0°C时加入已灭 菌的10mL 1M MgC12,使Amp为100 y g/mL，葡萄糖含量为2%。
[0026] 2. CyHV-2单克隆抗体制备
[0027] 2. 1 免疫
[0028] 使用CyHV-2抗原对五个小鼠进行免疫，第1天用无菌生理盐水将病毒液稀释成5 倍后与QuickAntibody_Mouse5W佐剂1:1的混合，后腿肌肉注射100ul/只。第21天同首 次免疫剂量，加强免疫，第35天断尾采血检测。
[0029] 2. 2血清检测
[0030] 2. 2. 1血清效价检测
[0031] 将CyHV-2抗原稀释1500倍后包被100ul/孔，4°C过夜；第二天用3%的脱脂奶粉 封闭120ul/孔lh ;将取自5个小鼠的血清分别稀释1000倍、2000倍、4000倍和8000倍， 每孔50ul PBS，50ul稀释好的血清，37°C孵育30min ;洗涤，加入用PBST稀释8000倍的酶 标二抗，l〇〇ul/孔，37°C孵育30min ;洗涤，加入显色液100ul/孔，37°C孵育15min ;用2M的 硫酸终止，在450nm处读数。
[0032] 2. 2. 2血清抑制率检测
[0033] 将CyHV-2抗原稀释1500倍后包被100ul/孔，4°C过夜；第二天用3%的脱脂奶粉 封闭120ul/孔lh ;将取自5个小鼠的血清分别稀释1000倍、100倍和10倍，每孔50ul不 同稀释倍数的病毒悬液，50ul稀释好的血清，同时用PBS作对照，37°C孵育30min ;洗涤，加 入用PBST稀释8000倍的酶标二抗，100ul/孔，37°C孵育30min ;洗绦，加入显色液100ul/ 孔，37°C孵育15min ;用2M的硫酸终止，在450nm处读数。
[0034] 2. 3 融合
[0035] 细胞融合前两周复苏SP2/0骨髓瘤细胞，融合前两天培养5瓶SP2/0骨髓瘤细胞。 融合时收获SP2/0,离心，用RPMI-1640洗涤两次，加入20ml RPMI-1640悬浮，计数。取效 价较高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，配制成悬浮液。吸取含有IX 108个脾细胞和 2 X 107个骨髓瘤细胞的悬浮液，加入50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分混匀。 lOOOrpm离心8min，将上清液尽量弃去。轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。一手 均匀转动离心管，另一手用1 ml吸管吸取lml50% PEG3000溶液沿转动的管壁加入，从加入 到加完的时间控制在60s左右，然后立即将细胞悬液全部吸入吸管，静置30s，再将其吹入 离心管内，时间也控制30s左右。立即在5min内加入25ml不完全培养液使PEG稀释而失 去促融作用。l〇〇〇rpm离心5min，弃去上清。加入HAT培养液，10ml/板，轻轻吹吸沉淀的细 胞，使其悬浮并混匀。将细胞悬液加入铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0. lml。培养板 置37 °C，含8 % C02的培养箱内培养。
[0036] 2. 4融合后检测
[0037] 2.4. 1融合后阳性孔筛选
[0038] 将免疫原稀释1500倍后包被100ul/孔，4°C过夜；第二天用3%的脱脂奶粉封 闭120ul/孔lh ;每孔50ul PBS，50ul细胞上清液，37°C孵育30min ;洗涤，加入用PBST稀 释8000倍的酶标二抗，100ul/孔，37°C孵育30min ;洗涤，加入显色液100ul/孔，37°C孵育 15min;用2M的硫酸终止，在450nm处读数。
[0039] 2. 4. 2阳性孔特异性检测
[0040] 将免疫原稀释1500倍后包被100ul/孔，4°C过夜；第二天用3%的脱脂奶粉封闭 120ul/孔1小时；将细胞培养上清稀释适合的倍数，每孔50ul不同稀释倍数的病毒悬液， 50ul稀释好的细胞上清，同时用PBS作对照，37°C孵育30min;洗绦，加入用PBST稀释8000 倍的酶标二抗，l〇〇ul/孔，37°C孵育30min ;洗涤，加入显色液100ul/孔，37°C孵育15min ; 用2M的硫酸终止，在450nm处读数。
[0041] 2. 5单克隆抗体及筛选检测
[0042] 有限稀释法进行克隆，克隆5天后挑选单个克隆孔，10天左右检测。
[0043] 2. 5. 1单克隆筛选
[0044] 07狀-2病毒悬液稀释1500倍后包被100111/孔，41：过夜 ；第二天用3%的脱脂奶 粉封闭120ul/孔lh;每孔50ul PBS，50ul细胞上清液。37°C孵育30分钟；洗涤，加入用 PBST稀释8000倍的酶标二抗，100ul/孔，37°C孵育30min;洗涤，加入显色液100ul/孔， 37°C孵育15min;用2M的硫酸终止，在450nm处读数。
[0045] 2. 5. 2单克隆孔特异性检测
[0046] 将阴性样本及免疫原分别稀释1500倍后包被100ul/孔，4°C过夜；第二天用3% 的脱脂奶粉封闭120ul/孔lh;将细胞培养上清稀释适合的倍数，每孔100ul，同时用PBS 作对照，37°C孵育30min ;洗涤，加入用PBST稀释8000倍的酶标二抗，100ul/孔，37°C孵育 30min;洗涤，加入显色液100ul/孔，37°C孵育15min;用2M的硫酸终止，在450nm处读数。
[0047] 二、实验结果
[0048] 1.小鼠血清效价检测实验结果
[0049] 小鼠血清效价检测和血清抑制率检测如表1和表2所不。
[0050] 表1血清效价检测
[0051]
【主权项】
1. 一种CyHV-2单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体由保藏号CCTCC No. C2013114的杂交瘤细胞GFHNV-6G7或保藏号CCTCC No. C2013115的杂交瘤细胞 GFHNV-3B5分泌产生。
2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备CyHV-2检测试剂或设备中的应用。
3. -种CyHV-2酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述 的单克隆抗体。
4. 一种分泌CyHV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCC No. C2013114或 CCTCC No. C2013115。
【专利摘要】本申请公开了一种CyHV-2单克隆抗体、杂交瘤细胞和应用。本申请的CyHV-2单克隆抗体，由保藏号CCTCC No.C2013114的杂交瘤细胞GFHNV-6G7或保藏号CCTCC No.C2013115的杂交瘤细胞GFHNV-3B5分泌产生。本申请的CyHV-2单克隆抗体具备良好的特异性和效价，将其制成快速免疫检测试纸，不仅能够提高检测速度和检测效率，而且能够实现鲤科疱疹病毒-2的现场检测。本申请的CyHV-2单克隆抗体填补了鲤科疱疹病毒-2免疫检测的空缺，为鲤科疱疹病毒-2的免疫学研究奠定了基础。CCTCC No. C201311420130913CCTCC No. C201311520130913
【IPC分类】G01N33-577, C07K16-08, C12N5-20, G01N33-569
【公开号】CN104592383
【申请号】CN201510031649
【发明人】何俊强, 王津津, 刘荭, 于力, 郑晓聪, 贾鹏, 兰文升, 史秀杰
【申请人】深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月21日