一种水稻蜡质基因Wx的荧光分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物技术领域，尤其涉及一种水稻蜡质基因wx的荧光分子标记及其应用。

背景技术：

水稻是重要的粮食作物，世界上有100多个国家种植水稻，全球2/3的人口以水稻为主粮。随着社会经济的发展和消费水平的提高，人们对稻米品质和安全要求越来越高，优质软米具有食味佳、富有弹性、冷后不易变硬等特点被大多数消费者所喜爱。影响水稻蒸煮品质的一个重要因素是沉积于胚乳中的淀粉品质，其分为直链和支链淀粉，直链淀粉是鉴定稻米品质的主要指标之一。稻米中直链淀粉含量高，糊化温度也往往较高，胶稠度降低，从而使米饭的黏性、柔软性和光泽度变差，进而严重影响米饭的质地与食味。水稻蜡质基因(wx)编码结合在淀粉粒上的淀粉合成酶(gbssi)催化水稻胚乳中的直链淀粉合成。wx基因的主要等位变异类型较复杂，在稻属栽培种中具有非常丰富的变异类型。wx^a主要存在于籼稻品种中，控制高直链淀粉含量的形成，稻米直链淀粉含量一般都在20％以上，最高的可达30％以上，导致了米饭的质地与食味降低。wx^b等位类型主要存在于粳稻品种中，直链淀粉含量相比籼稻的水稻品种低了很多，一般在15-18％。这类稻米由于直链淀粉含量中等偏低，米饭黏性、柔软性和光泽度明显优于wx^a类品种。

鉴于水稻wx基因对稻米品质的影响，而其表型鉴定受环境影响，且在籽粒成熟收获后才能进行，对低直链淀粉含量的品种选育增加了难度，因此越来越多的水稻育种研究者利用分子标记辅助选择技术进行水稻低直链淀粉品种的选育。如专利cn1330861a中介绍的采用pcr扩增的方法，但是完成后需要进行酶切、转移到琼脂糖电泳检测，再利用凝胶成像系统观察和统计，该方法酶切耗时长，内切酶成本高昂，并且操作复杂，过程中使用有毒的核酸染料。而专利cn108796110a公开通过引物错配扩增不同片段大小来区分基因型。由于所扩增的片段差异较小，须用分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带差异。而聚丙稀酰胺凝胶制作过程复杂，并且所使用的试剂丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒剂，对人体伤害很大。凝胶电泳之后，需要用硝酸银和甲醛染色，以上试剂都为有毒试剂和致癌物，对环境和人体有很大的伤害，不环保。

技术实现要素：

针对以上技术问题，本发明公开了一种稻蜡质基因wx的荧光分子标记及其应用，检测样品只通过一次pcr扩增，不需要电泳检测，而直接在原板上用荧光扫描仪获取扩增数据，获得水稻wx^a及wx^b的基因型数据；操作简便、快速，成本低，结果准确，解决目前使用的方法因实施过程耗时长，过程繁琐，效率低并且使用有毒物质的缺点。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种稻蜡质基因wx的荧光分子标记的引物，包括rwx-fg引物、rwx-ft引物、rwx-r引物、#1通用引物、#2通用引物，所述rwx-fg引物的序列如seqidno：1所示，所述rwx-ft引物的序列如seqidno：2所示，所述rwx-r引物的序列如seqidno：3所示，所述#1通用引物的序列如seqidno：4所示，所述#2通用引物的序列如seqidno：5所示。

正向引物rwx-fg：

gaaggtgaccaagttcatgcttcatcaggaagaacatctgcaagg；

正向引物rwx-ft：

gaaggtcggagtcaacggatttcatcaggaagaacatctgcaagt；

反向引物rwx-r：ggaaaaacgagcaatgaaagatgc。

#1通用引物：fam-gaaggtgaccaagttcatgct；

#2通用引物：hex-gaaggtcggagtcaacggatt。

通过研究发现，wx基因第1内含子与第2外显子之间的碱基g(wx^a)突变为t(wx^b)，使得剪切效率降低，胚乳的颗粒结合淀粉合成酶(gbss)的能力降低，直链淀粉含量随之下降。采用此技术方案，基于penta-primeramplificationrefractorymutationsystem(parms)，即五引物扩增受阻技术体系，及wx基因中wx^a与wx^b两个等位基因第1内含子与第2外显子之间的碱基g与t的差异，开发出了能跟踪直链淀粉含量的共显性荧光分子标记pm-wx，即rwx-fg引物、rwx-ft引物、rwx-r引物。利用这5条引物形成的扩增受阻体系，检测样品只通过一次pcr扩增，不需要电泳检测，而直接在原板上用荧光扫描仪获取扩增数据，经过软件分析，获得水稻wx的基因型数据。方法简单，操作简便、快速，成本低，结果准确；而且环保。

本发明公开了一种水稻蜡质基因wx的荧光分子标记，其采用如上所述的水稻蜡质基因wx的荧光分子标记的引物获得。

进一步的，其采用如上所述的水稻蜡质基因wx的荧光分子标记的引物对水稻植株中的基因进行扩增，将得到的扩增引物在包含fam、hex和rox三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，如果扫描获得hex荧光信号，则为含wx^b等位基因；如果扫描获得fam荧光信号，则为含wx^a等位基因。

采用此技术方案，3条根据wx基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到pcr反应体系进行扩增，低直链淀粉含量wx^b等位基因序列可以根据snp差异与正向引物rwx-ft匹配而扩增获得hex荧光信号值；而高直链淀粉含量wx^a等位基因序列与正向引物rwx-fg匹配而扩增获得fam荧光信号值。如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增，在分型结果图中位置在两者之间，扫描结果为同时有hex和fam信号。

进一步的，所述的水稻蜡质基因wx的荧光分子标记包括以下步骤：

步骤s1，提取水稻植株的基因组dna；

步骤s2，将正向引物rwx-fg、正向引物rwx-ft、反向引物rwx-r、#1通用引物、#2通用引物同时加入到pcr反应体系中进行扩增获得pcr产物，其中pcr的反应程序为：94℃，3min；然后10个循环94℃、20sec，65℃(在此设置每个循环退火温度降低0.8℃，10个循环运行完毕，此时退火温度为57℃)、1min；然后30个循环94℃，20sec，57℃，1min；

步骤s3，将pcr产物在包含fam、hex和rox三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值结合标记信息，进行基因分型，获得基因型结果；

步骤s4，根据荧光信号值进行分析，如果扫描获得hex荧光信号，则为含wx^b等位基因；如果扫描获得fam荧光信号，则为含wx^a等位基因；如果扫描结果为同时有hex和fam信号，在分型结果图中位置在两者之间，则表示该样品为杂合状态。

进一步的，步骤s2中，pcr反应体系为10μl的体系：5μl2×parmsmastermix，0.15μl10mmrwx-fg标记引物，0.15μl10mmrwx-ft标记引物，0.4μl10mmrwx-r通用反向引物，1μl模板dna，3.3μlddh2o。进一步的，其中parmsmastermix试剂包含#1通用引物、#2通用引物、buffer、dntp、taq酶，内标rox。

本发明还公开了一种如上所述的水稻蜡质基因wx的荧光分子标记的应用，其应用在低直链淀粉含量的水稻品种的选择育种中。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)采用本发明的技术方案，检测样品只通过一次pcr扩增，不需要电泳检测，而直接在原板上用荧光扫描仪获取扩增数据，经过分析，获得水稻wx的基因型数据。该技术方案可在水稻生长的任何时期检测，并且操作简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。解决目前使用的方法因实施过程耗时长，过程繁琐，效率低并且使用有毒物质的问题，更加环保。

(2)虽然荧光扫描技术在分子标记中得到了广泛的应用，但是现有技术采用的荧光扫描检测也需要一定的条件来实现，比如需要合成特定的带有荧光基团的引物等等，成本高。采用本发明的技术方案，只需要合成普通引物，费用低廉，由于采用通用荧光引物，成本降低，大大节省了实验成本。

附图说明

图1是本发明的鉴定蜡质等位基因wx^a及wx^b的扩增示意图。其中，#1为allele1fam荧光通用引物；#2为allele2hex荧光通用引物；#3为allele1特异扩增引物(标记引物rwx-fg)；#4为allele2特异扩增引物(标记引物rwx-ft)；#5为通用反向引物(标记引物rwx-r)。

图2本发明实施例的荧光分子标记检测94个水稻亲本品种的基因分型结果图。图中，左上方的信号点为hex荧光信号；右下方的信号点为fam荧光信号。

具体实施方式

下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

一种水稻蜡质基因wx的荧光分子标记，其采用如下水稻蜡质基因wx的荧光分子标记的引物进行扩增获得，鉴定蜡质等位基因wx^a及wx^b的扩增示意图如图1所示。引物包括rwx-fg引物、rwx-ft引物、rwx-r引物、#1通用引物、#2通用引物，所述rwx-fg引物的序列如seqidno：1所示，所述rwx-ft引物的序列如seqidno：2所示，所述rwx-r引物的序列如seqidno：3所示，所述#1通用引物的序列如seqidno：4所示，所述#2通用引物的序列如seqidno：5所示。

正向引物rwx-fg：

gaaggtgaccaagttcatgcttcatcaggaagaacatctgcaagg；

正向引物rwx-ft：

gaaggtcggagtcaacggatttcatcaggaagaacatctgcaagt；

反向引物rwx-r：ggaaaaacgagcaatgaaagatgc。

#1通用引物：fam-gaaggtgaccaagttcatgct；

#2通用引物：hex-gaaggtcggagtcaacggatt。

本实施例通过检测94份水稻亲本材料为wx^a或wx^b型，并结合检测材料的表型分析验证该方案的准确性。

具体实施步骤如下：

(1)提取水稻基因组dna

分别取种植于南宁的94份水稻叶片，通过ctab提取法(十六烷基三甲基溴化铵法)获得水稻的基因组dna；

(2)pcr扩增

pcr反应体系为10ul：5μl2×parmsmastermix(该试剂购买于武汉市景肽生物科技有限公司，主要包含2条通用荧光引物，buffer，dntp以及taq酶，内标rox等)，0.15μl10mmrwx-fg标记引物，0.15μl10mmrwx-ft标记引物，0.4μl10mmrwx-r通用反向引物，1μl模板dna，3.3μlddh2o。pcr反应程序：94℃，3min；然后10个循环94℃，20sec，65℃(在此设置每个循环退火温度降低0.8℃，10个循环运行完毕，此时退火温度为57℃)，1min；然后30个循环94℃，20sec，57℃，1min；

(3)将pcr产物在包含fam、hex和rox三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果；

(4)根据荧光信号值进行分析，如果扫描获得hex荧光信号，则为wx^b等位基因型；如果扫描获得fam荧光信号，则为wx^a等位基因型。如果位于两者之间，则为杂合型。

(5)结果与分析

94个水稻亲本品种的分子标记的基因分型检测详见图2所示。由图可见：检测到hex荧光信号的为基因型为wx^b的亲本材料，而检测到fam荧光信号的为基因型为wx^a的亲本材料。位于上述两者之间，即包含hex荧光信号又有fam荧光信号的，为杂合型。本实施例中，编号为p119的亲本材料该位点为杂合型。

同时，对相应的亲本材料进行直链淀粉含量的测定，并与荧光标记的检测结果进行联合统计，结果如表1所示。

表194份水稻亲本直链淀粉含量及pm-wx检测分型荧光检测结果

由表1的统计结果显示，分子标记与表型结果一致，直链淀粉含量低于18％的样品荧光信号为hex，直链淀粉含量高于20％的品种荧光信号为fam，编号为p119的供试品种由于该基因属于杂合状态，因此分型结果显示该品种独立于hex及fam两种类型之间，并且直链淀粉含量也介于两者之间。可见，采用本发明的技术方案结果准确。该技术方案可应用于高效准确的选育低直链淀粉含量的水稻品种，大大节约时间和工作量。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>广西壮族自治区农业科学院

<120>一种水稻蜡质基因wx的荧光分子标记及其应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>45

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

gaaggtgaccaagttcatgcttcatcaggaagaacatctgcaagg45

<210>2

<211>45

<212>dna

<213>artificialsequence

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<210>3

<211>24

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<210>4

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gaaggtgaccaagttcatgct21

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<400>5

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