-l1活性。在一个实施例中，b7序列包含来自b7蛋白质的跨膜元素，例如产自于特定b7蛋白质或来自经特定表达的“不同”b7蛋白质的跨膜域的跨膜元素。b7蛋白质为经表面表达的蛋白质并且还可用于将其它蛋白质运载到癌细胞表面，例如在至少b7蛋白质的跨膜域与其它蛋白质结合的情况下。因此，在一个方面中，提供一种对癌细胞具有选择性的具有复制能力的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含处于内生于病毒的启动子的控制下的转基因，其中所述转基因包含编码b7蛋白质或其活性片段的dna序列。还提供一种根据权利要求1所述的具有复制能力的溶瘤腺病毒，其中b7蛋白质或其活性片段独立地选自包含以下的群组：b7-1、b7-2、b7-dc、b7-h1、b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h5和b7-h6，确切地说，其中b7蛋白质为b7-1(cd80)或其活性片段。在一个实施例中，具有复制能力的溶瘤病毒为b组腺病毒。在一个实施例中，具有复制能力的溶瘤病毒为嵌合病毒。在一个实施例中，具有复制能力的溶瘤病毒的主链为enadenotucirev(也被称作enad)。在一个实施例中，具有复制能力的溶瘤病毒具有式(i)：5'itr-b1-ba-b2-bx-bb-by-b3-3'itr(i)b1包含e1a、e1b或e1a-e1b；ba为e2b-l1-l2-l3-e2a-l4；b2为一个键或包含e3或转基因，例如处于内生性或外生性启动子下；bx为一个键或包含以下的dna序列：限制位点、一种或多种转基因或这两者；bb包含l5；by包含编码b7蛋白质或其活性片段的转基因；并且b3为一个键或包含e4。在一个实施例中，根据权利要求1到7中任一项所述的具有复制能力的溶瘤病毒，其中b7蛋白质或其活性片段包含跨膜序列，例如来自pdgf受体的跨膜域，或适于将蛋白质或片段锚定于细胞膜中的gpi锚定物。在一个实施例中，具有复制能力的溶瘤病毒进一步包含第二转基因，其例如编码选自包含以下的群组的多肽：细胞因子、趋化因子、拮抗性抗体分子或其片段和激动性抗体分子或其片段。在一个实施例中，第二和第三转基因，其例如编码选自包含以下的群组的两种不同多肽：细胞因子、趋化因子、抗体，如拮抗性抗体分子或其片段或激动性抗体分子或其片段。在一个实施例中，第二或第三转基因编码细胞因子，其选自包含以下的群组：il-2、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、flt3配体、gm-csf、il-15和il-12。在一个实施例中，第二或第三转基因编码趋化因子，其选自包含以下的群组：mip1α、il-8、ccl5、ccl17、ccl20、ccl22、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl13、cxcl12、ccl2、ccl19和ccl21。在一个实施例中，细胞因子和趋化因子组合由病毒编码，所述组合选自包含以下的群组：mip1α和flt3配体,和mip1α和ifnα。在一个实施例中，病毒编码例如包含跨膜序列或gpi锚定物的抗体分子或其片段，使得其为细胞膜锚定的形式或跨膜域，例如来自pdgf受体。在一个实施例中，抗体分子或其结合片段包含抗人类cd3抗原结合域。在一个实施例中，抗体分子为抑制剂，其例如选自包含以下的群组：血管生成因子的抑制剂，如抗vegf抗体分子；和t细胞失活因子的抑制剂，如抗ctla-4抗体分子。在一个实施例中，抗体分子为激动剂，例如选自包含cd40、gitr、ox40、cd27和4-1bb的群组中的一种或多种。在一个实施例中，由病毒编码的外生性蛋白质呈适于在癌细胞表面上表达的形式。附图说明图1显示与抗原呈递细胞或肿瘤细胞的t细胞识别有关的关键分子中的一些，和响应t细胞中所引发的信号传递事件中的一些。还展示pdl1的结构和与pd1的igv域的相互作用图2显示b7家族配体中的一些和来自cd28家族受体的结合搭配物图3显示以下病毒的转基因盒的示意图：所述病毒表达人类cd80(图3a)、共表达人类ifnα和人类cd80(图3b)、共表达okt3scfv和人类cd80(图3c)、共表达人类flt3l、人类mip1α和人类ifnα(figure3d)、共表达人类flt3l、人类mip1α和人类cd80(图3e)、共表达人类ifnα、人类mip1α和人类cd80(图3f)，和开放阅读框(orf)或okt3scfv的示意图(图3g)图4显示ht-29(图4a)和a549(图4b)肿瘤细胞中enad(coloadl)和人类cd80编码病毒ng-330的复制图5通过荧光免疫染色显示在经ng-330感染之后，cd80在不同时间在a549(图5a)或ht-29(图5b)肿瘤细胞的膜中的表达。经enad或未感染的肿瘤细胞(uic)观察到cd80在细胞膜上无表达图6显示ht-29细胞毒性分析中enad和ng-330的比较溶瘤效能。因此，ng-330保持其溶瘤特性，同时还运载转基因图7显示enad和cd80+ifnα表达ng-343病毒的比较溶瘤效力(图7a)和长达72小时的的时间段内利用经ng-343感染的ht-29和a549肿瘤细胞的ifnα分泌图8通过facs分析使用抗cd8免疫染色与细胞存活率染色显示感染后48或72小时时cd80表达和肿瘤细胞杀灭。cd80可在存活和死亡的经ng-343处理的细胞而非enad或未感染的对照(uic)a549肿瘤细胞的细胞表面得到检测(图8a-d)结合a549和ht-29肿瘤细胞发现相似cd80表达(图8e)。图9显示肿瘤(ht-29)和非肿瘤(mrc5、wi38和支气管上皮细胞)细胞中结合enad和ng-343的比较病毒复制，其中后者显示较低水平的复制(图9a)、ifnα分泌(图9b)和ng-343感染后仅在ht-29肿瘤细胞中检测到的cd80表达(图9c)。图10显示当与enad感染或未感染肿瘤细胞培养物相比较时，经ng-343感染的a549肿瘤细胞可诱导pbmc共培养物中的dc的表面上的cd80和pd-l1的表面含量升高。图11通过经ng-347病毒感染的ht-29(图11a&c)和a549(图11b&c)肿瘤细胞显示ifnα和cd80的表达图12通过经ng-345病毒感染的a549肿瘤细胞显示mip1α(图12a)、ifnα(图12b)和flt3l(图12c)的表达图13显示ht-29细胞毒性分析中enad、ng-347和ng-348病毒的比较溶瘤效力(图13a&b)和感染性(图13c)图14通过48小时显示经ng-347或ng-348病毒感染的a549肿瘤细胞的细胞表面上的高cd80表达，但在enad感染之后几乎无或无cd80表达图15通过48小时显示经ng-347或ng-348病毒感染的dld-1肿瘤细胞的细胞表面上的高cd80表达，但在enad感染之后几乎无或无cd80表达图16显示经ng-348感染和与人类cd3+t细胞共培养，但并非经enad感染时的epcam+a549细胞上的cd80表达图17显示cd25在与经ng-348感染的a549细胞共培养之后，但并非经enad感染时的人类cd3+t细胞上上调(图17a)，其中cd25+细胞的百分比(图17b)和每个细胞cd25表达水平(图17c)都有所增加图18显示cd25在与经ng-348感染的a549细胞共培养之后，但并非经enad感染时的cd4+和cd4-(主要为cd8)人类cd3+t细胞亚群上上调。图19显示hla-dr在与经ng-348或enad感染的a549细胞共培养之后的人类cd3+t细胞上的低表达水平图20显示与经ng-348感染的a549细胞共培养之后，但并非经enad感染时的存活的cd3+t细胞的表面上cd107a表达的诱导。图21显示与经ng-348感染的a549细胞共培养之后，但并非经enad感染时的cd4+和cd4-cd3+t细胞亚群的表面上的cd107a表达的诱导。图22显示利用与经ng-348感染的a549细胞共培养之后的cd3+t细胞进行il-2(图22a)和ifnγ(图22b)制造的诱导，但当经enad感染时，无il-2并且仅有低ifnγ水平。图23显示利用与经ng-348感染的a549细胞共培养之后的cd4+和cd8+(图22b)cd3+t细胞进行ifnγ制造的诱导，但当经enad感染时，无ifnγ(cd4+细胞)或ifnγ低(cd8+细胞)。图24显示与cd69在与经ng-347感染的a549细胞共培养之后，但并非经enad感染时的较多人类cd3+t细胞上上调图25显示利用与经ng-347感染的a549细胞共培养之后，但并非经enad感染时的人类cd3+t细胞进行ifnγ制造的诱导图26显示ng-348a、ng-420和ng-420a转基因盒的示意图图27显示与a549肿瘤细胞相比，mrc-5成纤维细胞中针对enad、ng-347和ng-348的基因组复制和六邻体基因表达(mrna水平)图28显示与a549肿瘤细胞相比，mrc-5成纤维细胞中针对病毒ng-348的cd80和抗cd3-scfv转基因mrna和cd80转基因蛋白(流式细胞术)表达图29显示与a549肿瘤细胞相比，mrc-5成纤维细胞中的针对病毒ng-347的cd80转基因mrna和cd80转基因蛋白。图30显示与a549肿瘤细胞相比，mrc-5成纤维细胞中的由病毒ng-347产生的mip1α和ifnα的mrna和分泌性蛋白水平。图31显示纯人类t细胞培养物中针对enad、ng-347和ng-348的基因组复制和六邻体基因表达(mrna水平)。图32显示与a549肿瘤细胞相比，人类t细胞中针对病毒ng-348的cd80和抗cd3scfv转基因mrna和蛋白质表达(流式细胞术)图33显示与a549肿瘤细胞相比，纯人类t细胞中针对病毒ng-347的cd80转基因mrna和cd80转基因蛋白图34显示与a549肿瘤细胞相比，t细胞中由病毒ng-347产生的ifnα和mip1α转基因mrna图35显示与a549肿瘤细胞相比，利用人类pbmc的ng-347和ng-348基因组复制和六邻体基因表达图36显示与a549肿瘤细胞相比，利用pbmc的由病毒ng-348产生的cd80和抗cd3scfvmrna图37显示与a549肿瘤细胞相比，利用pbmc的由病毒ng-347产生的cd80、ifnα和mip1αmrna图38显示如通过在细胞表面上下调cd14表达和上调cd80所测量，利用enad、ng-347和ng-348病毒颗粒的人类树突状细胞的相似活化图39显示与enad相比，来自经ng-348(a)或ng-347(b)培养的pbmc的相似颗粒介导之mip1α和ifnα蛋白分泌。图40显示与具有a549肿瘤细胞的共培养物相比，具有mrc-5成纤维细胞的共培养物或t细胞或pbmc中的ng-347或ng-348基因组复制图41显示与a549肿瘤细胞相比，由与mrc-5成纤维细胞共培养的pbmc或t细胞分泌并经enad或病毒ng-348处理的infγ。图42显示由用enad、ng-347或ng-348病毒颗粒处理的人类树突状细胞分泌的mip1α和ifnα图43显示与经enad、ng-347或ng-348感染的a549肿瘤细胞共培养的jurkatdual报告t细胞中的nfkb和ifn报导基因活化图44显示由与经enad、ng-347、ng-348或ng-420处理的a549hct-116、dld和ht29肿瘤细胞共培养的jurkatdual报告t细胞产生的nf-kb-荧光素酶报告基因活性图45显示随所添加的病毒颗粒而变化的由与经病毒ng-348和病毒ng-420感染的a549或ht29肿瘤细胞共培养的jurkatdual细胞产生的nf-kb-荧光素酶报告基因活性图46显示enad和病毒ng-348在血液中的药代动力学；暴露于enad或病毒ng-348之后的血液细胞因子水平；向cd1小鼠静脉内给药之后6或24小时，enad或ng-348病毒的组织生物分布图47显示向携带皮下hct-116肿瘤异种移植物的cb17-scid小鼠静脉内给药之后，enad、ng-347和ng-348病毒在血液中的药代动力学。图48显示在荷瘤cb17-sc1d小鼠中静脉内给药后6小时，enad、ng-347和ng-348病毒的组织分布，和静脉内或肿瘤内投配enad、ng-347和ng-348之后第7天和第14-21天时，hct-116肿瘤异种移植物中的病毒基因组图49显示静脉内或肿瘤内投配enad、ng-347或ng-348病毒之后第7天或第14-21天时产生于hct-116肿瘤异种移植物中的病毒六邻体mrna图50显示静脉内投配病毒ng-348之后7天或21天，hct-116肿瘤异种移植物中的六邻体和cd80转基因的mrna水平图51显示静脉内投配病毒ng-348之后7天或14-21天，hct-116肿瘤异种移植物中的转基因编码抗cd3scfv和cd80的mrna水平图52显示静脉内投配病毒ng-347之后7天或14-21天，hct-116肿瘤异种移植物中的mip1α和ifnα转基因的mrna水平图53显示静脉内投配病毒ng-348之后7天和21天，hct-116肿瘤异种移植物中的cd80蛋白质表达；并且显示静脉内投配病毒ng-347之后hct-116肿瘤中的mip1α和cd80蛋白质表达具体实施方式序列表内容seqidno:1展示对应于和包括enad基因组的bp29345-29379的bydna序列。seqidno:2pdgftm域seqidno:3剪接受体序列(spliceacceptorsequence)seqidno:4剪接受体序列seqidno:5聚腺苷酸化序列(sv40晚期polya序列)seqidno:6内部核糖体进入序列(ires)seqidno:7高效可自剪切的p2a肽序列seqidno:8高效可自剪切的f2a肽序列seqidno:9高效可自剪切的e2a肽序列seqidno:10高效可自剪切的t2a肽序列seqidno:11人类cd80氨基酸序列seqidno:12人类干扰素氨基酸序列seqidno:13人类可溶性flt3配体氨基酸序列seqidno:14人类巨噬细胞炎性蛋白质la氨基酸序列(ld78b同工型)seqidno:15抗人类cd3单链fv的膜锚定形式seqidno:16ng-330病毒基因组序列，其包含具有插入于by区中的编码t淋巴细胞活化抗原，cd80的转基因盒的enad基因组。所述转基因盒含有5'ssa、人类cd80cdna序列和3'poly(a)seqidno:17ng-343病毒基因组序列，其包含具有插入于by区中的编码ifna和cd80的转基因盒的enad基因组。所述转基因盒含有5'ssa、ifnαcdna序列、p2a肽、cd80cdna序列和3'poly(a)seqidno:18ng-345病毒基因组序列，其包含具有插入于by区中的编码flt3配体、mip1a和ifnα的转基因盒的enad基因组。所述转基因盒含有5'ssa、flt3配体cdna、p2a肽序列、mip1acdna序列seqidno:19ng-346病毒基因组序列，其包含具有插入于by区中的编码flt3配体、mip1a和cd80的转基因盒的enad基因组。所述转基因盒含有5'ssa、flt3配体cdna序列、p2a肽序列、mip1acdnaseqidno:20ng-347病毒基因组序列，其包含具有插入于by区中的编码ifnα、mip1α和cd80的转基因盒的enad基因组。所述转基因盒含有5'ssa、ifnαcdna序列、p2a肽序列、mip1αcdna序列、t2aseqidno:21enad基因组seqidno:22enad基因组的e2b区(bp10355-5068)seqidno:23来自enad的e3区seqidno:24包括于bx中的非编码序列seqidno:25包括于by中的非编码序列seqidno:26-34铰链连接序列seqidno:35-74柔性连接序列seqidno:75&76刚性连接序列seqidno:77-90连接序列seqidno:91pdgfr受体aseqidno:92pdgfr受体bseqidno:93胰岛素样生长因子1seqidno:94il6-rseqidno:95cd28seqidno:96ng-348病毒基因组序列，其包含具有插入于by区中的编码单链fv抗人类cd3e的膜锚定的嵌合形式和t淋巴细胞活化抗原，cd80的转基因盒的enad基因组。seqidno:97编码膜系留okt3-scfv的核酸seqidno:98针对ng-348的转基因盒序列seqidno:99具有c端v5标签的抗人类cd3scfv的膜锚定形式seqidno:100v5标签(9个氨基酸变异体)seqidno:101ng-348a病毒基因组序列，其包含具有插入于区中的转基因盒的enad基因组，所述转基因盒编码具有c端v5标签的单链fv抗人类cd3e的膜锚定的嵌合形式和t淋巴细胞活化抗原，cd80seqidno:102ng-420病毒基因组序列，其包含具有插入于by区中的转基因盒的enad基因组，所述转基因盒编码单链fv抗人类cd3e的膜锚定的嵌合形式。所述转基因盒含有5'ssaseqidno:103ng-420a病毒基因组序列，其包含具有插入于by区中的转基因盒的enad基因组，所述转基因盒编码具有c端v5标签的单链fv抗人类cd3e的膜锚定的嵌合形式。所述转基因盒含有seqidno:104连接子seqidno:105包含起始密码子的序列seqidno:106c-myc标签seqidno:107在n端和c端处具有氨基酸间隔子的c-myc标签seqidno:108间隔子-c-myc标签-间隔子pdgftm域seqidno:109具有针对插入于如质粒penad2.4中的转基因盒的并入的克隆位点的完全合成enad基因组b7为蛋白质家族。编码于本发明的溶瘤病毒中的b7蛋白质可为有用的，因为所述蛋白质家族成员的胞外域通常会调节生物功能，例如b7-1胞外域可用于诱导或刺激t细胞。实际生物功能对各给定b7蛋白质的胞外结构域具有特异性(亦即b7家族的不同蛋白质成员具有不同功能)。b7蛋白质，如b7-1和/或b7-2的其它功能可包括结合cd28和/或ctla-4的能力，并且确切地说，信号传递或活化相关信号级联的能力。另外或作为替代方案，b7蛋白质的跨膜域可用于将由本发明的病毒编码的蛋白质引导到癌细胞表面，例如通过将跨膜域融合到相关蛋白质的c端。除非上下文以其他方式指明，否则如本文中所采用的b7蛋白质是指来自b7家族的蛋白质的全长序列或与其有至少95％相似度或一致(如沿整个相关序列与其有96％、97％、98％、99％或100％相似度或相同)的序列。b7家族包括b7-1、b7-2、b7-dc、b7-h1、b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h5、b7-h6、b7-h7。当采用全长蛋白质时，那么将通常存在蛋白质的至少一种正常生物功能。如关于b7家族采用的全长蛋白质至少是指胞外域，包括嵌合b7蛋白质，其中嵌合体的序列具有b7蛋白质的结构和功能，并且其中构成嵌合体的序列选自b7家族中的蛋白质。片段或全长b7蛋白质中的元素可来自相同或不同b7蛋白质。因此，在一个实施例中，b7片段或蛋白质为嵌合的。如本文中所采用的嵌合b7蛋白质是指其中构成嵌合体的大体上所有序列都来自b7蛋白质，例如至少98％的嵌合体序列为融合在一起的b7蛋白质的片段。因此，如本文中所采用的嵌合片段是指包含来自两种或更多种不同b7蛋白质的序列的片段。在一个实施例中，全长b7蛋白质包含例如来自单一b7蛋白质，如b7-1和/或b7-2的胞外域。在一个实施例中，全长b7蛋白质包含例如来自相同b7蛋白质的胞外域和跨膜域或来自b7蛋白质(如b7-1和/或b7-2)的胞外域和来自完全不同的蛋白质的跨膜域或等效物，如脂膜锚定物。在一个实施例中，全长嵌合b7蛋白质可包含一种b7蛋白质(如b7-1和/或b7-2)的胞外域和来自不同b7蛋白质的跨膜。在一个实施例中，全长b7蛋白质包含例如全部来自相同b7蛋白质或来自两种或更多种不同b7蛋白质的胞外域、跨膜域和胞内域。如本文中所采用的b7蛋白质的活性片段是指具有b7蛋白质的至少一种功能，例如促进在癌细胞表面上的表达或b7蛋白质的其它生物功能的片段。在一个实施例中，片段活性为全长蛋白质的至少50％，如活性为全长蛋白质的60、65、70、75、80、85、90、95或100％。在一个实施例中，活性片段包含或其组成为b7胞外域或与其具有至少95％相似度或相同，如具有96、97、98、99或100％相似度或一致的序列。在一个实施例中，b7片段包含或其组成为来自b7蛋白质，尤其本文所述的b7蛋白质，如b7-1的跨膜域。采用后者被认为会促进在细胞表面上的表达。在一个实施例中，活性b7片段可为胞外域的一部分。活性片段，例如跨膜片段或包含较多b7域的较大片段可用于具有其它蛋白质的融合蛋白中，例如以促进其它蛋白质在癌细胞表面上的表达。如本文中所采用的较大片段并非是指自身尺寸或重量，而是指较大序列信息库(即，片段包含来自至少两个b7域的序列)，其随后可提供更多功能。在一个实施例中，较大片段包含相关b7蛋白质的一些生物活性。在一个实施例中，活性b7片段为保留全长蛋白质的基本生物活性，例如诱导或活化t细胞的能力的片段。可在相关活体外分析中，例如使用全长蛋白质作为比较物，例如采用本文实例中所述的分析来分析给定蛋白质片段的活性。在活性片段为跨膜域的情况下，活性可以例如使用本文实例中所述的分析，通过结合有跨膜域的相关蛋白质的细胞上的表面表达来评定。当全长b7蛋白质为融合蛋白的一部分时，那么b7部分可通过一个序列的末端与下一个蛋白质序列的开头之间的酰胺键连接到其它蛋白质或通过连接子来连接。连接子的实例在下文中给出。包含跨膜域的全长b7蛋白质可用于在经感染癌细胞的表面上展示b7蛋白质和与其融合或连接的蛋白质或片段的胞外域。通常，在此实施例中b7蛋白质将结合到癌细胞的表面，并且“其它”蛋白质将处于癌细胞表面的n端处或胞外侧上。由此蛋白质可以视需要排列，例如伴随n端处的b7胞外域融合或连接到下一个蛋白质或片段的c端处，其随后融合或连接到跨膜域，例如来自b7蛋白质的跨膜域的c端处。通常，当全长b7蛋白质用于融合蛋白中时，那么b7蛋白质和其它蛋白质都将具有生物功能。如本文中所采用的融合蛋白是指至少两种蛋白质或片段或至少一种蛋白质和至少一个片段的组合直接融合或例如通过连接子彼此连接。如本文中所采用的融合(fused)通常是指一个多肽(或蛋白质/片段)的末端和下一个多肽(或蛋白质/片段)的开头之间的酰胺键。除非上下文以其他方式指明，否则连接(linked)是指其中两个实体，如两个多肽序列通过连接子连接。连接子为并非天然存在于多肽或序列中的序列，其并不存在于相对于两种多肽的特定位置处。在一个实施例中，融合蛋白包含b7蛋白质或其活性片段。包含b7片段或蛋白质和其它蛋白质的融合蛋白在本文中不会被称作嵌合蛋白。通常，如本文中所采用的融合蛋白是指b7蛋白质或其片段与另一种非b7-蛋白质/片段的组合。仅含有来自不同b7蛋白质的片段的蛋白质在本文中被称作嵌合的，如上文所描述。在一个实施例中，本发明的融合蛋白不包含b7蛋白质或其活性片段，并且除了b7蛋白质或其片段以外，其由本发明病毒编码。因此，除了b7蛋白质或其活性片段以外，本发明病毒可编码实体，此类实体包括其它蛋白质。b7家族在一个实施例中，b7独立地选自b7-1、b7-2、b7-dc、b7-h1、b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h5、b7-h6、b7-h7、其活性片段和其组合。在一个实施例中，b7蛋白质为b7-1(cd80)、b7-2(cd86)或其中的任一种的活性片段和其组合，尤其b7-1或其活性片段。b7蛋白质包括b7-1(也被称作cd80，uniprot号p33681)，b7-2(也被称作cd86，uniprot号p42081)。这些蛋白质结合cd28和ctla-4。在一个实施例中，cd80具有以下序列：mghtrrqgtspskcpylnffqllvlaglshfcsgvihvtkevkevatlscghnvsveelaqtriywqkekkmvltmmsgdmniwpeyknrtifditnnlsivilalrpsdegtyecvvlkyekdafkrehlaevtlsvkadfptpsisdfeiptsnirriicstsggfpephlswlengeelnainttvsqdpetelyavsskldfnmttnhsfmclikyghlrvnqtfnwnttkqehfpdnllpswaitlisvngifviccltycfaprcrerrrnerlrresvrpvseqidno：11其它b7蛋白质包括b7-dc(也被称作pdcd1lg2和pd-l2，uniprot号q9bq51)、b7-h1(也被称作pd-l1和cd274：uniprot号q9nzq7)。这些蛋白质结合pd-1。程序性死亡配体1(pd-l1)为40kda1型跨膜蛋白，其经推测会在抑制免疫系统方面发挥重大作用。显然，pd-l1的上调可使癌症避开宿主免疫系统。196个来自患有肾细胞癌的患者的肿瘤试样的分析发现，pd-l1的高肿瘤表达与增加的肿瘤侵袭性和增加4.5倍的死亡风险相关。相较于具有较低pd-l1表达的卵巢癌患者，具有较高表达的那些患者具有显著较差的预后。pd-l1表达与上皮内的cd8+t淋巴细胞数成逆相关，其表明肿瘤细胞上的pd-l1可抑制抗肿瘤cd8+t细胞。作用可取决于肿瘤类型；对患有非小细胞肺癌的患者的研究显示，较高pd-l1蛋白质和mrna表达与增加的局部淋巴细胞性浸润和较长存活期相关。针对在临床试验中治疗若干癌症，已显示出对许多抗pdl1抗体的关注。在一个实施例中，用于本发明病毒中的b7-dc和/或b7-h1蛋白质或其片段并未刺激免疫抑制，例如经突变而消除免疫抑制功能。或者，病毒编码的呈未突变形式的b7-h1胞外域可用于治疗适宜癌症，如肺癌，其中pd-l1的上调与良好/改进预后相关。在一个实施例中，至少b7-dc和/或b7-h1的细胞质(胞内域)为缺失的或非功能性的。在不希望受理论束缚的情况下，有证据表明去除胞内域会降低癌细胞对裂解的抗性《血液(blood)》2008,四月1日；111(7)3635-3643。在一个实施例中，仅采用b7-dc和/或b7-h1的跨膜域片段。在一个实施例中，不随具有相关生物活性的全长蛋白质b7-dc和b7-h1提供以下蛋白质。其它b7蛋白质包括结合icos的b7-h2(也被称作icoslg、b7rp1、cd275：uniprot号075144)、b7-h3(也被称作cd276：uniprot号q5zpr3)、b7-h4(也被称作vtcn1：uniprot号q727d3)、b7-h5(也被称作vista、血小板受体gi24、s1sp1)、结合nkp30的b7-h6(也被称作ncr3lg1、nr3l1)、结合cd28h的b7-h7(也被称作hhla2)。在一个实施例中，片段仅包含b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h5、b7-h6和b7-h7中任何一种的跨膜域。单独的蛋白质包括单一蛋白质，即并非融合蛋白的一部分的蛋白质或其活性片段(包括嵌合蛋白)和融合蛋白。在一个实施例中，单独的蛋白质为单一蛋白质(包括其活性片段)。在一个实施例中，存在b7蛋白质的细胞质域。在一个实施例中，不存在细胞质域。不存在细胞质域可降低或消除向癌细胞进行细胞内信号传递，其与下文所论述的一个或多个实施例相关。“跨膜域”在一个实施例中，跨膜域(不为衍生自b7蛋白质的跨膜域)用于在经感染癌细胞的表面上表达由本发明病毒编码的蛋白质(包括融合蛋白)，例如，跨膜域可用于在经感染癌细胞的表面上展示活性b7蛋白质片段或另一种相关蛋白质。或者，其可用于在所述表面上展示例如包含b7蛋白质或其活性片段的融合蛋白。在一个实施例中，来自pdgf受体或其片段的跨膜域用于在癌细胞表面上表达b7和/或另一种蛋白质。在一个实施例中，本发明中所用的跨膜系留或锚定序列包含pdgfrtm域(例如ala513-arg561)，如avgqdtqevivvphslpfkvvvisailalvvltiisliilimlwqkpr(seqidno:2)。在一个实施例中，本发明中所用的系留或锚定序列包含结合到例如pdgf受体或其片段，如pdgfrtm域，尤其seqidno:2的标签。合适标签包括his标签、flag标签、c-myc标签等。更确切地说，系留或锚定物可包含例如seqidno:106eqkliseedl的c-myc标签，之后采用pdgfrtm域(例如ala513-arg561)，如seqidno:2avgqdtqevivvphslpfkvvvisailalvvltiisliilimlwqkkpr中所示。在一个实施例中，c-myc标签包含在3'和/或5'端处的间隔子或间隔子氨基酸，例如gseqkliseedln(seqidno:107，其中小写字母表示添加到标签作为间隔子的氨基酸)。在一个实施例中，所用系留或锚定序列为gseqkliseedlnavgqdtqevivvphslpfkvvvisailalvvltiisliilimlwqkkpr(seqidno:108)，其中小写字母表示氨基酸间隔子)。通常，所系留或锚定物所结合的蛋白质/多肽不包含终止密码子。由根据本发明的病毒编码的外生性蛋白质将通常包含前导序列(也被称作信号肽)。前导序列为位于例如蛋白质或多肽的n端处的长度为约5到30个氨基酸的序列。在一个实施例中，癌细胞表面上所表达的蛋白质的前导序列为人类前导序列，例如huvhss。在一个实施例中，orf盒的结构如下：ls-poly-tag-tm_d其中ls为前导序列，例如人类前导序列；poly为编码多肽或相关蛋白质的聚核苷酸，尤其本文中所公开的一种聚核苷酸；tag为标签，例如本文中所公开的一个标签，如c-myc，尤其seqidno:100或seqidno:106；tm_d为tm域，例如pdgfrtm域，例如seqidno:2。当多肽为scfv时，那么orf可如下：ls-var1-link-var2-tag-tm_d其中ls为前导序列，例如人类前导序列；var1为编码可变区，如vh区的聚核苷酸；link为连接子，例如如本文中所公开，如基于g4s单元的连接子，尤其seqidno:104ggggsggggsggggs；var2为编码可变区，如vl区的聚核苷酸；tag为标签，例如本文中所公开的一个标签，如c-myc，尤其seqidno:100或seqidno:106；tm_d为tm域，例如pdgfrtm域，例如seqidno:2。公开内容还扩展到实施例，尤其具体描述于本文中的那些实施例，其包含在多肽链的n端或c端处的标签，使得其存在于膜的内部或在膜外部上。因此，位于膜内部的c端标签为有利的，因为其不大可能干扰多肽的结合或功能。由此，在经表面表达的蛋白质的n端上表达标签可用于一些情况中，因为其可促进分离、鉴别和纯化表达蛋白质的细胞。在一个实施例中，跨膜域和分泌性信号序列的组合用于在经感染癌细胞的表面上表达由病毒编码的蛋白质(例如如本文所述)。本发明人已证明，经编码的蛋白质仅在容许通过溶瘤病毒，即癌细胞感染的细胞上表达。在一个实施例中，用于在经感染癌细胞的表面上表达蛋白质的片段(如跨膜片段)选自约20到25个疏水性氨基酸，其形成跨膜α螺旋，其例如来自包括以下的蛋白质：pdgf受体、胰岛素样生长因子受体、il-6受体、cd28、血型糖蛋白、ldl受体、流感ha蛋白质、胰岛素受体、去唾液酸糖蛋白受体、转铁蛋白受体。在一个实施例中，用于在经感染癌细胞的表面上表达蛋白质的片段(如跨膜片段)选自包含seqidno:91、92、93、94或95中所给出的tm域序列(极小部分)的群组。seqidno:名称序列91pdgfr受体aavlvllviviislivlvviw92pdgfr受体bvvisailalvvltiisliili93胰岛素样生长因子1iiigpplifvflfsvvigsiylfl94il6-rsssvplptflvaggslafgtllciaivl95cd28fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv在一个实施例中，所用跨膜域衍生自g蛋白偶联受体或来自b型肝炎的s抗原。在一个实施例中，包含b7蛋白质或片段的全长胞外域和衍生自不为b7的蛋白质的跨膜域的融合蛋白被排列成使得b7蛋白质位于远离癌细胞表面的融合蛋白的末端处，即处于面向胞外空间的癌细胞的外部上。病毒具有编码处于内生性启动子的控制下的b7蛋白质或活性片段的dna序列也为有利的，因为蛋白质是根据与组成型表达相对的病毒生命周期表达。在本发明情况下，外生性启动子，例如类似于cmv启动子的强启动子下的连续表达可产生比治疗效果所需更多的b7蛋白质并且可产生偏离目标的作用。在经感染癌细胞的表面上表达蛋白质的跨膜域的替代方案包括采用与胞外蛋白质或片段的c端氨基酸结合的糖磷脂锚定物(也被称作gpi锚定物)的方法(low等人1986,cross1987,low和saltiel1988,ferguson和william1988)。供用于本发明中的合适糖磷脂锚定物包括来自thy-1、n-cam和daf的那些锚定物。在一个实施例中，根据本发明的溶瘤病毒为腺病毒，例如b组腺病毒。在一个实施例中，根据本发明的病毒为嵌合病毒，例如enad。在一个实施例中，腺病毒具有复制能力。在一个实施例中，病毒为复制缺陷型并且随病毒载体提供。在一个实施例中，编码b7蛋白质或其活性片段的序列位于腺病毒基因l5的终止密码子和polya识别位点与基因e4的终止密码子和polya识别位点之间。在一个实施例中，编码b7蛋白质或其活性片段的序列位于enad基因组的约bp29356与约29357之间，例如如seqidno:21中所示，或其等效位置处。技术人员应理解，位置的绝对数值可基于编号如何分配而改变。然而，所插入基因的相对位置仍不变，其与所采用的绝对数值无关。在一个实施例中，根据本发明的溶瘤腺病毒具有式(i)：5'itr-b1-ba-b2-bx-bb-by-b3-3ttr(i)其中：b1为一个键或包含：e1a、e1b或e1a-e1b(尤其e1a、e1b或e1a-e1b)；ba为e2b-l1-l2-l3-e2a-l4；b2为一个键或包含e3或转基因，例如处于内生性或外生性启动子下；bx为一个键或包含以下的dna序列：限制位点、一种或多种转基因或这两者；bb包含l5；by包含编码b7蛋白质或其活性片段的转基因；并且b3为一个键或包含e4。在一个实施例中，溶瘤病毒具有式(ia)：5'itr-b1-ba-b2-bb-by-b3-3'itr(ia)其中：b1为一个键或包含：e1a、e1b或e1a-e1b(尤其e1a、e1b或e1a-e1b)；ba为e2b-l1-l2-l3-e2a-l4；b2为一个键或包含e3；bb包含l5；by包含编码b7蛋白质或其活性片段的转基因；并且b3为一个键或包含e4。在一个实施例中，式(i)和/或(ia)的构建体中的病毒基因组来自ad11或enad，尤其enad。在一个实施例中，编码b7蛋白质或其活性片段的转基因处于内生性启动子，例如主要晚期启动子的控制下。调节元件在一个实施例中，by包含转基因盒，所述盒包含编码b7蛋白质或其片段的转基因和调节元件，如调节元件的组合。在一个实施例中，调节元件为剪接受体序列。在一个实施例中，调节元件为kozak序列。在一个实施例中，例如在转基因编码多顺反子rna分子的情况下，调节元件为ires序列。在一个实施例中，调节序列为高效可自剪切的肽序列，如p2a、t2a、f2a、e2a。在一个实施例中，调节序列为polya尾。在一个实施例中，存在至少两个调节序列，例如剪接受体和kozak序列、或剪接受体和polya尾、或剪接受体和ires序列、或剪接受体和p2a序列。在一个实施例中，存在至少三个调节序列，例如剪接受体序列、kozak序列和polya尾；或剪接受体序列、ires或2a序列和polya尾；或剪接受体序列、kozak序列和ires或2a序列。在一个实施例中，存在至少四个调节序列，例如剪接受体序列、kozak序列、ires或2a序列和polya尾，尤其以剪接受体序列、kozak序列、ires或2a序列和polya尾的顺序位于l5和e4之间。在一个实施例中，转基因编码包含ires和2a调节序列的多顺反子rna分子。由病毒编码的蛋白质在一个实施例中，本发明病毒编码多种蛋白质以在经感染癌细胞的表面上表达，其中至少一种为b7蛋白质或其活性片段，举例而言，病毒编码两种、三种或四种或更多种不同蛋白质，尤其编码两种或三种蛋白质以在癌细胞表面上表达或分泌于胞外空间中。在此情形下，蛋白质包括融合蛋白。在一个实施例中，本发明病毒编码两种不同b7蛋白质、其活性片段或其组合，例如用以在癌细胞表面上表达。在一个实施例中，根据本发明的病毒编码一种或两种蛋白质以用于细胞表面表达和一种或两种不能够锚定于细胞表面上，例如意图与癌细胞作用或用于由细胞分泌/释放的蛋白质。在一个实施例中，b7蛋白质或活性片段由本发明病毒编码以在癌细胞的表面上表达，并且相同b7蛋白质或不同b7蛋白质(包括活性片段)的可溶形式(由细胞分泌/释放)也由病毒编码。在一个实施例中，至少两种不同b7蛋白质或活性片段由本发明病毒编码。在一个实施例中，表达在细胞表面上的至少一种蛋白质为b7蛋白质，并且至少一种非细胞锚定(例如经分泌的)蛋白质为非b7蛋白质。在一个实施例中，多种蛋白质可经编码而以单独蛋白质形式表达，其独立地经处理并表达于癌细胞膜中。癌细胞表面上的蛋白质的独立性可对免疫激活产生积极作用。在不希望受理论束缚的情况下，脂质堆积可影响癌细胞的膜中的脂质双层的流动性(即粘度)膜的粘度可影响蛋白质和其它生物分子在膜中的旋转和方向，由此影响这些分子的功能。因此，当由病毒编码的蛋白质以独立和单独蛋白质形式位于经感染癌细胞的膜中时，脂质双层的流动性使得分子可独立运动，其可为尤其合适的形式，例如与有益于生物功能的天然形式相似。在一个实施例中，经独立处理和表达的蛋白质位于(锚定于)癌细胞膜中的不同位置，如物理上单独的位置处。在一个实施例中，由病毒编码并且表达在经感染癌细胞的表面上的一种或多种蛋白质(例如所有蛋白质)不为融合蛋白。如上文所述，在一些实施例中，蛋白质以融合蛋白形式表达。在一个实施例中，本发明病毒提供一种或多种用于细胞表面表达的单独的独立蛋白质和一种或多种用于细胞表面表达的融合蛋白。因此，在一个实施例中，根据本发明的病毒包含编码用于例如在表面或经感染癌细胞上表达的所述多种蛋白质的dna序列。因此，在一个实施例中，根据本发明的病毒包含两种或更多种转基因，其处于病毒基因组中的相同或不同位置处。当位于病毒基因组中的相同位置处时，多种蛋白质将仍在癌细胞表面处得到独立地表达。在一个实施例中，多种蛋白质(包括融合蛋白)编码于病毒基因组中的不同位置处，例如e3、bx和/或by处并且以单独形式表达在经感染癌细胞的表面上。在一个实施例中，多种蛋白质(包括融合蛋白)编码于病毒基因组中的相同位置处并且一起表达在经感染癌细胞的表面上，例如在经编码的蛋白质是以融合蛋白形式提供，具体地说，其中融合蛋白包含b7蛋白质或其活性片段的情况下。在一个实施例中，融合蛋白中的b7蛋白质为全长蛋白质，尤其本文所述的蛋白质，如b7-1和/或b7-2，其融合或连接到另一种相关蛋白质或其活性片段。在一个实施例中，融合蛋白包含来自b7蛋白质的跨膜。在一个实施例中，b7为不包括跨膜域的活性片段。在后面的实施例中，不为衍生自b7蛋白质的跨膜可用于确保融合蛋白存在于经感染癌细胞的表面上。在一个实施例中，多种蛋白质编码于病毒中的相同位置处并且以一种或多种融合蛋白形式一起表达在经感染癌细胞的表面上。当编码蛋白质或相关蛋白质的基因在病毒中的位置相同时，那么基因可例如通过ires序列或2a肽连接。在一个实施例中，根据本发明的病毒包含“第二”转基因和任选地第三转基因(即所述多种蛋白质中的一种或多种，其例如编码选自包含以下的群组的多肽：细胞因子、趋化因子、配体和抗体分子，如拮抗性抗体分子和激动性抗体分子。在一个实施例中，其它蛋白质(protein/proteins)独立地选自包含以下的群组：结合cd3、cd28、cd80、cd86、4-1bb、gitr、ox40、cd27、cd40的和组合抗体、抗体片段或蛋白质配体，其例如呈适于在癌细胞表面上表达的形式。在一个实施例中，其它蛋白质为抗cd3抗体，例如独立地选自莫罗莫那-cd3(muromonab-cd3)(也被称作okt3)、奥昔珠单抗(otelixizumab)(也被称作trx4)、替利珠单抗(teplizumab)(也被称作hokt3γ1(ala-ala))或维西珠单抗(visilizumab)。在一个实施例中，抗cd3抗体呈抗体片段形式，例如作为融合蛋白的一部分的scfv，所述融合蛋白具有另一种蛋白质的跨膜区，例如来自pdgf受体或来自igg的细胞表面形式的跨膜域在一个实施例中，抗体分子为抑制剂(拮抗性抗体)，其独立地选自包含以下的群组：血管生成因子的抑制剂，如抗vegf抗体分子；和t细胞失活因子，如抗ctla-4、抗pd1或抗pdl1抗体分子。在一个实施例中，抗体分子为激动剂，其独立地选自包含cd40、gitr、ox40、cd27和4-1bb抗体的群组。在一个实施例中，其它转基因编码细胞因子或其可溶性变体，其选自包含以下的群组：il-2、ifnα、ifnβ、ifnγ、gm-csf、il-15、il-12和fms相关酪氨酸激酶3配体(flt3l)。有利地，通过病毒表达，尤其呈由癌细胞分泌的游离蛋白形式的这一蛋白质群组中的一种或多种可尤其适于在活体内向癌细胞刺激免疫反应。在一个实施例中，其它转基因编码趋化因子，其选自包含以下的群组：mip1-α、il-8、ccl5、ccl17、ccl20、ccl22、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl13、cxcl12、ccl2、ccl19和ccl21。有利地，通过病毒表达，尤其呈可由癌细胞分泌的游离蛋白形式的这一蛋白质群组中的一种或多种可尤其适于吸引免疫细胞并且在活体内向癌细胞刺激免疫反应。在一个实施例中，除了至少b7蛋白质或其活性片段表达在经感染癌细胞的表面上以外，一种或多种分子也表达在表面上和/或经分泌。因此，在一个实施例中，病毒编码b7-1、b7-2或其中的任一种的活性片段或其组合。因此，在一个实施例中，病毒编码用以在经感染癌细胞的表面上表达的b7-1、b7-2或其中的任一种的活性片段或其组合，和亦在癌细胞表面上表达的抗cd3(激动剂)抗体或抗体结合片段(如scfv)，确切地说，其中蛋白质以独立蛋白质形式表达在细胞表面上。因此，在一个实施例中，病毒编码用以在经感染癌细胞的表面上表达的b7-1、b7-2或其中的任一种的活性片段或其组合，和亦在癌细胞表面上表达或由癌细胞释放，例如通过在经感染癌细胞裂解/死亡之后分泌或的抗vegf(拮抗剂)抗体或其结合片段。因此，在一个实施例中，病毒编码用以在经感染癌细胞的表面上表达的b7-1、b7-2或其中的任一种的活性片段或其组合，和亦在癌细胞表面上表达或由癌细胞释放，例如通过在经感染癌细胞裂解/死亡之后分泌或释放的结合cd3、cd28、cd80、cd86、4-1bb、gitr、ox40、cd27、cd40的抗体、抗体片段或蛋白质配体。因此，在一个实施例中，病毒编码用以在经感染癌细胞的表面上表达的b7-1、b7-2或其中的任一种的活性片段或其组合，和例如由癌细胞释放，尤其通过在经感染癌细胞裂解/死亡之后分泌或释放的细胞因子，其选自il-2、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、gm-csf、il-15、il-12和flt3l。因此，在一个实施例中，病毒编码用以在经感染癌细胞的表面上表达的b7-1、b7-2或其中的任一种的活性片段或其组合，和例如由癌细胞释放，尤其通过在经感染癌细胞发生细胞裂解/死亡之后分泌或释放的趋化因子，其选自mip1-α、il-8、ccl5、ccl17、ccl20、ccl22、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl13、cxcl12、ccl2、ccl19、ccl21。因此，在一个实施例中，病毒编码用以在经感染癌细胞的表面上表达的b7-1、b7-2或其中的任一种的活性片段或其组合，和亦在癌细胞表面上表达的抗cd3(激动剂)抗体或抗体结合片段(如scfv)(确切地说，其中蛋白质以独立蛋白质形式表达在细胞表面上)并且进一步编码例如由癌细胞释放，尤其通过在经感染癌细胞发生细胞裂解/死亡之后分泌或的细胞因子或趋化因子，其选自il-2、ifn-α、ifn-γ、gm-csf、il-15、il-12、flt3l、mip1-α、il-8、ccl5、ccl17、ccl20、ccl22、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl13、cxcl12、ccl2、ccl19、ccl21。因此，在一个实施例中，病毒编码用以在经感染癌细胞的表面上表达的b7-1、b7-2或其中的任一种的活性片段或其组合，和亦在癌细胞表面上表达的抗cd3(激动剂)抗体或抗体片段(如scfv)(确切地说，其中蛋白质以独立蛋白质形式表达在细胞表面上)并且进一步编码亦在癌细胞表面上表达或由癌细胞释放，例如通过在经感染癌细胞裂解/死亡之后分泌或释放的结合cd28、cd80、cd86、4-1bb、gitr、ox40、cd27、cd40的抗体、抗体片段或蛋白质配体或抗vegf(拮抗剂)抗体。因此，在一个实施例中，病毒编码用以在经感染癌细胞的表面上表达的b7-1、b7-2或其中的任一种的活性片段或其组合，和由癌细胞释放，尤其通过在经感染癌细胞发生细胞裂解/死亡之后分泌的两种不同细胞因子或趋化因子，其选自il-2、ifnα、ifnβ、ifnγ、gm-csf、il-15和il-12、flt3l、mip1α、il-8、ccl5、ccl17、ccl20、ccl22、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl13、cxcl12、ccl2、ccl19、ccl21。因此，在一个实施例中，病毒编码用以在经感染癌细胞的表面上表达的b7-1、b7-2或其中的任一种的活性片段或其组合，和亦在癌细胞表面上表达的抗cd3(激动剂)抗体或抗体结合片段(如scfv)(确切地说，其中蛋白质以独立蛋白质形式表达在细胞表面上)并且进一步编码可由癌细胞释放，尤其通过在经感染癌细胞发生细胞裂解/死亡之前分泌和在其之后释放的细胞因子，其独立地选自il-2、ifnα、ifnγ、gm-csf、il-15和il-12和或选自rantes(ccl5)、mip1α(ld78α(ccl3)或ld78β(ccl3l1)同工型)、mip1β的趋化因子。在尤其可与上述实施例中的任一个组合的一个实施例中，病毒进一步编码抗pd-1抗体(拮抗剂)。在一个实施例中，编码于用于细胞膜表达的转基因盒中的蛋白质也可包含跨膜域与胞外配体结合域之间的肽连接子或间隔子。此类连接子或间隔子可为经细胞表面表达的蛋白质增加柔性，增强蛋白质与例如在相邻细胞上的其靶分子的相互作用的能力。此类连接子或间隔子还可经设计或选择以促进蛋白质通过二硫键形成或蛋白质-蛋白质相互作用在细胞表面处进行二聚作用或三聚作用。举例来说，免疫球蛋白分子或cd8的铰链区可用于增强柔性和二聚作用在一个实施例中，编码于转基因盒中的蛋白质也可包含肽标签。肽标签可包括c-myc、聚组氨酸、v5或flag标签并且可以胞内或胞外形式位于多肽的n端或c端上，或可编码于蛋白质中，例如胞外环中或跨膜域与胞外域之间。肽标签可用作不同蛋白质域，跨膜域与胞外域之间的间隔子或连接子，并且可用于检测或纯化或检测蛋白质或表达蛋白质的细胞。在一个实施例中，一种或多种其它转基因(不为编码b7蛋白质或其片段的基因)处于外生性或内生性启动子，例如内生性启动子的控制下。在一个实施例中，e3区中的转基因(b2)处于外生性启动子的控制下。在一个实施例中，一种或多种其它转基因基因处于e3区和腺病毒基因组中的纤维l5之间，例如处于式(i)构建体中的位置bx处，尤其处于外生性启动子的控制下，因此，在一个实施例中，bx中的转基因处于外生性的控制下。在一个实施例中，一种或多种其它转基因基因处于e4区和腺病毒基因组中的纤维l5之间，例如处于式(i)或(ia)构建体中的位置by处，尤其处于内生性启动子，如主要晚期启动子的控制下。这对于编码于by区中的b7蛋白质或其活性片段为例外。在一个实施例中，提供一种包含根据本发明的溶瘤腺病毒的组合物，例如医药组合物，其尤其包含医药学上可接受的赋形剂，如稀释剂或载剂。在一个实施例中，提供一种根据本发明的溶瘤腺病毒或一种供用于治疗中，尤其供用于治疗癌症中的包含其的组合物。在一个实施例中，提供一种治疗有需要的患者的方法，所述方法包含给予治疗有效量的根据本发明的溶瘤病毒或一种组合物，如包含其的医药组合物。在一个实施例中，提供一种根据本发明的溶瘤腺病毒或一种包含其的组合物的用途，其用于制造供用于治疗癌症，尤其癌瘤，例如结肠直肠癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、头颈癌、乳癌或卵巢癌的药物。在一个实施例中，提供一种聚核苷酸，其包含至少50％(例如55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)的根据本发明的病毒的基因组序列，并且包含编码b7蛋白质或其活性片段，例如本文中所公开的b7蛋白质，如b7-1或其活性片段的序列。在一个实施例中，多核苷酸序列呈质粒形式。在一个实施例中，提供一种宿主细胞，例如哺乳动物细胞，如hek293细胞或其衍生物，其包含根据本发明的溶瘤病毒或根据本发明的聚核苷酸序列。在一个实施例中，提供一种用于制备根据本发明的溶瘤腺病毒的方法，所述方法包含以下步骤：将编码b7蛋白质或其活性片段的聚核苷酸插入溶瘤腺病毒中。在一个实施例中，提供一种复制根据本发明的病毒的方法，所述方法包含以下步骤：在所述病毒存在下在适于复制的条件下培养宿主细胞。通常，所述方法将包含另一个步骤：例如从上清液或在宿主细胞裂解之后收集病毒。定义如本文中所采用的对癌细胞具有选择性的溶瘤病毒是指优先杀灭癌细胞的病毒，例如因为其优先感染癌细胞和/或病毒生命周期取决于基因，如癌细胞中失调的，例如过度表达的p53。在一个实施例中，溶瘤病毒优先感染癌细胞并且接着复制其基因组并产生衣壳蛋白来生成新型病毒颗粒，例如enad。可如以引用的方式并入本文中的w02005/118825中所述测试对癌细胞的选择性(治疗指数)。如本文中所采用的转基因是指已插入到腺病毒的基因组序列中的基因，其中基因并非由病毒产生(外生性)或由于在病毒中的特定位置而通常不会被发现。转基因的实例在本文中给出。如本文中所采用的转基因还包括作为基因一部分的基因的功能片段，当插入时，其适合于发挥全长基因的功能或大部分功能，例如功能的50％或更高。除非上下文以其它方式指明，否则在插入于病毒基因组中的情形下，转基因和编码序列在本文中可互换地使用。如本文中所采用的编码序列意指例如编码功能rna、肽、多肽或蛋白质的dna序列。通常，编码序列为编码功能rna、肽、多肽或相关蛋白质的转基因的cdna。功能rna、肽、多肽和相关蛋白质在下文中加以论述。在一个实施例中，如本文中所采用的转基因是指含有已从一种生物体中分离并且引入到不同生物体中的基因或cdna序列的一段dna，亦即本发明病毒。在一个实施例中，dna的这一非天然区段将通常保持产生功能rna、肽、多肽或蛋白质的能力。所用转基因可例如编码单一蛋白质或其活性片段、嵌合蛋白或融合蛋白。显而易见的是，病毒基因组含有dna的编码序列。在本发明的情形下，病毒的基因组序列中的内生性基因(天然存在的基因)不视为转基因，除非随后通过重组技术被修饰，如使其处于非天然位置或处于非天然环境中。因此，在一个实施例中，所插入的转基因编码人类或人源化蛋白质、多肽或肽。在一个实施例中，转基因包含编码b7蛋白质或其活性片段的dna序列。本发明提供可以一种或多种形式提供的b7蛋白质或其活化片段，所述形式独立地选自融合蛋白、简单的b7蛋白质或其活性片段。如本文中所采用的简单b7蛋白质或其活性片段是指基本上为野生型蛋白质的蛋白质，例如其不为融合蛋白的一部分并且其具有与相关已知的蛋白质，尤其已知的人类蛋白质一致或相似的序列。简单的基因还包括其中在相关蛋白质的全长上，10％的氨基酸被取代或缺失。如本文中所采用的gpi锚定物是指在翻译后修饰期间可与蛋白质的c端结合的糖脂。其由通过含碳水化合物的连接子(通过糖苷键结合到肌醇残留物的葡糖胺和甘露糖)和通过与成熟蛋白质的c端氨基酸桥接的乙醇胺磷酸酯(etnp)连接的磷脂酰肌醇群构成。疏水性磷脂酰肌醇群中的两种脂肪酸将蛋白质锚定于细胞膜。磷脂酰肌醇化(经gpi连接)的蛋白质通常含有信号肽，由此将其引导到内质网(er)中。c端由保持插入于er膜中的疏水性氨基酸构成。疏水性末端随后裂解并由gpi锚定物替代。随着蛋白质前进通过分泌路径，其通过囊泡被转移到高尔基体并且最终被转移到胞外空间，在所述胞外空间中，其仍与细胞膜的外小叶结合。由于磷脂酰肌醇化为将此类蛋白质结合到膜的唯一手段，磷脂酶所引起的群断裂将引起蛋白质从膜被控制释放。后一机制用于活体外；即，酶分析中由膜释放的膜蛋白为磷脂酰肌醇化蛋白质。磷脂酶c(plc)为已知的裂解经gpi锚定的蛋白质中所发现的磷酸甘油鍵的酶。利用plc的处理将引起经gpi连接的蛋白质从外细胞膜释放。已知t细胞标记物thy-1和乙酰胆碱酯酶，以及肠和胎盘碱性磷酸酶为经gpi连接的并且通过利用plc的处理进行释放。经gpi连接的蛋白质被认为优先位于脂筏(lipidraft)处，表明质膜微域中的高组织水平。可在由ferguson、kinoshita和hart编写的《糖生物学概要(essentialsofglycobiology)》(第2版)的第11章中获得对gpi锚定物的综述。病毒在本发明的情形下，具有复制能力(replicationcompetent)是指病毒具有活体外和活体内在细胞中进行复制所需的全部机制，即不需要包装细胞系的帮助。能够在互补包装细胞系中复制的例如缺失至少e1a区的病毒载体在本文中并不具有复制能力。病毒载体为需要包装细胞系(包含转基因)来进行复制的复制缺陷型病毒。如本文中所采用的具有复制能力的病毒是指复制胜任型病毒或复制取决于癌细胞中的因子，例如上调因子，如p53或类似物的病毒。在一个实施例中，腺病毒为人类腺病毒。如本文中所采用的“腺病毒”、“血清型”或“腺病毒血清型”是指可指配给全部50种当前已知的腺病毒血清型中的任一种的任何腺病毒，其分类成亚群a-f，并且进一步扩展到任何迄今为止未鉴别或未分类的腺病毒血清型。参见例如strauss,《人类中的腺病毒感染(adenovirusinfectionsinhumans)》,《腺病毒(adenoviruses)》ginsberg,ea.,普雷纳姆出版社(plenumpress),纽约,ny,第451-596页(1984)和shenk,《(腺病毒科：病毒和其复制(adenoviridae:thevirusesandtheirreplication))》,《费氏病毒学(fieldsvirology)》,第2卷,第四版,knipe,35ea.,利平科特威廉姆斯和维尔金斯出版社(lippincottwilliams&wilkins),第2265-2267页(2001)，如表1中所示。腺病毒基于其衣壳进行分组。在一个实施例中，腺病毒为亚群b，例如独立地选自包含以下或由以下组成的群组：ad3、ad7、ad11、ad14、ad16、ad21、ad34和ad51，如ad11，尤其ad11p(slobitski病毒株)。在一个实施例中，本发明的腺病毒具有衣壳，如亚群b腺病毒，如ad11，尤其ad11p的六邻体和/或纤维。在一个实施例中，腺病毒为ad11或具有ad11，如ad11p的纤维和/或六邻体和/或五邻体。在一个实施例中，本发明病毒不为a组病毒。在一个实施例中，本发明病毒不包含腺病毒死亡蛋白(adp)。在一个实施例中，本发明病毒不为c组病毒。在一个实施例中，本发明病毒不包含更多ad5病毒和ad5病毒的一部分的片段。enadenotucirev(enad)为嵌合溶瘤腺病毒，先前被称为coloadl(w02005/118825)，其具有来自ad11p的纤维、五邻体和六邻体，因此其为亚群b病毒。其具有嵌合e2b区，包含来自ad11p和ad3的dna。enad中缺失几乎所有的e3区和e4区的一部分。因此，其在基因组中具有大量空间以容纳其它遗传物质同时保持活性。此外，由于enad为亚群b腺病毒，因此相较于例如ad5，人类中预先存在的免疫性较不常见。具有ad11纤维、五邻体和六邻体的嵌合溶瘤病毒的其它实例包括ovad1和ovad2(参见w02006/060314)。enad似乎优先感染肿瘤细胞，在这些细胞中快速复制并引起细胞裂解。随后，这可生成炎性免疫应答，由此刺激身体也和癌症抗争。假设enad的一部分成功与活体内病毒的较快复制相关。重要的是，已在临床上证实enad可全身性给予(例如通过静脉内或腹膜内注射或输注)并且随后在肿瘤细胞中选择性地感染和表达蛋白质。enad的可与ad11p和其它b组腺病毒，尤其表达ad11p的衣壳蛋白的那些腺病毒(如本文所述的那些)共有的这一特性使得其可在癌细胞的表面上表达蛋白质而不用必须将转基因直接注入肿瘤中，这对于多种癌症而言并不可行。enad选择性地裂解肿瘤细胞的同时，可引入其它有益特性，例如通过向其提供转基因，如编码细胞信号传递蛋白或抗体的转基因，或编码刺激细胞信号传递蛋白的实体的转基因来增加病毒的治疗活性或降低病毒的副作用。有利的是，向病毒提供编码可表达于癌细胞内的特定蛋白质的dna可使身体的自身防御机制能用于更有效地对抗肿瘤细胞，例如通过使细胞对免疫系统更可见或通过将治疗性基因/蛋白质优先递送到靶向肿瘤细胞。在一个实施例中，本发明的溶瘤腺病毒例如通过降低癌症抑制免疫应答的能力来刺激患者的免疫系统以与肿瘤抗争。在一个实施例中，溶瘤病毒具有来自相同血清型，例如ad11，尤其ad11p的纤维、六邻体和五邻体蛋白质，例如在后者基因组序列的位置30812-31789、18254-21100和13682-15367处所发现的纤维、六邻体和五邻体蛋白质，其中核苷酸位置与基因库id217307399(登录号：gc689208)相对应。在一个实施例中，腺病毒为enadenotucirev(也被称作enad，并且先前被称作coload1)。如本文中所采用的enadenotucirev是指seqidno:21的嵌合腺病毒。其为具有复制能力的溶瘤嵌合腺病毒，与野生型腺病毒相比，其具有增加的治疗特性(参见w02005/118825)。enad具有嵌合e2b区，其具有来自ad11p和ad3的dna并且缺失e3/e4。enadenotucirev中的结构变化产生比ad11p小大约3.5kb的基因组，由此提供用于插入转基因的额外“空间”。如所采用的抗体分子可包含具有全长重链和轻链的完整抗体分子、双特异性抗体形式，包含其中的任一种的全长抗体或片段，所述抗体或片段包括(但不限于)以上中的任一种的fab、经修饰的fab、fab'、经修饰的fab'、f(ab')2、fv、单域抗体(例如vh或vl或vhh)、scfv、二价、三价或四价抗体、bis-scfv、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体和表位结合片段(参见例如holliger和hudson,2005,《自然生物技术(naturebiotech.)》23(9):1126-1136；adair和lawson,2005,《药物设计综述在线(drugdesignreviews-online)》2(3),209-217)。产生和制造这些抗体片段的方法在所属领域中是众所周知的(参见例如verma等人，1998,《免疫学方法杂志(journalofimmunologicalmethods)》216,165-181)。供用于本发明中的其它抗体片段包括国际专利申请案w02005/003169、w02005/003170和w02005/003171中所述的fab和fab'片段。多价抗体可包含多种特异性抗体，例如双特异性或可为单特异性(参见例如wo92/22853、w005/113605、w02009/040562和w02010/035012)。除非上下文以其他方式指明，否则如本文中所采用的抗体是指全长抗体。抗体结合片段是指包含结合域，如vh和/或vl的片段，其保留对所结合的靶抗原的特异性，并且例如为其中的任一种的fab、经修饰的fab、fab'、经修饰的fab'、f(ab')2、fv、单域抗体(例如vh或vl或vhh)、scfv、二价、三价或四价抗体、bis-scfv、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体和表位结合片段。连接子适用于本发明的融合蛋白的连接子包括：表2.铰链连接序列seqidno:序列26dkthtcaa27dkthtcppcpa28dkthtcppcpatcppcpa29dkthtcppcpatcppcpatcppcpa30dkthtcppcpagkptlynslvmsdtagtcy31dkthtcppcpagkpthvnvsvvmaevdgtcy32dkthtccvecppcpa33dkthtcprcpepkscdtpppcprcpa34dkthtcpscpa表3.柔性连接序列(s)在中序列37到41中为任选的，刚性连接子的实例包括肽序列gapapaapapa(seqidno:75)、pppp(seqidno:76)和ppp。其它连接子展示于表4中：seqidno:序列77dlclrdwgclw78diclprwgclw79mediclprwgclwgd80qrlmediclprwgclwedde81qgligdiclprwgclwgrsv82qgligdiclprwgclwgrsvk83ediclprwgclwedd84rlmediclprwgclwedd85mediclprwgclwedd86mediclprwgclwed87rlmediclarwgclwedd88evrsfctrwpaeksckplrg89rapesfvcyweticferseq90emcyfpgicwm与式(i)和(ia)相关的定义键(bond)是指连接一个dna序列与另一个dna序列，例如连接病毒基因组的一部分与另一部分的共价键。因此，当式(i)和(ia)中的变量在本文中表示键时，由所述键表示的特征或元素不存在，即缺失。由于腺病毒的结构一般相似，因此就结构元素和技术人员已知的指代其的常用术语而言论述以下元素。当在本文中提及一种元素时，那么我们是指编码所述元素的dna序列或编码腺病毒中的元素的相同结构蛋白质的dna序列。由于dna编码的重复性，后者为恰当的。根据优化结果可需要针对密码子使用情况考虑优选病毒。本发明病毒中所采用的来自腺病毒的任何结构元素可包含天然序列或由天然序列组成或可在给定长度上具有至少95％，如96％、97％、98％、99％或100％的相似度。原始序列可经修饰而省略10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的遗传物质。技术人员意识到当作出改变时，病毒的阅读框必须不会被中断以使得结构性蛋白质的表达被中断。在一个实施例中，给定元素为全长序列，即全长基因。如本文中所采用的全长基因至少是指基因的编码序列的全部，但可包括任何相缔合的非编码区，尤其在其与基因功能相关的情况下。在一个实施例中，给定元素小于全长并且保留作为全长序列的相同或相应功能。在一个实施例中，对于本发明构建体中任选的给定元素，dna序列可小于全长并且不具有功能性，例如e3区可完全或部分缺失。然而，大体上缺失全部e3区可为有用的，因为这会优化可用于插入转基因的空间。编码腺病毒的结构性或功能性蛋白质的结构性基因通常通过dna的非编码区来连接。因此，出于将转基因插入于本发明病毒中的目的，在周围存在一定柔性，以“分割”相关结构元素的基因组序列(尤其其非编码区)。因此出于本发明目的，所述元素将被视为指代其适用于目的的程度的结构元素并且不会编码外来物质。因此，在适当情况下，基因将与合适的非编码区缔合，例如如病毒的天然结构中所发现因此，在一个实施例中，将插入物，如编码限制位点和/或转基因的dna插入到基因组病毒dna的非编码区，如内含子或基因间序列中。由此这些腺病毒的非编码区可例如在选择性剪接、转录调节或翻译调节方面具有功能，并且可能需要将这考虑在内。本文中所鉴别的与l5区缔合的位点适于容纳多种编码如rnai、细胞因子、单链或多聚蛋白质，如抗体的复杂实体的dna序列。如本文中所采用的基因是指与其缔合的编码序列和任何非编码序列，例如内含子和缔合外显子。在一个实施例中，基因仅包含或仅由基本结构性组分，例如编码区组成。下文为与腺病毒的特定结构元素有关的论述。反向末端重复(itr)序列对全部已知的腺病毒来说为常见的(由于其对称性而因此命名)并且为病毒染色体复制起点。这些序列的另一种特性为其能够形成发夹结构(hairpin)。如本文中所采用的5'itr是指来自腺病毒5'端的部分或全部itr，当在适宜位置处并入于腺病毒中时，其保留itr的功能。在一个实施例中，5ttr包含或由以下组成：seqidno:21的约1bp到138bp的序列或沿全长与其有90、95、96、97、98或99％一致性的序列，尤其由seqidno:21的约1bp到138bp的序列组成。如本文中所采用的3'itr是指来自腺病毒3'端的部分或全部itr，当在适宜位置处并入于腺病毒中时，其保留itr的功能。在一个实施例中，3'itr包含或由以下组成：seqidno:21的约32189bp到32326bp的序列或沿全长与其有90、95、96、97、98或99％一致性的序列，尤其由seqidno:21的约32189bp到32326bp的序列组成。如本文中所采用的b1是指编码：来自腺病毒的e1a的部分或全部、腺病毒的e1b区的部分或全部，和独立地编码腺病毒的e1a和e1b区的部分或全部的dna序列。当b1为键时，那么将从病毒忽略e1a和e1b序列。在一个实施例中，b1为一个键并且因此病毒为载体。在一个实施例中，b1进一步包含转基因。所属领域中已知的是e1区可容纳可以断裂方式插入于e1区中(即序列“中间”处)的转基因，或部分或全部e1区可缺失以提供容纳遗传物质的更多空间。如本文中所采用的e1a是指编码部分或全部腺病毒e1a区的dna序列。此处，后者是指多肽/蛋白质e1a。其可经突变而使得由e1a基因编码的蛋白质具有保守性或非保守性氨基酸变化(例如在全长上1、2、3、4或5个氨基酸发生变化、增加和/或缺失)，使得其视需要具有：与野生型(即相应未突变蛋白质)一样的功能；与野生型蛋白质相比增加的功能；与野生型蛋白质相比减少的功能，如无功能；或与野生型蛋白质相比具有新功能或其组合。如本文中所采用的e1b是指编码部分或全部腺病毒e1b区(即多肽或蛋白质)的dna序列，其可经突变而使得由e1b基因/区编码的蛋白质具有保守性或非保守性氨基酸变化(例如在全长上1、2、3、4或5个氨基酸发生变化、增加和/或缺失)，使得其视需要具有：与野生型(即相应未突变蛋白质)一样的功能；与野生型蛋白质相比增加的功能；与野生型蛋白质相比减少的功能，如无功能；或与野生型蛋白质相比具有新功能或其组合。因此b1可相对于野生型e1区，如野生型e1a和/或e1b被修饰或不被修饰。技术人员可简单地鉴别e1a和/或e1b是否存在或(部分)缺失或突变。如本文中所采用的野生型是指已知腺病毒或来自已知腺病毒的序列。已知的腺病毒为已被鉴别并加以命名的腺病毒，与是否可获得序列信息无关。在一个实施例中，b1具有seqidno:21的139bp到3932bp的序列。如本文中所采用的ba是指编码e2b-l1-l2-l3-e2a-l4区的dna序列，其视需要包括任何非编码序列(尤其对应于来自腺病毒的天然序列)。通常，这一序列将不包含转基因。在一个实施例中，序列大体上与来自已知腺病毒，例如表1中所示的血清型，尤其b组病毒，例如ad3、ad7、ad11、ad14、ad16、ad21、ad34、ad35、ad51或其组合，如ad3、ad11或其组合的连续序列类似或一致。在一个实施例中，e2b-l1-l2-l3-e2a-l4是指包含与所述区缔合的这些元素和其它结构元素，例如ba将通常包括编码蛋白质iv2a，例如如下：iv2aiv2a-e2b-l1-l2-l3-e2a-l4的序列。在一个实施例中，e2b区为嵌合的。即，包含来自两种或更多种不同腺病毒血清型，例如来自ad3和ad11，如ad11p的dna序列。在一个实施例中，e2b区具有seqidno:21的5068bp到10355bp的序列或在全长上与其有95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。在一个实施例中，组分ba中的e2b包含seqidno:22中所示的序列(其对应于w02005/118825中所公开的seqidno:3)。在一个实施例中，ba具有seqidno:21的3933bp到27184bp的序列。如本文中所采用的e3是指编码部分或全部腺病毒e3区(即蛋白质/多肽)的dna序列，其可经突变而使得由e3基因编码的蛋白质具有保守性或非保守性氨基酸变化(例如在全长上1、2、3、4或5个氨基酸发生变化、增加和/或缺失)，使得其视需要具有与野生型(即相应未突变蛋白质)一样的功能；与野生型蛋白质相比增加的功能；与野生型蛋白质相比减少的功能，如无功能；或与野生型蛋白质相比具有新功能或其组合。在一个实施例中，e3区形成表1中给定的腺病毒血清型或其组合，尤其b组血清型，例如ad3、ad7、ad11(尤其ad11p)、ad14、ad16、ad21、ad34、ad35、ad51或其组合，如ad3、ad11(尤其ad11p)或其组合。在一个实施例中，e3区具有seqidno:23中所示的序列。在一个实施例中，e3区为部分缺失的，例如缺失95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％。在一个实施例中，b2为一个键，其中不存在编码e3区的dna。在一个实施例中，编码e3区的dna可被替代或间杂有转基因。由如本文中所采用的转基因替代的如本文中所采用的“e3区包括被转基因替代的部分或全部e3区。在一个实施例中，b2区包含seqidno:24的27185bp到28165bp的序列。在一个实施例中，b2由seqidno:24的27185bp到28165bp的序列组成。如本文中所采用的bx是指在bb中的l5基因的5'端附近的dna序列。如本文中所采用的在l5基因的5'端的附近或邻近是指：邻近(相邻)于l5基因的5'端或与其固有地缔合的非编码区，即邻接或相邻于l5基因的5'端或与其固有地缔合的非编码区。或者，在附近或或邻近可指闭合l5基因，使得在bx区和l5基因的5'端之间不存在编码序列。因此，在一个实施例中，bx与l5的碱基直接连接，其表示例如l5基因的编码序列的起点。因此，在一个实施例中，bx与l5的碱基直接连接，其例如表示非编码序列的起点，或与l5天然缔合的非编码区直接连接。如本文中所采用的与l5天然缔合的非编码区是指作为l5基因的一部分或与其相邻但并非另一种基因的一部分的全部非编码区的一部分。在一个实施例中，bx包含seqidno:24的序列。这一序列为人工非编码序列，其中例如包含转基因(或转基因盒)、限制位点或其组合的dna序列可插入其中。这一序列为有利的，因为其充当缓冲区，原因在于其在转基因的具体位置上提供一定柔性，同时使对病毒稳定性和存活率的破坏性影响降到最低。插入物可出现在seqidno:24中从5'端、3'端开始的任何位置或位于bp1到201之间，例如以下碱基对之间的任一点处：1/2、2/3、3/4、4/5、5/6、6/7、7/8、8/9、9/10、10/11、11/12、12/13、13/14、14/15、15/16、16/17、17/18、18/19、19/20、20/21、21/22、22/23、23/24、24/25、25/26、26/27、27/28、28/29、29/30、30/31、31/32、32/33、33/34、34/35、35/36、36/37、37/38、38/39、39/40、40/41、41/42、42/43、43/44、44/45、45/46、46/47、47/48、48/49、49/50、50/51、51/52、52/53、53/54、54/55、55/56、56/57、57/58、58/59、59/60、60/61、61/62、62/63、63/64、64/65、65/66、66/67、67/68、68/69、69/70、70/71、71/72、72/73、73/74、74/75、75/76、76/77、77/78、78/79、79/80、80/81、81/82、82/83、83/84、84/85、85/86、86/87、87/88、88/89、89/90、90/91、91/92、92/93、93/94、94/95、95/96、96/97、97/98、98/99、99/100、100/101、101/102、102/103、103/104、104/105、105/106、106/107、107/108、108/109、109/110、110/111、111/112、112/113、113/114、114/115、115/116、116/117、117/118、118/119、119/120、120/121、121/122、122/123、123/124、124/125、125/126、126/127、127/128、128/129、129/130、130/131、131/132、132/133、133/134、134/135、135/136、136/137、137/138、138/139、139/140、140/141、141/142、142/143、143/144、144/145、145/146、146/147、147/148、148/149、150/151、151/152、152/153、153/154、154/155、155/156、156/157、157/158、158/159、159/160、160/161、161/162、162/163、163/164、164/165、165/166、166/167、167/168、168/169、169/170、170/171、171/172、172/173、173/174、174/175、175/176、176/177、177/178、178/179、179/180、180/181、181/182、182/183、183/184、184/185、185/186、186/187、187/188、189/190、190/191、191/192、192/193、193/194、194/195、195/196、196/197、197/198、198/199、199/200或200/201。在一个实施例中，bx包含具有插入在bp27和bp28之间或对应于seqidno:24的位置28192bp和28193bp之间的位置的dna序列的seqidno:24。在一个实施例中，bx具有seqidno:21的28166bp到28366bp的序列。在一个实施例中，bx为一个键。如本文中所采用的bb是指编码l5区的dna序列。如本文中所采用的l5区是指在情形下视需要含有编码纤维多肽/蛋白质的基因的dna序列。纤维基因/区编码纤维蛋白质，其为腺病毒的主要衣壳组分。纤维在受体识别中发挥作用并促成腺病毒选择性地结合和感染细胞的能力。在本发明病毒中，纤维可来自任何腺病毒血清型和呈嵌合形式的腺病毒，因为还结合本发明设想改变不同血清型中的一种的纤维。在一个实施例中，为来自b组病毒，尤其ad11，如ad11p。在一个实施例中，bb具有seqidno:21的28367bp到29344bp的序列。如本文中所采用的与by有关的dna序列是指在bb的l5基因的3'端附近的dna序列。如本文中所采用的在l5基因的3'端附近或邻近是指：邻近(相邻)于l5基因的3'端或与其固有地缔合的非编码区，即邻接或相邻于l5基因的3'端或与其固有地缔合的非编码区(即全部或部分非编码序列内生于l5)。或者，在附近或或邻近可指闭合l5基因，使得在by区和l5基因的3'端之间不存在编码序列。因此，在一个实施例中，by与l5的碱基直接连接，其表示编码序列的“终端”。因此，在一个实施例中，by与l5的碱基直接连接，其表示非编码序列的“终端”，或与l5天然缔合的非编码区直接连接。固有地和天然地在本文中可互换地使用。在一个实施例中，by包含seqidno:25的序列。这一序列为非编码序列，其中例如包含转基因(或转基因盒)、限制位点或其组合的dna序列可被插入。这一序列为有利的，因为其充当缓冲区，原因在于其在转基因的具体位置上提供一定柔性，同时使对病毒稳定性和存活率的破坏性影响降到最低。插入物可出现在seqidno:22中从5'端、3'端开始的任何位置或位于bp1到35之间，例如以下碱基对之间的任一点处：1/2、2/3、3/4、4/5、5/6、6/7、7/8、8/9、9/10、10/11、11/12、12/13、13/14、14/15、15/16、16/17、17/18、18/19、19/20、20/21、21/22、22/23、23/24、24/25、25/26、26/27、27/28、28/29、29/30、30/31、31/32、32/33、33/34或34/35。在一个实施例中，by包含具有插入在位置bp12和13之间或对应于seqidno:21的29356bp和29357bp的位置的dna序列的seqidno:25。在一个实施例中，插入物为限制位点插入物。在一个实施例中，限制位点插入物包含一个或两个限制位点。在一个实施例中，限制位点为包含2个限制位点的19bp限制位点插入物。在一个实施例中，限制位点插入物为包含1个限制位点的9bp限制位点插入物。在一个实施例中，限制位点插入物包含一个或两个限制位点和至少一种转基因，例如一种或两种或三种转基因，如一种或两种转基因。在一个实施例中，限制位点为包含2个限制位点和至少一种转基因，例如一种或两种转基因的19bp限制位点插入物。在一个实施例中，限制位点插入物为包含1个限制位点和至少一种转基因，例如一种或两种转基因的9bp限制位点插入物。在一个实施例中，两个限制位点包夹一种或多种，如两种转基因(例如转基因盒中)。在一个实施例中，当by包含两个限制位点时，所述限制位点彼此不同。在一个实施例中，by中的所述一个或多个限制位点在在其已插入其中的特定腺病毒基因组中为非天然存在的(如特有的)。在一个实施例中，by中的所述一个或多个限制位点与位于腺病毒基因组中的其他处的其它限制位点不同，例如与引入到基因组的其它部分，如bx中的天然存在的限制位点不同。因此，在一个实施例中，限制位点使得区中的dna以特定方式被分割。在一个实施例中，by具有seqidno:21的29345bp到29379bp的序列。在一个实施例中，by为一个键。在一个实施例中，插入物在seqidno:25中的bp12之后。在一个实施例中，插入物处于seqidno:21的约位置29356bp处。在一个实施例中，插入物为包含一种或多种，例如1、2或3种，如1或2种转基因的转基因盒。如本文中所采用的e4是指编码部分或全部腺病毒e4区(即多肽/蛋白质区)的dna序列，其可经突变而使得由e4基因编码的蛋白质具有保守性或非保守性氨基酸变化(例如1、2、3、4或5个氨基酸发生变化、增加和/或缺失)，并且具有与野生型(即相应未突变蛋白质)一样的功能；与野生型蛋白质相比增加的功能；与野生型蛋白质相比减少的功能，如无功能；或与野生型蛋白质相比具有新功能或其组合。在一个实施例中，e4区为部分缺失的，例如缺失95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一个实施例中，e4区具有seqidno:21的32188bp到29380bp的序列。在一个实施例中，除了缺失的e4orf4区外，存在e4。在一个实施例中，b3为一个键，即其中e4不存在。在一个实施例中，b3具有由seqidno:21的32188bp到29380bp组成的序列。如本文中所采用的数值范围包括端点。技术人员将了解，在本文中的式，如式(i)、(ia)中的元素为相邻的并且可体现本文中提到的非编码dna序列以及基因和编码dna序列(结构特征)。在一个或多个实施例中，本发明的式试图描述腺病毒基因组中天然存在的序列。在此情形下，技术人员应显而易见的是，所述式是指表征基因组的相关区的主要元素并且并非意图为dna的基因组伸长部的详尽描述。如本文中所采用的e1a、e1b、e3和e4各自独立地是指来自已知腺病毒的野生型和其等效物、如本文所述的每个区的突变或部分缺失形式，尤其野生型序列。如本文中所采用的“插入物”是指并入于5'端、3'端处或给定的dna序列参照区段中以使得其中断参考序列的dna序列。对用作相对于插入物的参考点的参考序列进行定位。在本发明的情形下，插入物通常出现在seqidno:24或seqidno:25中。插入物可为限制位点插入物、转基因盒或这两者。当序列被中断时，病毒将仍包含原始序列，但通常其将呈包夹插入物的两个片段形式。在一个实施例中，转基因或转基因盒不包含无偏移插入的转座子，如tn7转座子或其部分。如本文中所采用的tn7转座子是指如w02008/080003中所述的无偏移插入转座子。在一个实施例中，转基因或转基因盒进一步包含调节元件或序列。其它调节序列如本文中所采用的“基因表达的调节因子”(或调节因子/调节元件)是指在基因表达中通常通过诱导或增强转录或翻译而起一定作用的基因元素，如启动子、强化子或剪接受体序列。如本文中所采用的“剪接受体序列”、“剪接受体”或“剪接位点”是指在mrna分子将通过剪接复合体的小型细胞核核糖核蛋白识别时测定的调节序列。在装配后，剪接体在mrna分子的剪接受体位点之间催化剪接到制造成熟mrna分子的上游剪接供体位点，所述成熟mrna分子可经翻译而产生单一多肽或蛋白质。可在本发明中采用不同尺寸的剪接受体序列并且这些序列可被描述为短剪接受体(小型)、(中等)剪接受体和分支剪接受体(大型)。如本文中所采用的ssa是指短剪接受体，通常仅包含剪接位点,例如4bp。如本文中所采用的sa是指剪接受体，通常包含短剪接受体和多嘧啶区，例如16bp。如本文中所采用的bsa是指分支剪接受体，通常包含短剪接受体、多嘧啶区和分支点，例如26bp。在一个实施例中，本发明构建体中所用的剪接受体为cagg或seqidno:3或4。在一个实施例中，ssa具有seqidno:cagg的核苷酸序列。在一个实施例中，sa具有seqidno:23的核苷酸序列。在一个实施例中，bsa具有cagg的核苷酸序列。在一个实施例中，剪接受体序列独立地选自包含以下的群组：tgctaatcttcctttctctcttcagg(seqidno:4)、tttctctcttcagg(seqidno:3)和cagg。在一个实施例中，紧接着通过共有包含ccacc的kozak序列来推进剪接位点(即遵照沿5'到3'方向)。在一个实施例中，以高达100或更低bp散布(分离)剪接位点和kozak序列。在一个实施例中，kozak序列具有ccacc的核苷酸序列。通常，当处于内生性或外生性启动子(如内生性启动子)的控制下时，编码序列将紧挨在kozak序列后。编码区的起点由起始密码子(aug)指示，例如处于序列(gcc)gccrccaugg[seqidno:105]的情形下，编码序列的起点起点由粗体形式的碱基指示。小写字母表示这一位置处的常用碱基(然而可为不同的)并且大写字母指示高度保守碱基，即‘augg’序列不变或即使有变化也很少；‘r’指示在这一位置处通常会观察到嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)并且括号中的序列(gcc)的意义不确定。因此，在一个实施例中，起始密码子aug并入kozak序列中。如本文中所采用的内部核糖体进入dna序列是指编码内部核糖体进入序列(ires)的dna序列。如本文中所采用的ires意指使得可诱导信使rna(mrna)序列翻译，包括在mrna序列中开始的诱导的核苷酸序列。当盒编码多顺反子mrna时，这为尤其有用的。使用ires产生翻译成多种独立蛋白质或肽的多顺反子mrna。在一个实施例中，内部核糖体进入dna序列具有seqidno:6的核苷酸序列。在一个实施例中，在基因组中仅使用特定ires一次。这可具有关于基因组稳定性的益处。如本文中所采用的“高效可自剪切的2a肽”或“2a肽”是指在翻译之后被有效裂解的肽。合适的2a肽包括p2a、f2a、e2a和t2a。本发明人已提到编码给定2a肽的特异性dna序列被使用一次后，同一特异性dna序列可能不会被再次使用。然而，可利用dna编码的重复性来生成翻译成相同2a肽的dna序列。当盒编码多顺反子mrna时，使用2a肽尤其有用。使用2a肽产生翻译后的单一多肽链，其在翻译后经修饰而生成多种独立蛋白质或肽。在一个实施例中，所用经编码的p2a肽具有seqidno:7的氨基酸序列。在一个实施例中，所用经编码的f2a肽具有seqidno:8的氨基酸序列。在一个实施例中，所用经编码的e2a肽具有seqidno:9的氨基酸序列。在一个实施例中，所用经编码的t2a肽具有seqidno:10的氨基酸序列。在一个实施例中，由转基因编码的mrna或每一mrna包含聚腺苷酸化信号序列，如通常在mrna序列的终端处，例如如seqidno:5中所示。因此，在一个实施例中，转基因或转基因盒包含编码聚腺苷酸化信号序列的至少一个序列。如本文中所采用的“polya”、“聚腺苷酸化信号”或“聚腺苷酸化序列”意指通常含有aataaa位点的dna序列，其在转录后可通过多蛋白复合体来识别，所述多蛋白复合体裂解并聚腺苷酸化新生mrna分子。在一个实施例中，聚腺苷酸化序列具有seqidno:5的核苷酸序列。在一个实施例中，构建体不包括聚腺苷酸化序列。在一个实施例中，基因表达的调节因子为剪接受体序列。在一个实施例中，编码蛋白质/多肽/肽，如抗体或抗体结合片段的序列进一步包含聚腺苷酸化信号。在一个实施例中，提供一种具有本文中所公开的序列的病毒或构建体，例如选自以下的病毒：ng-330(seqidno:16)；ng-334(seqidno:17)；ng-345(seqidno:18)；ng-346(seqidno:19)；ng-347(seqidno:20)和ng-348(seqidno:96)。在一个实施例中，病毒为ng-347(seqidno:20)或ng-348(seqidno:96)。调配物本发明还涉及扩展到如本文所述的病毒的医药调配物。在一个实施例中，提供一种具有复制能力的根据本发明的溶瘤的例如用于输注或注射的液体肠胃外调配物，其中所述调配物每剂量体积提供在1×1010到1×1014个病毒颗粒范围内的剂量。肠胃外调配物意指被设计成不通过胃肠道递送的调配物。典型的肠胃外递送途径包括注射、植入或输注。在一个实施例中，调配物以大丸剂递送(bolusdelivery)形式提供。在一个实施例中，肠胃外调配物呈注射形式。注射包括静脉内、皮下、肿瘤内或肌肉内注射。如本文中所采用的注射意指通过注射器将液体插入到体内。在一个实施例中，本发明方法不涉及肿瘤内注射。在一个实施例中，肠胃外调配物呈输注形式。如本文中所采用的输注意指通过滴液、输注泵、注射器驱动器或等效装置以较慢速率给予流体。在一个实施例中，在1.5分钟到120分钟范围内的时间段内给予输注，如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、65、80、85、90、95、100、105、110或115分钟。在一个实施例中，如通过注射器驱动器给予的调配物的一个剂量小于100ml，例如30ml。在一个实施例中，例如在1.5到30分钟的的时间段内以缓慢注射形式给予注射。在一个实施例中，调配物用于静脉内(i.v.)给药。这一途径对于递送溶瘤病毒尤其有效，因为其使得可快速进入大多数器官和组织并且尤其适用于治疗转移瘤，例如已获确认的转移瘤，尤其位于高度血管化区域，如肝和肺的转移瘤。治疗调配物在制造和储存条件下通常将为无菌和稳定的。可以溶液、微乳液、脂质体或适于给予到人类的其它肠胃外调配物形式调配并且可以预填充装置，如注射器或小瓶形式，尤其以单一剂量形式调配组合物。调配物将通常包含与病毒相容的医药学上可接受的稀释剂或载剂，例如无毒、等张载剂，并且其中病毒会稳定持续必要时间段。载剂可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用分散剂或表面活性剂，如卵磷脂或非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯80或40来维持适当的流动性。在分散液中，可通过存在表面活性剂来辅助维持所需粒径。组合物中的等张剂的实例包括糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。在一个实施例中，所用肠胃外调配物可包含以下中的一种或多种：缓冲液，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、磷酸盐缓冲剂和/或tris缓冲液；糖，例如右旋糖、甘露糖、蔗糖或类似物；盐，如氯化钠、氯化镁或氯化钾；清洁剂，如非离子型表面活性剂，如brij、ps-80、ps-40或类似物。调配物还可包含防腐剂，如edta或乙醇或edta与乙醇的组合，其被认为会阻止一个或多个可能降解的路径。在一个实施例中，调配物将包含纯化的根据本发明的溶瘤病毒，例如每剂量1×1010到1×1014个病毒颗粒，如每剂量1×1010到1×1012个病毒颗粒。在一个实施例中，病毒在调配物中的浓度在2×l08到2×l014vp/ml，如2×1012vp/ml范围内。在一个实施例中，肠胃外调配物包含甘油。在一个实施例中，调配物包含如本文所述的溶瘤腺病毒、hepes(n-2-羟基乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸)、甘油和缓冲液。在一个实施例中，肠胃外调配物由本发明病毒、hepes(例如5mm)、甘油(5-20％(v/v))、盐酸(例如以将ph调整到7-8范围内)和注射用水组成。在一个实施例中，以2×1012vp/ml的浓度将0.7ml本发明病毒调配于5mmhepes、20％甘油中，最终ph为7.8。医药学上可接受的载剂的全面论述可在《雷明顿氏医药科学(remington'spharmaceuticalsciences)》(麦克出版公司(mackpublishingcompany)，新泽西州1991)中获得。在一个实施例中，以用于局部给药，包括吸入的调配物形式提供调配物。合适的可吸入制剂包括可吸入粉末、含有推进剂气体的定量喷雾剂或不含推进剂气体的可吸入溶液。根据本发明的可吸入粉末将通常含有如本文所述的病毒和生理学上可接受的赋形剂。这些可吸入粉末可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多醣(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或这些物质与彼此的混合物。宜使用单糖或二糖，如乳糖或葡萄糖，特别是但不局限于呈其水合物形式。沉积在肺中的颗粒要求要小于10微米，如1-9微米，例如0.1到5μm，尤其1到5μm。病毒携带的颗粒尺寸为首要的，并且因此，在一个实施例中，根据本发明的病毒可被吸附或吸收于颗粒，如具有给定尺寸的乳糖颗粒上。可用于制备可吸入喷雾剂的推进剂气体为所属领域中已知的。合适的推进剂气体选自烃，如正丙烷、正丁烷或异丁烷；和卤代烃，如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。可单独或以其混合物形式使用上述推进剂气体。尤其合适的推进剂气体为选自tg11、tg12、tg134a和tg227的卤化烷烃衍生物。在上述卤化烃中，tg134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和tg227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)和其混合物为尤其合适的。含推进剂气体的可吸入喷雾剂还可含有其它成分，如共溶剂、稳定剂、表面活性剂(surface-activeagent/surfactant)、抗氧化剂、润滑剂和ph调节剂。所有这些成分为所属领域中已知的。根据本发明的含推进剂气体的可吸入喷雾剂可含有高达5重量％的活性物质。根据本发明的喷雾剂含有例如0.002到5重量％、0.01到3重量％、0.015到2重量％、0.1到2重量％、0.5到2重量％或0.5到1重量％的活性成分。或者，还可例如采用装置，如喷雾器，例如与压缩器连接的喷雾器(例如与百瑞(pari)master(r)压缩器连接的百瑞lc-jetplus(r)喷雾器，其通过百瑞呼吸设备有限公司(parirespiratoryequipment,inc.)，里奇蒙(richmond)，弗吉尼亚州(va.))通过给予液体溶液或悬浮液调配物对肺进行局部给药。本发明病毒可递送分散于溶剂中，例如呈溶液或悬浮液形式，例如如上文针对肠胃外调配物所述。其可悬浮于适合的生理学溶液，例如生理盐水或其它药理学可接受的溶剂或缓冲溶液中。所属领域中已知的缓冲溶液每1ml水可含有0.05mg到0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg到9.0mgnacl、0.15mg到0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg到0.30mg无水柠檬酸和0.45mg到0.55mg柠檬酸钠以便获得约4.0到5.0的ph。治疗性悬浮液或溶液调配物还可含有一种或多种赋形剂。赋形剂为所属领域中众所周知的并且包括缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、edta、氯化钠、脂质体、甘露糖醇、山梨糖醇和甘油。溶液或悬浮液可包封于脂质体或可生物降解微球体中。调配物将通常采用无菌制造方法以大体上无菌形式提供。这可包括利用所属领域的一般技术人员熟悉的方法通过过滤用于调配物的缓冲溶剂/溶液、抗体在无菌缓冲溶剂溶液中的无菌悬浮液并且将调配物施配于无菌容器中来制造和灭菌。可例如以填充在箔包封中的单一剂量单元(例如，密封塑料容器或小瓶)形式提供根据本发明的可雾化调配物。每个小瓶含有以体积为单位，例如2ml溶剂/溶液缓冲液的单位剂量。本发明还扩展到鼻内递送的液体溶液或悬浮液，例如采用如w02009/068877和us2004/0153033中所公开的装置，所述专利以引入的方式并入本文中。治疗在另一方面中，本发明扩展到供用于治疗中，尤其供用于治疗癌症的如本文所述的病毒或其调配物。在一个实施例中，治疗方法供用于肿瘤的治疗中。如本文中所采用的肿瘤意指由不受控和进行性的过量细胞分裂造成的异常组织块，也被称为赘瘤。肿瘤可为良性(并非癌性的)或恶性。肿瘤涵盖癌症和转移瘤的全部形式。在一个实施例中，肿瘤为癌性的。在一个实施例中，肿瘤为实体肿瘤。实体肿瘤可为局部或转移性的。在一个实施例中，肿瘤具有上皮源。在一个实施例中，肿瘤为恶性肿瘤，如结肠直肠癌、肝细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌或肺癌。在一个实施例中，肿瘤为结肠直肠恶性肿瘤。如本文中所采用的恶性肿瘤是指癌细胞。在一个实施例中，在癌转移的治疗或预防中采用溶瘤腺病毒。在一个实施例中，在耐药性癌症的治疗中采用本文中的方法或调配物。在一个实施例中，与另一种癌症治疗或疗法的给予组合来给予病毒。在一个实施例中，提供一种根据本发明的病毒或调配物，其供用于制造用于治疗癌症，例如上文所述的癌症的药物。在另一方面中，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包含向有需要的患者，例如人类患者给予治疗有效量的根据本发明的病毒或调配物。在一个实施例中，本文中的溶瘤病毒或调配物与另一种疗法组合给予。如本文中所采用的“组合(incombination)”意图涵盖在癌症治疗或疗法之前、同时和/或之后给予溶瘤病毒的情况。然而，一般来说，组合治疗方案癌症疗法包括手术、放射疗法、靶向疗法和/或化学疗法。如本文中所采用的癌症治疗是指意图治疗癌症和/或维持其疗法的使用治疗性化合物或生物学试剂，例如抗体的治疗。在一个实施例中，癌症治疗选自包括化疗剂；靶向抗癌剂，如抗体药物结合物的任何其它抗癌疗法；放射疗法；放射性同位素疗法或其任何组合。在一个实施例中，本发明病毒，如溶瘤腺病毒可用作疗法，如手术的预治疗(新辅助疗法)以缩小肿瘤，治疗癌转移和/或防止癌转移或进一步癌转移。可在疗法，如手术之后使用溶瘤腺病毒(辅助疗法)以治疗癌转移和/或防止癌转移或进一步癌转移。在一个实施例中，在维持疗法中采用本发明的病毒或调配物。如本文中所采用的同时(concurrently)为在与溶瘤腺病毒调配物相同或大致相同的时间给予其它癌症治疗。治疗可含于相同调配物中或以单独调配物形式给予。在一个实施例中，与化疗剂的给予组合来给予病毒。如本文中所采用的化疗剂意指选择性地破坏恶性细胞和组织的特异性抗肿瘤化学试剂或药物。例如，烷基化剂、抗代谢物、蒽环霉素、植物碱、拓扑异构酶抑制剂和其它抗肿瘤试剂。特异性化疗剂的实例包括小红莓、5-氟尿嘧啶(5-fu)、紫杉醇、卡培他滨(capecitabine)、伊立替康(irinotecan)和铂，如顺铂和奥沙利铂(oxaliplatin)。可由医师基于待治疗的癌症的性质来选择剂量。在一个实施例中，治疗剂为更昔洛韦(ganciclovir)，其可有助于控制免疫应答和/或肿瘤血管形成。在一个实施例中，本文中的方法中所用的一种或多种疗法为有规律的，即用低剂量的抗癌药物连续或频繁治疗，通常伴随其它治疗方法给予。亚群b溶瘤腺病毒，尤其ad11和由其衍生的那些腺病毒，如enad可尤其与化疗剂协同，因为其似乎具有在很大程度上与通过主要坏死机制凋亡、杀灭癌细胞无关的作用机制。此外，在化学疗法期间进行的免疫抑制可使溶瘤病毒以较高效率发挥功能。如本文中所采用的治疗剂量是指当用于合适的治疗方案中时适于实现预期治疗效果，例如改善疾病的症状或病状，尤其不会引起剂量限制副作用的病毒，如溶瘤腺病毒的量。当病毒颗粒数量可足以引起以下时，剂量可被视为癌症或转移瘤治疗中的治疗剂量：肿瘤或转移性生长减缓或停止，或发现肿瘤或癌转移尺寸缩小，和/或患者生命期延长。合适的治疗剂量通常为治疗效果与可耐受毒性之间的平衡，例如在鉴于由疗法实现的益处，副作用和毒性可耐受的情况下。在一个实施例中，提供以单一治疗周期全身性地给予根据本发明的溶瘤腺病毒的肠胃外调配物的多个剂量，例如每次投药中给定的总剂量在每剂量1×1010到1×1014个病毒颗粒的范围内的情况下。在一个实施例中，以使得病毒颗粒递送的速率在每分钟2×1010个颗粒到每分钟2×1012个颗粒的范围内来给予病毒或包含其的组合物的一个或多个剂量(例如每一剂量)。在一个实施例中，每周给予根据本发明的病毒或治疗性构建体(包括包含所述病毒的调配物)，例如在第1周的第1天、第3天、第5天给予一次剂量，之后，接下来的每一周给予一次剂量。在一个实施例中，每两周或每三周给予根据本发明的病毒或治疗性构建体(包括包含所述病毒的调配物)，例如在第1周的第1天、第3天、第5天给予一次，并且在第2周或第3周的第1天、第3天、第5天又进行给予。这一给药方案可视需要多次重复。在一个实施例中，例如以治疗周期或维持疗法形式每月给予根据本发明的病毒或治疗性构建体(包括包含所述病毒的调配物)。在一个实施例中，通过重组技术制备本发明的病毒和构建体。技术人员应了解，提供的腺病毒基因组可通过其它技术手段来制造，包括完全合成包含全部基因组的一部分的基因组或质粒。技术人员将了解，在合成基因组的情况下，插入的区可不包含限制位点核苷酸，因为后者为基因插入之后使用克隆方法的人工制品。在一个实施例中，所提供的腺病毒基因组经完全合成制造，例如根据seqidno:109，其与seqidno:18、20、96、101、102、103中的转基因盒一起加以使用。本文中的公开内容进一步扩展到一种式(i)或其子式的腺病毒，其由或可由插入转基因或转基因盒而获得。如本文中所采用的“为(is)”意指包含。在本说明书的上下文中，“包含”可以理解为“包括”。包含某些特征/要素的本发明的实施例还意图扩展到替代实施例“由相关要素/特征组成”或“基本上由相关要素/特征组成”。在技术上适当时，可以组合本发明的实施例。如专利和申请等技术参考文献以引入的方式并入本文中。本文中特定且明确列举的任何实施例可以单独地或结合一个或多个其它实施例形成免责声明的基础。本文的题头用于将文档分段并且不意图用于解释本文中提供的公开内容的含义。在以下实例中仅借助于说明来进一步描述本发明。实例实例1：制造表达t细胞活化抗原cd80的enad病毒质粒penad2.4用于通过直接插入编码人类t细胞活化抗原cd80(seqidno:11)的盒来生成质粒png-330。png-330盒含有5'短剪接受体序列cagg、人类cd80cdna序列和3'聚腺苷酸化序列(seqidno:5)。所插入的转基因盒的示意图展示在图3a中。通过dna测序来确认质粒的构造。病毒制造和表征本文中对病毒，如ng-330-00的提及是简单地指病毒ng-330的特定批“00”。类似术语可用于其它病毒。质粒png-330通过用酶asc进行限制酶切消化来使质粒png-330线性化以产生病毒基因组ng-330(seqidno:16)。消化后的dna通过在-20℃，在300μl>95％分子生物学级乙醇和10μl3m乙酸钠中进行苯酚/氯仿提取和沉淀持续16小时而纯化。通过以14000rpm离心5分钟来粒化沉淀后的dna，并且在500μl70％乙醇中加以洗涤，之后以14000rpm再次离心5分钟。风干干净的dna沉淀，再悬浮于含有15μl脂染胺转染试剂的500μloptimem中并在室温下培育30分钟。随后将转染混合物逐滴添加到含有生长到70％融合度的293个细胞的t-25烧瓶中。在37℃，5％co2下用转染混合物培育细胞2小时之后，将4ml细胞培养基(补充有2％fbs的含有谷氨酰胺的高葡萄糖dmem)添加到细胞中并将烧瓶保温在37℃，5％co2。每24小时监测一次经转染的293个细胞并且每48-72小时用其它培养基进行补充。通过观察细胞单层中的大量致细胞病变效应(cpe)来监测病毒的制造。观察到大规模cpe后，通过三次冻融循环从293个细胞收集病毒。所收集的病毒用于再感染293个细胞以便扩增病毒原种(virusstock)。通过观察细胞单层中的大量cpe来确认扩增期间切实可行的病毒制造。观察到cpe后，通过三次冻融循环从293个细胞收集病毒。扩增的原种用于进一步扩增，之后通过双氯化铯显带纯化病毒以产生ng-330病毒原种。实例2：与癌瘤细胞株中的enad相比的ng-330病毒活性的表征在结肠癌细胞株ht-29和肺癌细胞株a549中比较ng-330或enad病毒复制(通过qpcr评定)和cd80膜表达(通过流式细胞术评定(图4和5)。ng-330为衍生自enad的病毒，其在enad晚期基因l5(纤维)之后含有编码人类t细胞活化抗原，cd80的转基因盒。所插入的盒的示意图展示在图3a中。ng-330病毒的制造详述于实例1中。将a549或ht-29癌瘤细胞株以7.5e5个细胞/孔(a549细胞)或2.e6个细胞/孔(ht-29细胞)的细胞密度接种于6孔培养盘中。以37℃，5％co2将培养盘培育18小时，之后以每个细胞100个enad或ng-330病毒颗粒(ppc)感染细胞或保持不被感染。在感染后24、48或72小时进行分析。通过qpcr评定病毒复制用100ppcenad或ng-330感染持续24、48或72小时或保持不被感染的ht-29和a549细胞株被用于通过qpcr对病毒dna进行定量。收集细胞上清液并通过以1200rpm离心5分钟来澄清。根据制造商方案，使用西格玛(sigma)genelutedna提取试剂盒从10μl清液层提取dna。亦制备使用enad病毒颗粒(2.5e10-2.5e5vp)的标准曲线并使用西格玛genelute试剂盒加以提取。通过qpcr使用enade3基因特异性引物-探针组来分析每个所提取的样品或标准物。每个细胞所检测到的病毒基因组数量的定量证实，ht-29(图4a)和a549细胞株(图4b)中ng-330和enad病毒复制相当。未感染细胞中未有病毒基因组可被检测到(数据未图示)。通过流式细胞术评定cd80细胞表面表达用100ppcenad或ng-330感染持续24、48或72小时或保持不被感染的ht-29和a549细胞株被用于分析细胞表面上的cd80转基因表达。通过用胰蛋白酶处理、离心并且随后再悬浮于1％bsa/pbs中而从培养盘表面去除肿瘤细胞。随后在5℃下用缓冲液、结合到cy5的小鼠同型对照抗体或结合到cy5的抗人类cd80抗体(克隆号2d10)培育样品1小时。还用zombieaqua对全部样品进行存活/死亡共染色以区分存活细胞。用1％bsa/pbs洗涤样品3次，之后通过流式细胞术(facs，attune)针对细胞存活率和细胞表面上的cd80蛋白质表达进行分析。分析显示，可在用ng-330处理的a549(图5a)或ht-29(图5b)细胞中的细胞表面处检测到cd80，但用enad处理或保持未被处理的那些细胞并未检测到。病毒溶瘤效力的比较以2.5e4个细胞/孔的细胞密度将ht-29结肠癌细胞接种于96孔培养盘中。以37℃，5％co2培育培养盘4小时，之后用enad或ng-330病毒颗粒以每个细胞100-0.39个颗粒(ppc)的感染密度范围来感染细胞。在感染后72小时使用celltitre96mts试剂(普洛麦格(promega)：g3581)评定ht-29细胞存活率。每个感染密度下的细胞存活％的定量证实ht29细胞中ng-330溶瘤效力与enad相当(图6)。实例3：表达t细胞活化抗原cd80和细胞因子ifnα的enad病毒的制造质粒penad2.4用于通过直接插入编码人类t细胞活化抗原cd80(seqidno11)和人类细胞因子干扰素(ifnα，seqidno:12)的盒来生成质粒png-343。png-343盒含有；5'短剪接受体序列cagg；人类ifnαcdna；高效可自剪切的p2a肽序列(seqidno:7)；人类cd80cdna序列和3'聚腺苷酸化序列(seqidno:5)。所插入的转基因盒的示意图展示在图3b中。通过dna测序来确认质粒的构造。病毒制造和表征通过用酶asci进行限制酶切消化来使质粒png-343线性化以产生病毒基因组ng-343(seqidno:17))。根据实例1中详述的方法扩增和纯化病毒ng-343。实例4：表达fms样酪氨酸激酶-3配体、趋化因子mip1α和细胞因子ifnα的胞外域的enad病毒的制造质粒penad2.4用于通过直接插入编码fms样酪氨酸激酶-3配体(flt3l，seqidno:13)、mip1α(同工型ld78p，seqidno:14)和ifnα(seqidno:12)的可溶性变异体的盒来生成质粒png-345。png-345盒含有；5'短剪接受体序列cagg；人类flt3lcdna；高效可自剪切的p2a肽序列(seqidno:7)；人类mip1αcdna；高效可自剪切的t2a肽序列(seqidno:10)；人类ifnαcdna和3'聚腺苷酸化序列(seqidno:5)。所插入的转基因盒的示意图展示在图3d中。通过dna测序来确认质粒的构造。病毒制造和表征通过用酶asci进行限制酶切消化来使质粒png-345线性化以产生病毒基因组ng-345(seqidno:18))。根据实例1中详述的方法扩增和纯化病毒ng-345。实例5：表达t细胞活化抗原cd80、mip1α和flt3配体的enad病毒的制造质粒penad2.4用于通过直接插入编码人类t细胞活化抗原cd80(seqidno11)、人类巨噬细胞炎性蛋白质1α(mip1α，seqidno.14)和人类flt3配体(seqidno:13)的盒来生成质粒png-346。png-346盒含有；5'短剪接受体序列cagg；人类ifnαcdna；高效可自剪切的p2a肽序列(seqidno:7)；人类mip1αcdna(同工型ld78p)；高效可自剪切的t2a肽序列(seqidno:10)；人类flt3配体cdna序列和3'聚腺苷酸化序列(seqidno:5)。所插入的转基因盒的示意图展示在图3e中。通过dna测序来确认质粒的构造。病毒制造和表征通过用酶asci进行限制酶切消化来使质粒png-346线性化以产生病毒基因组ng-346(seqidno:19)。根据实例1中详述的方法扩增和纯化病毒ng-346实例6：表达t细胞活化抗原cd80、趋化因子mip1α和细胞因子ifnα的enad病毒的制造质粒penad2.4用于通过直接插入编码人类t细胞活化抗原cd80(seqidno:11)、人类巨噬细胞炎性蛋白质1α(mip1α，seqidno.14)和人类细胞因子干扰素α(ifnα，seqidno:12)的盒来生成质粒png-347。png-347盒含有；5'短剪接受体序列cagg；人类ifnαcdna；高效可自剪切的p2a肽序列(seqidno:7)；人类mip1αcdna(同工型ld78p)；高效可自剪切的t2a肽序列(seqidno:10)；人类cd80cdna序列和3'聚腺苷酸化序列(seqidno:5)。所插入的转基因盒的示意图展示在图3f中。通过dna测序来确认质粒的构造。病毒制造和表征通过用酶asci进行限制酶切消化来使质粒png-347线性化以产生病毒基因组ng-347(seqidno:20)。根据实例1中详述的方法扩增和纯化病毒ng-347。实例7：表达t细胞活化抗原cd80和人类cd3复合体的ε链(cd3ε)的膜锚定的单链fv片段抗体的enad病毒的制造质粒penad2.4用于通过直接插入编码人类t细胞活化抗原cd80(seqidno:11)和单链fv抗人类cd3e的膜锚定的嵌合形式(seqidno:15)的盒来生成质粒png-348。png-348盒含有；5'短剪接受体序列cagg；膜锚定的抗人类cd3escfvcdna；高效可自剪切的p2a肽序列(seqidno:7)；人类cd80cdna序列和3'聚腺苷酸化序列(seqidno:5)。所插入的转基因盒的示意图展示在图3c中。通过dna测序来确认质粒的构造。病毒制造和表征通过用酶asci进行限制酶切消化来使质粒png-348线性化以产生病毒基因组ng-348(seqidno:96)。根据实例1中详述的方法扩增和纯化病毒ng-348。实例8：表达两种转基因；t细胞活化抗原cd80和细胞因子ifnα的enad病毒，ng-343的活性癌瘤细胞株中与enad相比的ng-343病毒活性的表征在结肠癌细胞株ht-29或肺癌细胞株a549中比较ng-343或enad病毒复制(通过qpcr评定)、cd80转基因表达(通过流式细胞术评定)或ifnα转基因表达(通过elisa评定)。ng-343为衍生自enad的病毒，所述enad含有编码人类t细胞活化抗原cd80以及位于enad晚期基因l5(纤维)之后的人类细胞因子干扰素α2b的转基因盒。所插入的盒的示意图展示在图3b中。ng-343病毒的制造详述于实例3中。将a549或ht-29癌瘤细胞株以7.5×105个细胞/孔(a549细胞)或1.4×106个细胞/孔(ht-29细胞)的细胞密度接种于12孔培养盘中。以37℃，5％co2将培养盘培育18小时，之后用enad或ng-343以每个细胞100个病毒颗粒(ppc)感染细胞或保持不被感染。在感染后24、48或72小时进行分析。通过qpcr评定病毒复制用100ppcenad或ng-343感染24、48或72小时或未被感染的ht-29细胞用于通过qpcr对病毒dna进行定量。收集细胞上清液并通过以1200rpm离心5分钟来澄清。根据制造商方案，使用西格玛genelutedna提取试剂盒从10μl上清液提取dna。还制备使用enad病毒颗粒(2.5×1010到2.5×105vp)的标准曲线并使用西格玛genelute试剂盒加以提取。通过qpcr使用enade3基因特异性引物-探针组来分析每个所提取的样品或标准物。每个细胞所检测到的病毒基因组数量的定量证实在所分析的全部时间点，ng-343和enad病毒复制相当(图7a)。未感染细胞中未有病毒基因组可被检测到(数据未图示)。通过elisa分析ifnα表达通过elisa分析用10ppcenad或ng-343感染24、48或72小时或未被感染的ht-29或a549细胞株的上清液以表达经分泌的ifnα。从每个孔去除培养物上清液并以1200rpm离心5分钟以去除细胞碎片。将上清液稀释于5％bsa/pbs分析缓冲液(1:2或1:50或1:100)中，并且根据制造商方案使用verikine人类ifnα试剂盒(pblassayscience)进行elisa。通过根据标准曲线插值来测定经分泌的ifnα的浓度。在ht-29和a549细胞株中检测感染过程中细胞上清液中增加的ifnα表达(图7b)通过流式细胞术评定cd80细胞表面表达用10ppcenad或ng-343感染48或72小时或未被感染的a549细胞株用于分析cd80转基因在细胞表面上的表达。在感染后合适的时间点，通过用胰蛋白酶处理，离心并且随后再悬浮于1％bsa/pbs中来从培养盘表面去除a549细胞。随后在5℃下用缓冲液、结合到cy5的小鼠同型对照抗体或结合到cy5的抗人类cd80抗体(克隆号2d10)培育样品1小时。还用zombieaqua对全部样品进行存活/死亡共染色以区分存活细胞。用1％bsa/pbs洗涤样品3次，之后通过流式细胞术(facs，attune)针对细胞存活率和细胞表面上的cd80蛋白质表达进行分析。cd80表达分析与存活/死亡染色显示，在感染后48和72小时，可在经ng-343处理的细胞而非enad或未感染对照(uic)细胞的细胞表面处检测到cd80(图8)。病毒处理后72小时时的细胞存活率不足以进行全面的cd80表达分析，然而在这一时间点在用ng-343处理的存活和死亡细胞上可检测到高水平的cd80(图8d，下图)。随后在感染后48小时用100ppc在ht-29和a549细胞中比较cd80蛋白质表达。如上所述收集和染色样品，之后分析细胞存活率和细胞表面上的cd80蛋白质表达。在这一时间点，仅经染色为存活细胞的细胞上的cd80表达的分析显示可在～91％的经ng-343处理的ht-29细胞和～98％的经ng-343处理的a549细胞的表面上而非在经enad处理的对照物上检测到cd80。实例9：癌瘤、间质成纤维细胞和上皮细胞株中的ng-343病毒活性和转基因表达的选择性。为了显示编码于ng-343病毒中的ifnα和cd80转基因仅选择性地表达于容许ng-343或enad感染的细胞中，在已知的容许感染enad的癌细胞(ht-29)、先前表征为不容许的成纤维细胞株(wi-38和mrc-5)和仅显示有限容许enad感染的支气管上皮细胞株(be)中测量病毒复制(通过qpcr评定)、ifnα表达(通过elisa评定)和cd80表达(通过流式细胞术评定)。简言之，将细胞接种于12孔培养盘中并且在接种后18小时用100ppcng-343或enad病毒(针对wi38、mrc5或be细胞)或10ppcng-343或enad病毒(针对ht-29细胞)感染。将细胞与病毒颗粒一起培育4小时，之后从细胞去除感染培养基并用新制培养基替代。在4小时感染时间段后1小时或72小时，收集细胞上清液用于qpcr或elisa分析，并且用胰蛋白酶处理细胞以从培养盘去除所述细胞用于通过流式细胞术加以分析。ng-343和enad选择性病毒复制针对qpcr，收集细胞上清液并通过以1200rpm离心5分钟来澄清。根据制造商方案，使用西格玛genelutedna提取试剂盒从10μl上清液提取dna。还制备使用enad病毒颗粒(2.5×l010到2.5×105vp)的标准曲线并使用西格玛genelute试剂盒加以提取。通过qpcr使用enade3基因特异性引物-探针组来分析每个所提取的样品或标准物。每个细胞所检测到的病毒基因组数量的定量证实，ng-343和enad病毒复制在所分析的全部细胞株中相当(图9a)。ng-343选择性转基因表达对于ifnα表达的检测，收集细胞上清液并以1200rpm通过离心5分钟来澄清。将上清液稀释于5％bsa/pbs分析缓冲液(1:2或1:50或1:100)中，并且根据制造商方案使用verikine人类ifnα试剂盒(pblassayscience)进行elisa。通过根据标准曲线插值来测定经分泌的ifnα的浓度。ifnα表达可仅在经ng-343感染的ht-29细胞的上清液中被检测到并且不可在成纤维细胞株或支气管上皮细胞株中的任一个中被检测到(小于定量的下限值[<lloq])(图9b)。对于cd80细胞表面表达，随后在5℃下用缓冲液、结合到cy5的小鼠同型对照抗体或结合到cy5的抗人类cd80抗体(克隆号2d10)培育细胞1小时。还用zombieaqua对全部样品进行存活/死亡共染色以区分存活细胞。用1％bsa/pbs洗涤样品3次，之后通过流式细胞术(facs，attune)针对细胞存活率和细胞表面上的cd80蛋白质表达进行分析。根据ifnα表达数据，cd80表达可仅在ht-29细胞上被检测到，而在成纤维细胞或支气管上皮细胞株上未可检测到表达(图9c)。这些数据综合起来证实，ifnα和cd80转基因选择性地表达于容许感染enad病毒的细胞，即癌瘤细胞中，并且当与亲本enad病毒相比时，转基因的编码不会改变ng-343病毒的选择性。实例10：免疫细胞活化上ng-343转基因表达的活性为了测定与不处理或enad处理相比，使用ng-343病毒处理肿瘤细胞是否可引起先天性免疫细胞应答增强，将刚分离的外周血单核细胞(pbmc)与经ng-343或enad感染或未被感染的肿瘤细胞共培养。通过先天性免疫细胞群的流式细胞术分析或共培养物上清液的elisa分析来评定免疫细胞活化。简言之，以4×l05个细胞/孔的密度将a549肺癌细胞接种于12孔培养盘中。20小时之后，用10ppc的enad或ng-343病毒感染细胞或保持不被感染，并且随后以37度，5％co2培育24小时。随后将通过密度梯度离心从健康人类供体中分离的pbmc以5个pbmc对1个a549细胞的比率添加到a549培养孔中。添加pbmc后48小时，从培养盘收集共培养物上清液。为了分析此时的树突状细胞活化，在5℃下用缓冲液、结合到alexafluor488、pe、percp/cy5.5、bv605或bv412的小鼠同型对照抗体、结合到alexafluor488的抗cd14抗体、结合到pe的抗cd80抗体、结合到percp.cy5.5的抗hla-dr、结合到bv605的抗cd3或结合到bv421的抗pd-l1抗体培育细胞1小时。还用zombieaqua对全部样品进行存活/死亡共染色以区分存活细胞。用1％bsa/pbs洗涤样品3次，之后通过流式细胞术(facs，attune)加以分析。将cd14和cd3染色阴性但hla-dr染色阳性的可存活细胞被界定为树突状细胞群。在这一群上比较dc活化标记物、cd80和pd-l1的表达(图10)。这些分析显示，当与经enad感染或未感染的肿瘤细胞培养物相比时，经ng-343感染的肿瘤细胞可诱使dc表面上的cd80和pd-l1的表面水平增加。实例11：表达三种转基因；t细胞活化抗原cd80、趋化因子mip1α和细胞因子ifnα的enad病毒，ng-347的活性癌瘤细胞株中与enad相比的ng-347病毒活性的表征在经ng-347和enad处理的结肠癌细胞株、ht-29或肺癌细胞株，a549中比较cd80转基因表达(通过流式细胞术评定)和ifnα或mip1α(ccl3)转基因表达(通过elisa评定)。ng-347为衍生自enad的病毒，所述enad含有编码人类t细胞活化抗原cd80、人类细胞因子干扰素α2b和人类趋化因子mip1α(ld78p同工型)的转基因盒。转基因表达处于病毒内生性主要晚期启动子的控制下。所插入的盒的示意图展示在图3f中。ng-347病毒的制造详述于实例6中。将a549或ht-29癌瘤细胞株以7.5×105个细胞/孔(a549细胞)或1.4×106个细胞/孔(ht-29细胞)的细胞密度接种于12孔培养盘中。以37℃，5％co2将培养盘培育18小时，之后用每个细胞100个enad或ng-347病毒颗粒(ppc)感染细胞或保持不被感染。在感染后24、48或72小时进行分析。通过elisa分析ifnα或mip1α表达通过elisa分析用100ppcenad或ng-347感染24、48或72小时或未被感染的ht-29或a549细胞株的上清液以表达经分泌的ifnα或经分泌的mip1α。根据实例9中详述的方法制备培养物上清液。使用verikine人类ifnα试剂盒(pblassayscience)进行ifnαelisa并且使用人类ccl3quantikineelisa试剂盒(r&dsystems)进行mip1αelisa。根据制造商方案进行分析。通过根据标准曲线插值来测定经分泌的ifnα或mipα的浓度。感染过程中ifnα和mip1α表达在细胞上清液中增加并且针对ht-29和a549细胞株加以检测(图11a和图11b)。通过流式细胞术分析cd80表达在感染后48小时比较ht-29和a549细胞表面上的cd80蛋白质表达。根据实例9中详述的方法收集和染色细胞。针对细胞存活率和细胞表面上的cd80蛋白质表达通过流式细胞术来分析细胞。在这一时间点上存活细胞上cd80表达的分析显示可在～96％的经ng-347处理的ht-29细胞和～99％的经ng-347处理的a549细胞的表面上检测到cd80，但未在经enad处理的对照物上检测到染色(图11c)。实例12：表达三种转基因；细胞因子flt3配体、趋化因子mip1α和细胞因子ifnα的enad病毒，ng-345的活性癌瘤细胞株中与enad相比的ng-345病毒活性的表征在经ng-345和enad处理的结肠癌细胞株、ht-29或肺癌细胞株a549中比较flt3配体、ifnα和mip1α转基因表达(通过elisa评定)。ng-345为衍生自enad的病毒，所述enad含有编码人类flt-3配体的可溶性变异体、人类细胞因子干扰素α2b和人类趋化因子mip1α(ld78β同工型)的转基因盒。转基因表达处于病毒内生性主要晚期启动子的控制下。所插入的盒的示意图展示在图3d中。ng-345病毒的制造详述于实例4中。将a549或ht-29癌瘤细胞株以7.5×105个细胞/孔(a549细胞)或1.4×106个细胞/孔(ht-29细胞)的细胞密度接种于12孔培养盘中。以37℃，5％co2将培养盘培育18小时，之后用每个细胞100个enad或ng-345病毒颗粒(ppc)感染细胞或保持不被感染。在感染后24、48或72小时进行分析。通过elisa分析flt-3配体、ifnα或mip1α表达通过elisa分析用100ppcenad或ng-345感染24、48或72小时或未被感染的ht-29或a549细胞株的上清液以表达经分泌的flt3-配体、经分泌的ifnα或经分泌的mip1α。根据实例9中详述的方法制备培养物上清液。使用verikine人类ifnα试剂盒(pblassayscience)进行ifnαelisa，使用人类ccl3quantikineelisa试剂盒(r&dsystems)进行mip1αelisa，并且使用flt3l人类elisa试剂盒(艾宾(abeam))进行flt3lelisa。根据制造商方案进行全部分析。通过根据标准曲线插值来测定经分泌的ifnα、mipα或flt3l的浓度。感染过程中ifnα、mip1α和flt3l表达在细胞上清液中增加并且在ht-29和a549细胞株中加以检测(图12a-c)。实例13.ng-347和ng-348病毒在结肠癌细胞中的溶瘤活性和感染性病毒溶瘤效力以2.5e4个细胞/孔的细胞密度将ht-29结肠癌细胞接种于96孔培养盘中。以37℃，5％co2培育培养盘4小时，之后用enad、ng-347或ng-348病毒颗粒以每个细胞100-0.39个颗粒(ppc)的感染密度范围来感染细胞。在感染后72小时使用celltitre96mts试剂(普洛麦格(promega)：g3581)评定ht-29细胞存活率。每个感染密度下的细胞存活％的定量证实，ng-347和ng-348溶瘤效力与enad相当(图13a和13b)。病毒颗粒感染性以4e5个细胞/孔的细胞密度将ht-29结肠癌细胞接种于12孔培养盘中。以37℃，5％co2培育培养盘24小时，之后用enad、ng-347或ng-348病毒颗粒以1.6e7-2e6vp/ml的感染密度范围感染细胞。通过病毒蛋白质六邻体的抗体染色来检测ht-29细胞的感染。针对所测试的每个稀释液的6个复制孔通过人工计算每孔6个视野对染色细胞进行定量。根据病毒滴度针对每种病毒计算颗粒与感染性比率(p:i)并且证实ng-347和ng-348具有与enad参考对照物类似的感染性比率(图13c)。实例14.经ng-347和ng-348感染的癌瘤细胞株中的t细胞活化抗原cd80的细胞表面表达在经ng-347、ng-348和enad处理的结肠癌细胞株、dld-1或肺癌细胞株a549中比较cd80转基因表达(通过流式细胞术评定)。以7.5e5个细胞/孔的细胞密度将a549或dld-1癌瘤细胞株接种于12孔培养盘中。以37℃，5％co2将培养盘培育18小时，之后以每个细胞10个enad、ng-348或ng-347病毒颗粒(ppc)感染细胞或保持不被感染。在感染后24、48、72或96小时在a549或dld-1细胞的表面上比较cd80蛋白质表达。在每一时间点根据实例9中详述的方法收集和染色细胞。针对细胞存活率和细胞表面处的cd80蛋白质表达通过流式细胞术来分析细胞。感染后72小时a549细胞中的cd80表达的分析显示可在>95％的经ng-347或ng-348处理的细胞的表面上检测到cd80(图14a和14b)。在感染后96小时，病毒处理已裂解大多数a549细胞，因此不进行facs分析。对于dld-1细胞，到用ng-348处理后96小时，可在>50％的细胞上检测到表达，并且在ng-347处理之后在>70％的细胞上检测到表达(图15a和15b)。在enad或未处理对照物上未检测到染色。实例15.通过经ng-348感染的癌瘤细胞株介导的t细胞活化和脱粒与从人类pbmc供者中分离的t细胞共培养经ng-348或enad病毒颗粒感染或未被感染的a549肺癌细胞。在a549和t细胞的表面上通过流式细胞术评定经ng-348病毒编码的cd80的表达的选择性。通过分析细胞表面活化标记物(通过流式细胞术)、作为脱粒标记物的cd107a细胞表面表达(通过流式细胞术)和刺激细胞因子、il-2和ifnγ的分泌(通过elisa)评定t细胞活化。以5e5个细胞/孔的密度将a549细胞接种于12孔培养盘中。以37℃，5％co2将培养盘培育18小时，之后用每个细胞10个enad或ng-348病毒颗粒(ppc)感染细胞或保持不被感染。在感染后48小时，以8个t细胞:1个肿瘤细胞的比率将通过由pbmc(mac)进行阴性选择而分离的cd3+t细胞添加到a549细胞单层中。进行共培养16小时，在这一时间点之后，收集细胞上清液用于elisa分析并且收集肿瘤细胞和t细胞用于流式细胞术分析。从共培养孔去除含有非粘附细胞的培养基并离心(300×g)。小心地移除上清液，用pbs5％bsa以1:2稀释并储存用于elisa分析。用pbs洗涤粘附细胞单层一次并且随后使用胰蛋白酶分离。使用完整培养基灭活胰蛋白酶并且将细胞添加到已从培养物上清液收集的细胞颗粒中。离心(300×g)细胞，丢弃上清液并在200μl的pbs中洗涤细胞颗粒。再次离心细胞，随后在室温下再悬浮于含有存活/死亡aqua(lifetech)的50μl的facs缓冲液(5％bsapbs)中持续15分钟。在facs缓冲液中洗涤细胞一次，之后用以下经直接结合的抗体组染色：结合到bv605的抗cd3；结合到bv421的抗cd25；结合到fitc的抗cd107a；结合到pe的抗epcam或结合到pe的抗cd4；和结合到pe/cy5的抗cd80或结合到pe/cy5的抗hla-dr。亦用相关同型对照抗体染色来自每个共培养条件的细胞样品。以4℃在facs缓冲液中以50微升/孔的总量进行全部染色持续15分钟。随后用facs缓冲液(200μl)洗涤细胞，之后再悬浮于200μl的facs缓冲液中并通过流式细胞术(attune)来分析。cd80的选择性表达与实例14中所示的结果相似，可在>80％的经ng-348感染的epcam+a549细胞的表面处而非经enad感染或未感染的对照细胞检测到cd80表达(图16)。相比而言，cd3+t细胞显示未可在细胞表面处检测到cd80的表达，其表明至少在这些实验条件下，转基因表达对于共培养物中的肿瘤细胞具有选择性。t细胞活化标记物的上调通过存活的cd3+单一细胞上t细胞活化标记物cd25和hla-dr的表达来评定t细胞活化的流式细胞术分析。这些数据显示，用经ng-348感染的a549细胞培养的t细胞的表达cd25的t细胞的数量(图17a和17b)和t细胞表面上的cd25表达的平均水平(图17c)显著高于enad或未感染对照物。具体来说，当比较未处理对照物与enad(分别为26.9％±3.4％和25.3±3.5％的表达cd25的t细胞)时，不存在t细胞活化状态有所差异，而cd25在与ng-348共培养的大多数细胞(83.2±1.5％)上上调。还在cd4和cd8t细胞亚群上通过基于其cd4的表达圈选cd3+t细胞来分析cd25表达。这些分析显示，与enad和未感染的对照物相比，cd25表达在经ng-348处理的共培养物中的cd4+和cd4-t细胞亚群上显著上调(图18)。对于所测试的全部条件来说，与cd25相比，表达hla-dr的细胞数量较低(<5％)(图19a)。这可能归因于共培养之后的较早时间点，在所述时间点下进行流式细胞术分析。然而，与对照物相比，在来自经ng-348处理的共培养物的hla-dr染色cd3+hla-dr+细胞的平均荧光强度方面存在细微但显著增加(图19b)。t细胞脱粒的刺激存活的cd3+t细胞的表面上的cd107a表达的分析显示，与enad(0.6％±0.2％的细胞)或未处理对照物(0.1％±0.02％的细胞)相比，当用ng-348感染a549细胞(8.3％±1.7％的细胞)时，已脱粒并因此用cd107a染色的t细胞数量显著增加(图20)。与cd25上调相似，cd4+和cd4-t细胞亚群显示，与enad或a549对照物相比，cd107a表达显著增加(图21)。刺激细胞因子il-2和ifnγ的分泌对于il-2或ifnγ表达的检测来说，将共培养物上清液稀释于5％bsa/pbs分析缓冲液(在1:100到1:1000范围内)中并且根据制造商方案使用人类il-2readysetgo试剂盒(昂飞(affymetrix))或人类ifnγreadysetgo试剂盒(昂飞)进行elisa。通过根据标准曲线插值来测定经分泌的il-2或ifnγ的浓度。可仅在使用经ng-348感染的a549细胞的共培养物的上清液中检测到il-2的表达并且未可在enad或未处理的对照物中检测到il-2的表达(图22a)。还可以极高水平(>300ng/ml)在来自经ng-348感染的a549细胞的共培养物的上清液检测到ifnγ的表达，其显著高于enad或未处理对照物(图22b)。实例16.cd4和cd8t细胞的t细胞活化可独立地通经ng-348感染的癌瘤细胞株介导用从人类pbmc供者中分离的cd4+t细胞或cd8+t细胞共培养经ng-348或enad病毒颗粒感染或未被感染的a549肺癌细胞。通过将刺激细胞因子ifnγ分泌于培养物上清液中来评定t细胞活化。根据实例14中详述的方法接种a549细胞并经ng-348或enad病毒颗粒感染或不被感染。在感染后48小时，以8个t细胞比1个肿瘤细胞的比率将通过由pbmc供体阴性选择而分离的cd4+t细胞或cd8+t细胞添加到a549细胞单层中。根据实例14中详述的方法收集16小时之后的共培养上清液并针对ifnγ进行评定。对于cd4+t细胞，仅在来自经ng-348感染的a549细胞的共培养物上清液中检测到ifnγ的表达，并且未可在enad或未处理对照物中检测到ifnγ的表达(图23a)。对于cd8+t细胞，经ng-348感染的a549细胞检测到比enad或未处理对照物水平显著较高的ifnγ的表达(图23b)，其证实通过肿瘤细胞株中的ng-348病毒活性，cd8和cd4细胞可经活化以分泌ifnγ。实例17.通过经ng-347感染的癌瘤细胞株介导的t细胞活化与从人类pbmc供者中分离的t细胞共培养经ng-347或enad病毒颗粒感染或未被感染的a549肺癌细胞。通过分析细胞表面活化标记物(通过流式细胞术)和刺激细胞因子的分泌、ifnγ(通过细胞上清液的elisa分析)来评定t细胞活化。以5e5个细胞/孔的密度将a549细胞接种于12孔培养盘中。以37℃，5％co2将培养盘培育18小时，之后用每个细胞10个enad或ng-347病毒颗粒(ppc)感染细胞或保持不被感染。在感染后24小时，以5个t细胞:1个肿瘤细胞的比率将通过由pbmc(mac)进行阴性选择而分离的cd3+t细胞添加到a549细胞单层中。进行共培养48小时，之后收集细胞上清液用于elisa分析，并且根据eg15中详述的方法收集肿瘤细胞和t细胞用于流式细胞术分析。用以下直接结合的抗体染色所收集的细胞：结合到bv605的抗cd3和结合到bv421的抗cd69。亦用相关同型对照抗体染色来自每个共培养条件的细胞样品。以4℃在facs缓冲液中以50微升/孔的总量进行全部染色持续15分钟。随后用facs缓冲液(200μl)洗涤细胞，之后再悬浮于200μl的facs缓冲液中并通过流式细胞术(attune)来分析。t细胞活化标记物cd69的上调通过存活的cd3+单一细胞上t细胞活化标记物cd69的表达来评定t细胞活化的流式细胞术分析。这些数据显示，相较于enad或未感染对照物，用经ng-347感染的a549细胞培养的t细胞的表达cd69的t细胞数量显著较高(图24)。刺激细胞因子ifnγ的分泌针对il-2或ifnγ表达的检测，将共培养物上清液稀释于5％bsa/pbs分析缓冲液(在1:100到1:1000范围内)中，并且根据制造商方案使用人类ifnγreadysetgo试剂盒(昂飞)进行elisa。通过根据标准曲线插值来测定经分泌的ifnγ的浓度。可仅在使用经ng-347感染的a549细胞的共培养物的上清液中检测到ifnγ的表达并且未可在enad或未处理的对照物中检测到ifnγ的表达(图25)。实例18：表达t细胞活化抗原cd80和人类cd3复合体的ε链(cd3ε)的膜锚定的单链fv片段抗体的enad病毒的制造质粒penad2.4用于通过直接插入编码人类t细胞活化抗原cd80(seqidno11)和具有c端v5标签的单链fv抗人类cd3e的膜锚定的嵌合形式(seqidno:99)的盒来生成质粒png-348a。png-348盒含有；5'短剪接受体序列(seqidno.2)、膜锚定的抗人类cd3escfvcdna；c端v5标签(seqidno:100)；高效可自剪切的p2a肽序列(seqidno:7)；人类cd80cdna序列和3'聚腺苷酸化序列(seqidno:5)。ng-348a转基因盒的示意图展示在图26a中。通过dna测序来确认质粒的构造。病毒制造和表征通过用酶asci进行限制酶切消化来使质粒png-348a线性化以产生病毒基因组ng-348a(seqidno:101)。根据实例1中详述的方法扩增和纯化病毒ng-348a。实例19：人类cd3复合体的ε链(cd3ε)的膜锚定的单链fv片段抗体的enad病毒的制造质粒penad2.4用于通过直接插入编码具有c端v5标签的单链fv抗人类cd3e的膜锚定的嵌合形式(seqidno:99)或无v5标签的抗人类cd3e的膜锚定的嵌合形式(seqidno:15)的盒来生成质粒png-420和png-420a。png-420盒含有；5'短剪接受体序列cagg；膜锚定的抗人类cd3escfvcdna和3'聚腺苷酸化序列(seqidno:5)。png-420a盒含有；5'短剪接受体序列cagg；膜锚定的抗人类cd3escfvcdna；c端v5标签(seqidno:100)和3'聚腺苷酸化序列(seqidno:5)。ng-420和ng-420a转基因盒的示意图展示在图26b和26c中。通过dna测序来确认每一质粒的构造。病毒制造和表征通过用酶asci进行限制酶切消化来使质粒png-420和png-420a线性化以产生病毒基因组ng-420(seqidno:102)和ng-420a(seqidno:103)。根据实例1中详述的方法扩增和纯化病毒ng-420和ng-420a。实例20用enad、ng-347或ng-348病毒(以10ppc)培养a549人类肺癌细胞和mrc5人类成纤维细胞以通过这些细胞类型来比较病毒基因组复制、病毒六邻体和转基因表达。在72小时培养之后，对细胞进行染色以用于表面标记物或上清液和细胞裂解物的facs分析，所述表面标记物或上清液和细胞裂解物制备用于六邻体的病毒基因组复制(qpcr)或mrna(rt-qpcr)分析或转基因表达。针对带有ng-347和ng-348病毒的两种转基因的病毒基因组复制和六邻体mrna表达与针对亲本病毒enad的那些等效(图27)。对于ng-348(图28)，伴随a549肿瘤细胞，cd80和抗人类cd3-scfv转基因mrna表达水平较高，仅非肿瘤mrc5细胞的信号的水平较低。通过facs评定的细胞表面上的cd80蛋白质表达在大多数经ng-348处理的a549细胞上被检测到，但未可在mrc5细胞上被检测到，同时未有cd80在未处理或经enad处理的细胞类型上被检测到。类似地，ng-347处理之后的cd80转基因mrna和蛋白质表达在a549肿瘤细胞而非mrc5细胞中被选择性地检测出(图29)。对于经enad和ng-347处理的细胞培养物，分别通过rt-qpcr和特定elisa来测量细胞裂解物中mip1α和ifnαmrna和上清液中的分泌蛋白的水平。数据(图30)显示利用a549肿瘤细胞的转基因的选择性表达，其中未可在mrc5上清液中检测到mip1α趋化因子或ifnα细胞因子。实例21通过用500ppc或5000ppc的每种病毒来培养分离的cd3+t细胞3天来评估伴随人类t细胞的enad、ng-347和ng-348病毒的选择性/活性。通过a)用靶向cd69、cd4、cd80、cd25和cd3的抗体染色的t细胞的流式细胞术分析，b)人类mip1α、ifnα和ifnγ蛋白质分泌的elisa分析，c)病毒复制的qpcr分析和d)基因表达的rt-qpcr分析来评定选择性/活性。如图31中所示，仅伴随病毒六邻体rt-qpcr分析中的背景信号，t细胞未支持所测试病毒中的任一种的病毒基因组复制。a549肿瘤细胞被负载高水平的六邻体mrna表达。利用t细胞的用于转基因mrna表达的rt-qpcr分析显示利用ng-347和ng-348的cd80的唯一背景信号(<1个拷贝数/细胞)，并且利用ng-348的抗cd3-scfvmrna的显著表达显示相似缺乏，不管高病毒暴露量(5000ppc)如何。用经处理(10ppc)的a549肿瘤细胞检测两种转基因的高表达水平(图32和33)。还通过经ng-347(而非enad)处理的a549肿瘤细胞(以10ppc)而不是通过用5000ppc处理的t细胞来选择性地检测ifnα和mip1α转基因mrna的表达(图34)。另外，对于ng-347和ng-348，仅可用a549细胞而非t细胞检测cd80细胞表面蛋白质表达(图32和33)。enad处理未通过任一细胞类型引起cd80表达，并且a549细胞死亡(如通过染料吸收评定)对于全部三种病毒为同样高的；通过全部病毒诱导低水平的非特异性t细胞死亡，其归因于实验中所用的极高水平的病毒颗粒(图32和33)。当以500ppc使用病毒时，获得相似的转基因mrna和蛋白质表达数据(数据未图示)。在不存在肿瘤细胞下，当用所述病毒中的任一种(表5)培养时，纯化的人类t细胞未活化以上调活化标记物cd25或cd69。表5.用5000ppc的不同病毒处理的纯化的人类cd3+t细胞所引起的活化标记物cd25和cd69的表达的缺乏实例22使用未分离的人类pbmc而非纯化t细胞进行实例21中所述的相似病毒选择性实验，包括进行相同活性评定。如同实例21中的人类t细胞，来自这一研究的数据共同证实利用人类pbmc缺乏病毒复制和转基因表达。图35-37展示使用5000ppc的enad、ng-347或ng-348的数据，但使用500ppc会产生相似数据(未图示)。图35显示病毒基因组复制和六邻体mrna表达，并且图36和37显示转基因mrna表达。伴随加入到培养基中的相应病毒根据分析中所产生的信号设定分析背景并且随后以相同方式根据细胞裂解物样品进行处理。在具有所述病毒中的任一种的这些pbmc培养物中的cd3+t细胞或cd40+细胞(主要b细胞)上不存在可检测到的cd80转基因的表达(未图示)。pbmc培养物中的先天性免疫细胞(单核细胞，dc)的经ng-347和ng-348病毒颗粒介导的活化与enad的活化相似，如针对下调cd14表达和上调hla-dr和内生性细胞表面cd80的，以及mip1α和ifnα的分泌的图38和39中所示(应注意，不管编码其基因组中的这些分子的ng-347如何，在未编码转基因的enad和ng-348的那些中，不存在制造水平增加)。实例23本实例在设计方面与实例15-17、21和22中的实验相似，但在这些研究中，用经病毒预处理(48小时)的a549肿瘤细胞或mrc5成纤维细胞共培养人类pbmc或纯化t细胞。用10ppc的enad、ng-347、ng-348处理或不处理(utc)a549或mrc5细胞并培养48小时以使得可有足够的时间用于病毒复制和任何转基因表达。随后将pbmc或t细胞添加到培养物中并静置24或48小时以评估经病毒处理的细胞活化t细胞的能力。图40显示病毒基因组复制数据，其显示具有两种细胞类型的pbmc或t细胞共培养物中的三种病毒复制类似，针对a549肿瘤细胞，复制水平高，并且针对mrc5成纤维细胞，复制水平低。与enad相比，如通过上调cd25表面表达和cd8效应t细胞脱粒所测量，如通过上调细胞表面上的cd107a所测量的t细胞活化，和通过胞内细胞因子染色测量的ifnγ制造全部通过经ng-348处理的a549细胞选择性地刺激，其中无经mrc共培养物介导的刺激(表6)。表6.具有病毒的t细胞和pbmc共培养物中人类cd3+t细胞的活化的流式细胞术分析细胞处理％cd25+％cd8+cd107a+％ifnγ+a549+t细胞未处理37.50.10.1a549+t细胞enad38.40.10.2a549+t细胞ng-34888.217.912.0mrc5+t细胞未处理38.80.30.4mrc5+t细胞enad38.90.20.4mrc5+t细胞ng-34839.10.30.3a549+pbmc未处理28.3ndnda549+pbmcenad29.4ndnda549+pbmcng-34873.7ndndmrc5+pbmc未处理23.0ndndmrc5+pbmcenad23.3ndndmrc5+pbmcng-34821.7ndndnd＝未测定还通过elisa来定量共培养物上清液中的ifnγ分泌数据(图41)同样证实，与经ng-348处理的a549肿瘤细胞而非mrc5成纤维细胞共培养的t细胞的选择性活化，其中分析中使用纯化的t细胞或pbmc。ng-347活化t细胞的能力还通过测量来自纯化t细胞或pbmc与a549肿瘤细胞或mrc5成纤维细胞的共培养物的t细胞上的cd69水平来评定。如表z中所示，与enad相比，伴随a549肿瘤细胞的ng-347处理发现cd69阳性t细胞中出现少量增强，其自身引起这一早期活化标记物上调。这些影响未见于mrc5共培养物中。未在t细胞上检测到cd80表达(未图示)。表7.来自经ng-347或enad处理的共培养物的t细胞上的cd69表达细胞处理％cd69+a549+t细胞未处理2.1a549+t细胞enad18.7a549+t细胞ng-34835.0mrc5+t细胞未处理3.8mrc5+t细胞enad3.6mrc5+t细胞ng-3484.4a549+pbmcs未处理1.2a549+pbmcsenad19.1a549+pbmcsng-34828.7mrc5+pbmcs未处理2.6mrc5+pbmcsenad2.7mrc5+pbmcsng-3483.9在单独实验中，经ng-347处理并且与人类cd3+t细胞共培养的a549细胞引起t细胞上的cd69活化标记物上调和ifnγ分泌(参见图24和25)。实例24通过经抗体涂布的磁珠分离从pbmc中分离cd14+单核细胞性细胞并用人类il-4和gm-csf培养以在树突状细胞中对其加以区分。培养3天之后，以5000ppc用enad、ng-347或ng-348处理或不处理细胞。作为阳性活化对照物，用lps刺激一些细胞。两天之后，取用上清液用于细胞因子elisa并且染色细胞用于表面活化标记物表达并通过流式细胞术加以分析。如表8中所示，全部病毒均引起共刺激分子cd80和cd86上调，其表明这一先前鉴别的经颗粒介导的先天性免疫细胞活化作用并未被并入ng-347和ng-348的基因组中的转基因改变。全部病毒还刺激分泌类似水平的mip1α和ifnα(图42)。表8.利用enad、ng-347和ng-348的经颗粒介导的人类树突状细胞的活化实例25在一组实验中，随t细胞活化报告基因分析将jurkatdual细胞与肿瘤细胞一起用于共培养物中以评定利用ng-347、ng-348和ng-420病毒的转基因表达的功能性，其中enad充当阴性对照。jurkatdual细胞稳定表达两种不同报告基因：制造响应于通过t细胞受体复合体信号传递的荧光素酶的分泌形式的nfkb报告基因和ifnα响应性经分泌的碱性磷酸酶(seap)报告基因。用病毒以'10ppc预培养a549细胞两天，并且随后添加jurkatdual细胞用于隔夜共培养(18-24h)并且随后收集上清液以分析荧光素酶和seap活性。如图43中所示，经ng-347感染的a549细胞选择性地诱导seap制造，其与其ifnα的制造一致(参见图11)，但并未诱导荧光素酶活性。相比之下，表达膜抗cd3-scfv以活化t细胞受体复合体的ng-348诱导荧光素酶但不诱导seap。在另一个实验中，用10ppc的enad、ng-347、ng-348或ng-420病毒预培养a549肺癌细胞和hct-116、ht-29和dld结肠癌细胞48小时，之后与jurkatdual细胞共培养隔夜，其中针对荧光素酶水平测试上清液以指示所诱导的活化水平。如图44中所示，用编码细胞表面抗cd3-scfv的ng-348或ng-420病毒培养全部四种肿瘤细胞类型，活化jurkatdual细胞而enad和ng-347不会，其中荧光素酶的水平与未感染的肿瘤细胞对照物(uic)相似。在另一个实验中，用不同量的ng-348或ng-420预培养a549或ht-29肿瘤细胞，之后添加jurkatdual细胞并测量其荧光素酶分泌。图45中的数据显示，jurkatdual细胞中的nfkb活性的活化取决于用于处理肿瘤细胞的病毒的剂量。实例26对静脉内投配于具有免疫能力的cd1小鼠中之前的enad和ng-348的活体内药物动力学、生物分布和经颗粒介导的全身性细胞因子诱导活性进行比较，用5×109个enad或ng-348颗粒静脉内投配小鼠并在投配后2、10、30、60和120分钟抽血。通过qpcr针对病毒基因组水平dna提取和分析全血(图46)。从血液清除两种病毒遵循类似动力学。类似地，两种病毒的mcp-1细胞因子应答的诱导(如肝库普弗(kupffer)细胞的先天性免疫的经颗粒介导的活性的量度)也未相似的，组织生物分布样式也相似(图46)。实例27肿瘤大于70mm3后，将hct116细胞皮下植入cb17sc1d小鼠并用enad、ng-347或ng-348病毒(5×l09个病毒颗粒)或对照物肿瘤内(it)或静脉内(iv)注射。对于经静脉内投配的小鼠，在静脉内投配之后3、15和30分钟从来自每个群组的三个小鼠采集血液样本，进行dna提取并通过qpcr(药代动力学[pk]分析)评定血液中的病毒基因组的水平。数据(图47)显示，ng-347和ng-348对enad具有类似pk(并且对彼此具有类似pk)。6小时之后，从来自每个群组的3个小鼠切除肿瘤、肝、肺和脾。dna提取均质组织并通过qpcr(生物分布分析)来分析病毒基因组的水平。数据(图48a)显示三个病毒的相似组织生物分布。7天或14-21天之后，从来自每个群组的三个小鼠切除肿瘤并均质化以产生用于制备dna和rna的肿瘤裂解物。通过所提取的dna的qpcr分析来测量两个时间点的肿瘤中的病毒基因组的水平。数据(图48b)显示，来自经静脉内和肿瘤内投配的小鼠的肿瘤的病毒基因组水平高于所投配的病毒量，其表明组织中的病毒复制，同时在第7天肿瘤内投配提供高于静脉内投配的基因组水平，但在14-21天时间范围内为同样的。全部三种病毒复制达到相似水平。类似地，在所测试的时间点enad、ng-347和ng-348之间的通过rt-qpcr检测的肿瘤裂解物中的病毒六邻体mrna的水平相当(图49和50)。在针对ng-348处理的时间点和两种投配途径下检测到相似水平的抗cd3-scfv和cd80mrna，伴随enad投配的唯一分析背景读数(图50和51)。在肿瘤内或静脉内投配ng-347之后还选择性地检测mip1α和ifnαmrna水平(图52)。使用特定elisa在肿瘤裂解物中测量由ng-347和ng-348编码的cd80蛋白质和由ng-347编码的mip1α蛋白质的水平。图53中的数据显示，在单次静脉内病毒投配之后，还可在肿瘤提取物中选择性地检测到两种蛋白质。在来自同一小鼠的血液样本中未检测到蛋白质。实例28为了评估活体内ng-348病毒的活性和肿瘤细胞相关性，将人类pbmc(5×l07个细胞)、a549人类肿瘤细胞(5×l06)和enad或ng-348(5×l09ppc)的不同组合注射到免疫缺陷型scid米色小鼠的腹膜中，其中病毒或对照物(生理盐水)在注射细胞之后15分钟内投配。3天之后，用5ml生理盐水灌洗腹膜腔并用一组t细胞活性标记物(cd25、cd69和hla-dr)通过流式细胞术分析来分析经回收的细胞以评定t细胞活性水平，之后在cd3+t细胞群上圈选。来自两个单独实验的数据(表9)证实ng-348以肿瘤细胞相关性方式选择性地产生人类t细胞活体内活性。表9.利用ng-348的携带a549肿瘤的小鼠中的人类t细胞的活体内活性序列表<110>皮斯奥克斯治疗公司<120>膜免疫调节剂<130>p000145_wo<150>gb1507419.8<151>2015-04-30<160>109<170>patentinversion3.5<210>1<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>对应于和包括enad基因组的bp29345-29379的bydna序列。<400>1caaataaagtttaacttgtttatttgaaaatcaat35<210>2<211>48<212>prt<213>人工序列<220><223>pdgftm域<400>2alavalglyglnaspthrglngluvalilevalvalprohisserleu151015prophelysvalvalvalileseralaileleualaleuvalvalleu202530thrileileserleuileileleuilemetleutrpglnlysproarg354045<210>3<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>剪接受体序列<400>3tttctctcttcagg14<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>剪接受体序列<400>4tgctaatcttcctttctctcttcagg26<210>5<211>192<212>dna<213>人工序列<220><223>聚腺苷酸化序列（sv40晚期polya序列）<400>5cagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaa60aatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgca120ataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgt180gggaggtttttt192<210>6<211>551<212>dna<213>人工序列<220><223>内部核糖体进入序列（ires）<400>6cgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttc60caccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgac120gagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgt180gaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttg240caggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtata300agatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgga360aagagtcaaatggctcccctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggt420accccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgcttttcatgtgtttagtc480gaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaaca540cgatgataata551<210>7<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223>高效可自剪切的p2a肽序列<400>7glyserglyalathrasnpheserleuleulysglnalaglyaspval151015glugluasnproglypro20<210>8<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223>高效可自剪切的f2a肽序列<400>8glyserglygluglyargglyserleuleuthrcysglyaspvalglu151015gluasnproglypro20<210>9<211>23<212>prt<213>人工序列<220><223>高效可自剪切的e2a肽序列<400>9glyserglyglncysthrasntyralaleuleulysleualaglyasp151015valgluserasnproglypro20<210>10<211>25<212>prt<213>人工序列<220><223>高效可自剪切的t2a肽序列<400>10glyserglyvallysglnthrleuasnpheaspleuleulysleuala151015glyaspvalgluserasnproglypro2025<210>11<211>288<212>prt<213>人工序列<220><223>人类cd80氨基酸序列<400>11metglyhisthrargargglnglythrserproserlyscysprotyr151015leuasnphepheglnleuleuvalleualaglyleuserhisphecys202530serglyvalilehisvalthrlysgluvallysgluvalalathrleu354045sercysglyhisasnvalservalglugluleualaglnthrargile505560tyrtrpglnlysglulyslysmetvalleuthrmetmetserglyasp65707580metasniletrpproglutyrlysasnargthrilepheaspilethr859095asnasnleuserilevalileleualaleuargproseraspglugly100105110thrtyrglucysvalvalleulystyrglulysaspalaphelysarg115120125gluhisleualagluvalthrleuservallysalaasppheprothr130135140proserileseraspphegluileprothrserasnileargargile145150155160ilecysserthrserglyglypheprogluprohisleusertrpleu165170175gluasnglyglugluleuasnalaileasnthrthrvalserglnasp180185190progluthrgluleutyralavalserserlysleuasppheasnmet195200205thrthrasnhisserphemetcysleuilelystyrglyhisleuarg210215220valasnglnthrpheasntrpasnthrthrlysglngluhisphepro225230235240aspasnleuleuprosertrpalailethrleuileservalasngly245250255ilephevalilecyscysleuthrtyrcysphealaproargcysarg260265270gluargargargasngluargleuargarggluservalargproval275280285<210>12<211>188<212>prt<213>人工序列<220><223>人类干扰素氨基酸序列<400>12metalaleuthrphealaleuleuvalalaleuleuvalleusercys151015lyssersercysservalglycysaspleuproglnthrhisserleu202530glyserargargthrleumetleuleualaglnmetargargileser354045leuphesercysleulysasparghisasppheglypheproglnglu505560glupheglyasnglnpheglnlysalagluthrileprovalleuhis65707580glumetileglnglnilepheasnleupheserthrlysaspserser859095alaalatrpaspgluthrleuleuasplysphetyrthrgluleutyr100105110glnglnleuasnaspleuglualacysvalileglnglyvalglyval115120125thrgluthrproleumetlysgluaspserileleualavalarglys130135140tyrpheglnargilethrleutyrleulysglulyslystyrserpro145150155160cysalatrpgluvalvalargalagluilemetargserpheserleu165170175serthrasnleuglngluserleuargserlysglu180185<210>13<211>179<212>prt<213>人工序列<220><223>人类可溶性flt3配体氨基酸序列<400>13metthrvalleualaproalatrpserprothrthrtyrleuleuleu151015leuleuleuleuserserglyleuserglythrglnaspcysserphe202530glnhisserproileserseraspphealavallysilearggluleu354045serasptyrleuleuglnasptyrprovalthrvalalaserasnleu505560glnaspglugluleucysglyglyleutrpa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入于如质粒penad2.4中的转基因盒的并入的克隆位点的完全合成enad基因组<400>109tctatctatataatataccttatagatggaatggtgccaatatgtaaatgaggtgatttt60aaaaagtgtggatcgtgtggtgattggctgtggggttaacggctaaaaggggcggtgcga120ccgtgggaaaatgacgttttgtgggggtggagtttttttgcaagttgtcgcgggaaatgt180gacgcataaaaaggcttttttctcacggaactacttagttttcccacggtatttaacagg240aaatgaggtagttttgaccggatgcaagtgaaaattgttgattttcgcgcgaaaactgaa300tgaggaagtgtttttctgaataatgtggtatttatggcagggtggagtatttgttcaggg360ccaggtagactttgacccattacgtggaggtttcgattaccgtgttttttacctgaattt420ccgcgtaccgtgtcaaagtcttctgtttttacgtaggtgtcagctgatcgctagggtatt480tatacctcagggtttgtgtcaagaggccactcttgagtgccagcgagaagagttttctcc540tctgcgccggcagtttaataataaaaaaatgagagatttgcgatttctgcctcaggaaat600aatctctgctgagactggaaatgaaatattggagcttgtggtgcacgccctgatgggaga660cgatccggagccacctgtgcagctttttgagcctcctacgcttcaggaactgtatgattt720agaggtagagggatcggaggattctaatgaggaagctgtaaatggcttttttaccgattc780tatgcttttagctgctaatgaagggttagaattagatccgcctttggacacttttgatac840tccaggggtaattgtggaaagcggtacaggtgtaagaaaattacctgatttgagttccgt900ggactgtgatttgcactgctatgaagacgggtttcctccgagtgatgaggaggaccatga960aaaggagcagtccatgcagactgcagcgggtgagggagtgaaggctgccaatgttggttt1020tcagttggattgcccggagcttcctggacatggctgtaagtcttgtgaatttcacaggaa1080aaatactggagtaaaggaactgttatgttcgctttgttatatgagaacgcactgccactt1140tatttacagtaagtgtgtttaagttaaaatttaaaggaatatgctgtttttcacatgtat1200attgagtgtgagttttgtgcttcttattataggtcctgtgtctgatgctgatgaatcacc1260atctcctgattctactacctcacctcctgagattcaagcacctgttcctgtggacgtgcg1320caagcccattcctgtgaagcttaagcctgggaaacgtccagcagtggaaaaacttgagga1380cttgttacagggtggggacggacctttggacttgagtacacggaaacgtccaagacaata1440agtgttccatatccgtgtttacttaaggtgacgtcaatatttgtgtgacagtgcaatgta1500ataaaaatatgttaactgttcactggtttttattgctttttgggcggggactcaggtata1560taagtagaagcagacctgtgtggttagctcataggagctggctttcatccatggaggttt1620gggccattttggaagaccttaggaagactaggcaactgttagagaacgcttcggacggag1680tctccggtttttggagattctggttcgctagtgaattagctagggtagtttttaggataa1740aacaggactataaacaagaatttgaaaagttgttggtagattgcccaggactttttgaag1800ctcttaatttgggccatcaggttcactttaaagaaaaagttttatcagttttagactttt1860caaccccaggtagaactgctgctgctgtggcttttcttacttttatattagataaatgga1920tcccgcagactcatttcagcaggggatacgttttggatttcatagccacagcattgtgga1980gaacatggaaggttcgcaagatgaggacaatcttaggttactggccagtgcagcctttgg2040gtgtagcgggaatcctgaggcatccaccggtcatgccagcggttctggaggaggaacagc2100aagaggacaacccgagagccggcctggaccctccagtggaggaggcggagtagctgactt2160gtctcctgaactgcaacgggtgcttactggatctacgtccactggacgggataggggcgt2220taagagggagagggcatctagtggtactgatgctagatctgagttggctttaagtttaat2280gagtcgcagacgtcctgaaaccatttggtggcatgaggttcagaaagagggaagggatga2340agtttctgtattgcaggagaaatattcactggaacaggtgaaaacatgttggttggagcc2400tgaggatgattgggaggtggccattaaaaattatgccaagatagctttgaggcctgataa2460acagtataagattactagacggattaatatccggaatgcttgttacatatctggaaatgg2520ggctgaggtggtaatagatactcaagacaaggcagttattagatgctgcatgatggatat2580gtggcctggggtagtcggtatggaagcagtaacttttgtaaatgttaagtttaggggaga2640tggttataatggaatagtgtttatggccaataccaaacttatattgcatggttgtagctt2700ttttggtttcaacaatacctgtgtagatgcctggggacaggttagtgtacggggatgtag2760tttctatgcgtgttggattgccacagctggcagaaccaagagtcaattgtctctgaagaa2820atgcatatttcaaagatgtaacctgggcattctgaatgaaggcgaagcaagggtccgcca2880ctgcgcttctacagatactggatgttttattttgattaagggaaatgccagcgtaaagca2940taacatgatttgcggtgcttccgatgagaggccttatcaaatgctcacttgtgctggtgg3000gcattgtaatatgctggctactgtgcatattgtttcccatcaacgcaaaaaatggcctgt3060ttttgatcacaatgtgatgacgaagtgtaccatgcatgcaggtgggcgtagaggaatgtt3120tatgccttaccagtgtaacatgaatcatgtgaaagtgttgttggaaccagatgccttttc3180cagaatgagcctaacaggaatttttgacatgaacatgcaaatctggaagatcctgaggta3240tgatgatacgagatcgagggtacgcgcatgcgaatgcggaggcaagcatgccaggttcca3300gccggtgtgtgtagatgtgactgaagatctcagaccggatcatttggttattgcccgcac3360tggagcagagttcggatccagtggagaagaaactgactaaggtgagtattgggaaaactt3420tggggtgggattttcagatggacagattgagtaaaaatttgttttttctgtcttgcagct3480gtcatgagtggaaacgcttcttttaaggggggagtcttcagcccttatctgacagggcgt3540ctcccatcctgggcaggagttcgtcagaatgttatgggatctactgtggatggaagaccc3600gtccaacccgccaattcttcaacgctgacctatgctactttaagttcttcacctttggac3660gcagctgcagctgccgccgccgcttctgttgccgctaacactgtgcttggaatgggttac3720tatggaagcatcatggctaattccacttcctctaataacccttctaccctgactcaggac3780aagttacttgtccttttggcccagctggaggctttgacccaacgtctgggtgaactttct3840cagcaggtggtcgagttgcgagtacaaactgagtctgctgtcggcacggcaaagtctaaa3900taaaaaaatcccagaatcaatgaataaataaacaagcttgttgttgatttaaaatcaagt3960gtttttatttcatttttcgcgcacggtatgccctagaccaccgatctctatcattgagaa4020ctcggtggattttttccaggatcctatagaggtgggattgaatgtttagatacatgggca4080ttaggccgtctttggggtggagatagctccattgaagggattcatgctccggggtagtgt4140tgtaaatcacccagtcataacaaggtcgcagtgcatggtgttgcacaatatcttttagaa4200gtaggctgattgccacagataagcccttggtgtaggtgtttacaaaccggttgagctggg4260atgggtgcattcggggtgaaattatgtgcattttggattggatttttaagttggcaatat4320tgccgccaagatcccgtcttgggttcatgttatgaaggaccaccaagacggtgtatccgg4380tacatttaggaaatttatcgtgcagcttggatggaaaagcgtggaaaaatttggagacac4440ccttgtgtcctccaagattttccatgcactcatccatgataatagcaatggggccgtggg4500cagcggcgcgggcaaacacgttccgtgggtctgacacatcatagttatgttcctgagtta4560aatcatcataagccattttaatgaatttggggcggagagtaccagattggggtatgaatg4620ttccttcgggccccggagcatagttcccctcacagatttgca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