途径得到。
[0061] 以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术 手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验 指南(第3版)》（科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》（高等教育出版社）以及相应仪器 和试剂的厂商说明书等参考。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均 值。
[0062] 实施例1、L-组氨酸底盘工程菌CG160的获得
[0063]一、谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032中L-组氨酸合成操纵子启动子替换为强启动 子PglyA
[0064] 根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的hisEG操纵子及其上下游序列和P glyA 启动子序列分别设计引物。
[0065] 以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P1和P2为引物PCR扩增hisEG 操纵子启动子上游同源臂；以P3和P4为引物扩增启动子P glyA;以P5和P6为引物扩增hisEG 启动子下游同源臂。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P1和P6为引物，采用重叠延伸 PCR技术（S0E)扩增，得到1920bp的PCR产物，为含替换启动子P glyA及被替换启动子PhisEe 的上下游同源臂的片段(序列4)。
[0066] 其中，序列4自5'末端第1-862位核苷酸为被替换启动子PhisH；的上游同源臂，序 列4自5'末端第863-1052位核苷酸为启动子PglyA，序列4自5'末端第1053-1920位核苷 酸为被替换启动子PhisEe的下游同源臂。
[0067] 将上述1920bp的PCR产物经Xba I和BamH I双酶切后，与经同样双酶切处理的同 源重组载体pK18mobsacB (可购自美国典型微生物保藏中心ATCC，货号87097)连接。连接 产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5 a，在含卡那霉素（50 y g/mL)的LB平板上筛选转 化子，转化子传代培养三代后，以P13和P14为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2132bp 为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Xba I和BamH I双酶切鉴定， 得到1920bp的为阳性。
[0068] 将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中序列4所示的核苷酸插入载体 pK18mobsacB 中得到的重组质粒，命名为 pK18mobsacB-PglyA: :PhisEG。
[0069] 采用相同的方法构建同源重组质粒pK18mobsacB-PglyA: :PhisDCB，具体如下：以P7和 P8为引物扩增hisDCB操纵子启动子上游同源臂；以P9和P10为引物扩增启动子PglyA;以 P11和P12为引物扩增hisDCB的启动子下游同源臂。以P7和P12为引物，采用重叠延伸 PCR技术（S0E)扩增。得到1694bp的PCR产物，为含替换启动子P glyA&被替换启动子PhisIO 上下游同源臂的长片段(序列5)，其中，序列5自5'末端第1-751位核苷酸为被替换启动子 Phisi〇的上游同源臂，序列5自5'末端第752-941位核苷酸为启动子P glyA，序列5自5'末 端第942-1694位核苷酸为被替换启动子PhisDCB的下游同源臂。
[0070]将上述1694bp的PCR产物经Hind III和BamH I双酶切后，与经同样双酶切处理 的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5a，在含 卡那霉素（50 y g/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P13和P14为引 物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1906bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒， 并对质粒进行Hind III和BamH I双酶切鉴定，得到1694bp的为阳性。将阳性质粒送去测 序，结果该质粒为将序列表中序列5所示的核苷酸插入载体pK18mobsacB中得到的重组质 粒，命名为 pK18mobsacB-PglyA: :PhisDCB。
[0071] 上述所用的引物序列如下：
[0072] P1:GCTCTAGAGTATCGGCGTGGAGTTGTC(Xba I)
[0073] P2:TAGTGGAGTAGCTTTATTTTGCGACACCTGCC
[0074] P3:GTCGCA AAATAAAGCTACTCCACTAGTGTGATCG
[0075] P4:GGTTCCTCCTTTGCGTAAGACCTCACTCGC
[0076] P5:GAGGTCTTACGCAAAGGAGGAACCGAATGAAGACATTTGA
[0077] P6:CGCGGATCCCAGGATCTGCTGCTCTGG(BamH I)
[0078] P7:CCCAAGCTTCGAGGAAACCGTTGAGGA(Hind III)
[0079] P8:TAGTGGAGTAGCTATGGATTTCACCTCTGTGAATG
[0080] P9:TCTCCACTTTAGGTAAGCTACTCCACTAGTGTGATCG
[0081] P10:CGATCCTCCTTTGCGTAAGACCTCACTCGC
[0082] PI1:GAGGTCTTACGCAAAGGAGGATCGCCATGTTGAATGTC
[0083] P12:CGCGGATCCGGCAGAGGCATCAGCAAG(BamH I)
[0084] P13:ATGTGCTGCAAGGCGATTAA
[0085]P14 ：TATGCTTCCGGCTCGTATGT
[0086] P15:TTTTATATATGGGTATCGGCGGTCTATGCT
[0087] 将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB_PglyA: :PhisEe电转化至谷氨酸棒杆 菌野生型ATCC13032中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌 落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P15和P6 为引物进行PCR扩增鉴定，得到948bp的为重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌WT-P glyA: :PhisE(；。
[0088] 将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB_PglyA: :PhisDC；B电转化至谷氨酸棒杆 菌WT_PglyA: :PhisE(；中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通 过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P15和P12为引 物进行PCR扩增鉴定，得到833bp的为重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌06158(11'-?_ ::?1^(；- PglyA: :PhisDCB)。
[0089] 经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将谷氨酸棒杆菌野生型 ATCC13032中的hisEG和hisDCB的启动子均替换为谷氨酸棒杆菌内源强启动子P glyA，将 hisE和hisD基因的RBS替换为谷氨酸棒杆菌高表达基因的保守RBS序列（AAAGGAGGA)，将 hisE基因的起始密码子GTG替换为高表达强度的ATG，谷氨酸棒杆菌CG158(WT-P glyA: :PhisEe "PglyA:: PhisDCB)构建成功。
[0090] 二、染色体上基因hisG的定点突变获得L-组氨酸底盘工程菌CG160
[0091] 染色体hisG基因定点突变采用两步替换的方法，以期同时实现该基因的三个定 点突变，先将序列表中序列6所示的含氯霉素抗性基因Cnf及hisG基因突变片段上下游同 源臂的长片段与CG158同源重组，得到重组菌WT-PglyA: :PhisE(；-Cnf: :hisG-PglyA: :PhisDC：B ;再将 序列表中序列7所示的含三个点突变的hisG基因末端264bp片段及其上下游同源臂的长 片段与重组菌 WT-PglyA: :PhisE<rCnf: :hisG-PglyA: :PhisDC：B 同源重组，得到 CG160。
[0092] 具体如下：
[0093] 以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P16和P17为引物PCR扩增hisG 基因突变片段的上游同源臂，以P18和P19为引物扩增hisG基因突变片段的下游同源臂； 以 P20 和 P21 为引物，质粒 pXMJ19 (购自于 Biovector Science Lab, Inc,货号 SMD1168H) 为模板，扩增氯霉素抗性基因Cnf。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P16和P21为引物， 采用重叠延伸PCR技术（S0E)扩增，得到1689bp含氯霉素抗性基因Cnf及hisG基因突变片 段上下游同源臂的长片段(序列6)。
[0094] 其中，序列6自5'末端第1-420位核苷酸为hisG基因突变片段上游同源臂，序列 6自5'末端第421-1281位核苷酸为氯霉素抗性基因Cnf，序列6自5'末端第1282-1689位 核苷酸为hisG基因突变片段下游同源臂。
[0095] 以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P62和P63为引物扩增含C645G (第215位天冬酰胺变为赖氨酸）突变位点的hisG基因片段，以P64和P65为引物扩增含 A693C和A703G (第231位亮氨酸变为苯丙氨酸和第235位苏氨酸变为丙氨酸)突变位点的 hisG片段，再以纯化的上述PCR产物为模板，以P62和P65为引物，采用重叠延伸PCR技术 (S0E)扩增，得到846bp含三个点突变的hisG基因(序列3自5'末端第1007-1852位核苷 酸)。以P16和P22为引物PCR扩增hisG基因定点突变的上游同源臂，以P23和P21为引 物扩增hisG基因定点突变的下游同源臂；以P24和P25为引物，以上述获得的含三个点突 变的hisG基因为模板，扩增含三个点突变的hisG基因末端264bp片段。再以纯化的上述 PCR产物为模板，以P16和P21为引物，采用重叠延伸PCR技术（SOE)扩增，得到1092bp含 三个点突变的hisG基因末端264bp片段及其上下游同源臂的长片段(序列7)。
[0096] 其中，序列7自5'末端第1-420位核苷酸为上游同源臂，序列7自5'末端第 421-684位核苷酸为三个点突变的hisG基因末端264bp片段，序列7自5'末端第685-1092 位核苷酸为下游同源臂。
[0097] 纯化回收的两个PCR产物分别经BamH I和EcoR I双酶切后，分别与经同样双酶 切处理的敲除载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5 a， 在含卡那霉素（50 y g/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P13和 P14为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1901bp和1304bp的分别为携带两种重组质 粒的阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行BamH I和EcoR I双酶切 鉴定，得到1689bp和1092bp的分别为两种重组质粒。经进一步序列测定验证，重组质粒 pK18mobsacB_Cm r: :hisG 和 pKlSmobsacB-hisG*1': :Cmr 构建成功。
[0098] pK18mobsacB-Cnf: :hisG为将含氯霉素抗性基因Cnf及hisG基因突变片段上下游 同源臂的长片段(序列6)插入到载体pKISmobsacB中得到的重组载体；
[0099] pKlSmobsacB-hisG?": :Cnf为将含三个点突变的hisG基因末端264bp片段及其上 下游同源臂的长片段(序列7)插入到载体pKISmobsacB中得到的重组载体；
[0100] 上述所用的引物序列如下：
[0101] P16:CGCGGATCCATCTACG