TGTTGCGTAAGACCTCACTC(Hind III)
[0204] 二、枯茗酸诱导型L-组氨酸初级工程菌CG319的构建
[0205] 将实施例2中获得的1852bp的prsA-hisGfbl:片段(序列3)，经Xba I和Sma I双酶 切后，与经同样双酶切处理的上述构建的枯茗酸诱导型表达质粒PWYE1233连接。重组质粒 构建方法同实施例2中一所述的方法，所获得的重组质粒命名为pWYEUSS-prsA-hisG^"。
[0206] pWYEUSS-prsA-hisG^1'经进一步序列测定分析，该质粒为将prsA_hisG fte片段(序 列3)插入质粒pWYE1233的Xba I和Sma I酶切位点间得到的载体。
[0207] 将质粒pWYEUSS-prsA-hisG^R化至上述构建的底盘工程菌CG160中，其转化子 鉴定方法同实施例2中一所述的方法，L-组氨酸工程菌CG319(WT-P glyA: :PhisE(；-hiSGfblr-PglyA ::Phisi〇/pWYE1233-prsA-hisGfbr)构建成功。
[0208] 三、枯茗酸诱导型L-组氨酸初级工程菌CG320的获得
[0209] 工程菌CG320为质粒pWYE1233-prsA-hisGfto导入工程菌CG161中得到的重组菌。
[0210] 四、枯茗酸诱导型L-组氨酸高产工程菌CG322的构建
[0211] 将实施例2中获得的2519bp的zwf-opcA片段(序列2)。经Hind III 和Xba I双酶切后，先与经同样双酶切处理的表达质粒pWYE1233连接，获得的 重组质粒pWYE1233-zwf-〇pcA再经Xbal和Smal双酶切，与上述二制备的质粒 pWYEUSS-prsA-hisG?^ 经 Xba I 和 Sma I 双酶切获得的 1852bp 的 prsA-hisGfbr 片 段连接。重组质粒构建方法同实施例2中三所述的方法，所获得的重组质粒命名为 pffYE^SS-zwf-opcA-prsA-hisG^o
[0212] 经序列测定验证，重组质粒pWYE1233-zwf-〇pcA-prsA_hisGfte构建成功，为将 zwf-opcA基因（序列2)插入pWYE1233的Hind III和Xba I位点间，且将prsA-hisGfto片 段(序列3)插入Xba I和Sma I位点间得到的载体。
[0213] 将过表达质粒pWYEI^SS-zwf-opcA-prsA-hisG? 1'分别电转化至pgi未缺失的工程 菌CG160和pgi缺失的工程菌CG161中。L-组氨酸工程菌CG321(WT-P glyA: zPhi^-hisG^r-P giyA: Jhisio/pWYEUSS-zwf-opcA-prsA-hisG?")和 CG322 (WT-PglyA: iPh^-hisG^-PgiyA: :PhisD CB- Apgi/pWYE1233-zwf-〇pcA-prsA_hisGfbrr)构建成功。
[0214] 实施例5、L-组氨酸工程菌在生成L-组氨酸中的应用
[0215] 一、含有质粒的高产L-组氨酸的重组菌发酵
[0216] 1、含有质粒的高产L-组氨酸工程菌摇瓶发酵
[0217] 摇瓶发酵采用的发酵培养基具体如下：葡萄糖40,（NH4) 2S0420, KH2P040. 5， K2HP04 ? 3H200. 5, MgS04 ? 7H200. 25, FeS04 ? 7H200. 01，MnS04 ? H200. 01，ZnS04 ? 7H200. 001， CuS040 . 00 0 2, NiCl2 ? 6H200. 00002,生物素 0? 0002, pH7. 0-7. 2,2%CaC03,121 °C 高压灭菌 20min。葡萄糖分开灭菌，115°C高压灭菌15min。MgS04 ? 7H20,以及无机盐离子分开灭菌， 121°C高压灭菌20min。维生素采用0. 22 y m无菌滤膜过滤除菌。
[0218] 种子培养基具体如下：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，K2HP04 ? 3H201g/L， MgS04 ? 7H20(X 4g/L，生物素50 y g，维生素Bilmg，安琪酵母粉（FM802) 10g/L，安琪蛋白胨 (FP318) 10g/L〇
[0219] 1)、种子液的获得
[0220] 将上述实施例二制备的工程菌CG176, CG172, CG173和CG171分别接种到种子培养 基中，种子液培养条件为培养温度32°C，摇床转速为220r/min，培养时间8h，得到种子液， 〇D_可为20。
[0221] 2)、发酵
[0222] 将种子液按照体积百分含量为3%接种到含有终浓度为10 y g/ml氯霉素的发酵培 养基（500mL挡板三角瓶装液量为30mL)中，32°C，220r/min，培养72h，并于发酵培养6h时 加入终浓度为lmm〇l/L的异丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)进行目的基因的诱导表 达。间歇补加浓氨水控制发酵液的pH在7. 0-7. 2之间，根据残糖情况，补加浓度为400g/L 的葡萄糖母液，控制发酵液残糖在5-10g/L。
[0223] 收集发酵产物12000 Xg，离心5min，收集上清液。
[0224]3)、检测L-组氨酸含量
[0225] 采用高效液相法，具体方法如下（2, 4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相法）：取 50ii L上述上清液于2mL离心管中，加入200ii L NaHC03水溶液（0. 5mol/L，pH9. 0)和 100 y LI %的2, 4-二硝基氟苯-乙腈溶液（体积比），于60°C水浴中暗处恒温加热60min， 然后冷却至25°C，加入650ii L腿#04水溶液（0. 01mol/L，pH7. 2±0. 05,用NaOH水溶液调 整pH,放置15min过滤后可进样，进样量为15 ii L。
[0226]所用色谱柱为 C18 柱（ZORBAX Eclipse XDB-C18,4. 6*150mm，Agilent, USA);柱 温：40°C ;紫外检测波长：360nm ;流动相A为0. 04mol/L KH2P04水溶液（pH7. 2±0. 05,用 40g/L KOH水溶液调整pH)，流动相B为55 %乙腈水溶液（体积比），流动相流速为lmL/min， 洗脱过程如下表1所示：
[0227] 表1为洗脱过程
[0228]
【主权项】
1. 一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：降低出发菌中6-磷酸葡萄糖异构酶的表 达，且提高所述出发菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶和PRPP合成酶的表达，得到重组菌。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 所述降低出发菌中6-磷酸葡萄糖异构酶的表达通过如下A)或B)方式实现： A) 失活所述出发菌染色体的pgi基因；所述失活具体为敲除； B) 将所述出发菌中的pgi基因的调控元件替换为低转录和低表达活性的调控元件实 现； 所述提高所述出发菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶和PRPP合成酶的表达通过如下C)或D) 方式实现： C) 增加所述出发菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷贝数； D) 将所述出发菌染色体上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为Peftu启 动子，且将所述出发菌染色体上的PrsA基因的启动子替换为Pstjd启动子。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述构建重组菌的方法为如下I或II: I所示的方法为敲除所述出发菌染色体的Pgi基因，且增加所述出发菌中zwf-opcA基 因和prsA基因的拷贝数，得到重组菌； II所示的方法为敲除所述出发菌染色体的pgi基因，将所述出发菌染色体上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为Peftu启动子、且将所述出发菌染色体上的 prsA基因的启动子替换为Pstjd启动子。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于： 所述敲除为将含欲敲除基因Pgi的上下游同源臂的片段导入所述出发菌中进行同源 重组； 所述增加所述出发菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷贝数为将zwf-opcA基因和PrsA-MsGfto片段通过重组载体导入所述出发菌； 所述将所述出发菌染色体上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为？6；^启 动子为将含有Peftu启动子的片段导入所述出发菌中进行同源重组； 所述将所述出发菌染色体上的PrsA基因的启动子替换为Pstjd启动子为将含有Pstjd启动 子的片段导入所述出发菌中进行同源重组。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于： 所述含欲敲除基因Pgi的上下游同源臂的片段的核苷酸序列为序列表中的序列1 ; 所述zwf-opcA基因的核苷酸序列为序列表中的序列2 ; 所述PrsA-MsGfto片段的核苷酸序列为序列表中的序列3 ; 所述重组载体为将所述zwf-opcA基因和所述prSA-hisGfto片段插入表达载体得到的 载体； 所述Peftu启动子的核苷酸序列为序列表中的序列10自5'末端第635-834位核苷酸； 所述含有Peftu启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列10 ; 所述含有Pstjd启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列9。
6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于： 所述出发菌按照包括如下步骤的方法制备：将细菌染色体上的L-组氨酸合成操纵子 的启动子替换为PglyA启动子，且将所述细菌染色体上的hisG基因进行点突变，得到出发 菌； 所述L-组氨酸合成操纵子为hisEG和hisDCB; 所述PglyA启动子的核苷酸序列为序列表中序列4的第863-1052位核苷酸或序列表中 序列5的第752-941位核苷酸； 所述点突变为将所述细菌染色体的hisG基因编码的蛋白的第215位天冬酰胺变为赖 氨酸、第231位亮氨酸变为苯丙氨酸和第235位苏氨酸变为丙氨酸。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于： 所述将细菌染色体上的L-组氨酸合成操纵子的启动子替换为PglyA启动子为将含有hisEG的？81#启动子的片段和含有hisDCB的？81_启动子的片段导入细菌中进行同源重组； 所述含有hisEG的PglyA启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列4 ; 所述含有hisDCB的PglyA启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列5。
8. 根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述细菌为棒杆菌属细菌，所述 细菌具体为谷氨酸棒杆菌。
9. 由权利要求1-8中任一所述的重组菌。
10. 权利要求9所述的重组菌在制备L-组氨酸中的应用。 或一种制备L-组氨酸的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求9所述的重组菌，即得 到L-组氨酸。
【专利摘要】本发明公开了生产L-组氨酸的方法及其专用重组菌。本发明提供了一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：降低出发菌中6-磷酸葡萄糖异构酶的表达，且提高所述出发菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶和PRPP合成酶的表达，得到重组菌。本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高L-组氨酸的发酵产量的方法，观察到了可以叠加提高产量的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产L-组氨酸，便于推广应用。
【IPC分类】C12P13-24, C12R1-15, C12N1-21
【公开号】CN104845923
【申请号】CN201410050868
【发明人】温廷益, 商秀玲, 张芸, 刘树文, 梁勇
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2014年2月14日
【公告号】WO2015120775A1