isGfte分别电转化至pgi未缺失的工程菌 CG160和pgi缺失的工程菌CG161中。以P32和P33为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得 到4573bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒。
[0161]送去测序，L-组氨酸工程菌 CG173 (WT-PglyA: zPhg-hisG^r-P#: :PhisDCB/ pXMJig-zwf-opcA-prsA-hisG1^)含有质粒重组质粒 pXMJig-zwf-opcA-prsA-hisG1^，为将 重组质粒pXMJ19-zwf-〇pcA-prsA-hisG fbl:转入工程菌CG160得到的菌；
[0162] CG 1 7 1 ( ff T-PglyA: : PhisEG-h i sGfbr-PglyA: : PhisDCB- A p g i / pXMJig-zwf-opcA-prsA-hisG1^)含有质粒重组质粒 pXMJig-zwf-opcA-prsA-hisG1^，为将 重组质粒pXMJ19-zwf-〇pcA-prsA-hisG fbl:转入工程菌CG161得到的菌。
[0163] 进一步验证过表达质粒携带基因在工程菌中的表达情况。制备CG171的细胞裂 解液，进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示，泳道1和2为CG171的细胞裂解液，泳道3为 ATCC13032/pXMJ19(将pXMJ19质粒导入ATCC13032中得到)的细胞裂解液，为对照，表明过 表达质粒携带的zwf (57.5kDa)、opcA (34.8kDa)prsA (35.6kDa)和hisGfbr (30.2kDa)基 因在工程菌中成功表达。
[0164] 进一步测定工程菌CG171中6-磷酸葡萄糖脱氢酶（Zwf-opcA)的比酶活性。 测定反应体系如下（〇? 5mL) :100mmol/L Tris-HCl(pH7. 8)，200mmol/L KC1, lmmol/L NADP, 10mmol/LMgCl2, 5mmol/L6_磷酸葡萄糖（G6P)，适量的细胞裂解液。30°C,反应5min。 通过检测340nm处吸光值的变化反映产物NADPH的生成量。酶活单位（U)定义为每分钟生 成lnmol还原型烟酰胺腺噪呤二核苷酸磷酸（NADPH)所需的酶量。结果如图4所示，与野 生型菌株相比，通过质粒过表达zwf-〇pcA，6-磷酸葡萄糖脱氢酶的比活性提高了 34倍。
[0165] 实施例3、无质粒L-组氨酸高产重组菌CG324的构建
[0166] 根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的prsA基因及其上下游序列和P S()d启 动子序列分别设计引物。
[0167] 以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P48和P49为引物扩增prsA启 动子上游同源臂；以P50和P51为引物扩增P sml启动子；以P52和P53为引物扩增prsA启动 子下游同源臂。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P48和P53为引物，采用重叠延伸PCR 技术（S0E)扩增，得到1455bp的PCR产物，为含替换启动子P S()d及被替换启动子Pp,sA的上 下游同源臂的片段(序列9)。
[0168] 其中，序列9自5'末端第1-655位核苷酸为被替换启动子Pp, sA的上游同源臂，序 列9自5'末端第656-847位核苷酸为启动子PS()d，序列9自5'末端第848-1455位核苷酸 为被替换启动子ppreA的下游同源臂。
[0169] 将上述1455bp的PCR产物经Hind III和BamH I双酶切后，与经同样双酶切处理 的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5a，在含 卡那霉素（50 y g/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P13和P14为引 物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1667bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒， 并对质粒进行Hind III和BamH I双酶切鉴定，得到1455bp的为阳性。
[0170] 将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中序列9所示的核苷酸插入载体 pK18mobsacB 中得到的重组质粒，命名为 pK18mobsacB-PS()d: :PprsA。
[0171] 采用相同的方法构建同源重组质粒pK18mobsacB-Peftu: :Ptkt，具体如下：以P54和 P55为引物扩增tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子启动子上游同源臂；以P56和P57为引物扩 增启动子P eftu ;以P58和P59为引物扩增tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子启动子下游同源 臂。以P54和P59为引物，采用重叠延伸PCR技术（S0E)扩增。得到1512bp的PCR产物，为 含替换启动子P rtfu及被替换启动子Ptkt上下游同源臂的长片段(序列10)，其中，序列10自 5'末端第1-634位核苷酸为被替换启动子P tkt的上游同源臂，序列10自5'末端第635-834 位核苷酸为启动子Peftu，序列10自5'末端第835-1512位核苷酸为被替换启动子P tkt的下 游同源臂。
[0172] 将上述1512bp的PCR产物经Hind III和BamH I双酶切后，与经同样双酶切处理 的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5a，在含 卡那霉素（50 y g/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P13和P14为引 物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1724bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒， 并对质粒进行Hind III和BamH I双酶切鉴定，得到1512bp的为阳性。将阳性质粒送去测 序，结果该质粒为将序列表中序列10所示的核苷酸插入载体pK18mobsacB中得到的重组质 粒，命名为 pK18mobsacB_Peftu: :Ptkt。
[0173] 上述所用的引物序列如下：
[0174] P48:CCCAAGCTTTCCAGCAACCACCTGGAT(Hind III)
[0175] P49:AATTGGCAGCTATTAGCCTTCCTGGTTGTG
[0176] P50:CAGGAAGGCTAATAGCTGCCAATTATTCCG
[0177] P51:TTGTCCTCCTTTGGGTAAAAAATCCTTTCG
[0178] P52:GATTTTTTACCCAAAGGAGGACAACCATGACTGCTCACTGGAA
[0179] P53:CGCGGATCCCGCCATTGGGGCATCGCC(BamH I)
[0180] P54:CCCAAGCTTTCAACGATCACTGCCCAG(Hind III)
[0181] P55:GGGTAACGGCCAGTGTGTCTTAGAAAATG
[0182] P56:CTAAGACACACTGGCCGTTACCCTGCGAA
[0183] P57:TTGTCCTCCTTTTGTATGTCCTCCTGGACT
[0184] P58:GGAGGACATACAAAAGGAGGACAACCTTGACCACCTTGACGCTG
[0185] P59:CGCGGATCCAAGCGATCTCAGTGTTGT(BamH I)
[0186] P60:TGTGACCCGCTACCCGATAA
[0187] P61:CGTTACCCTGCGAATGTC
[0188] 将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-PS()d: :Pp"A电转化至L-组氨酸重组 菌CG161中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖 致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P60和P53为引物进行 PCR 扩增鉴定，得到 778bp 的为重组菌 WT-PglyA: iPh^-hisG^r-P#: :PhisI〇-Psml: :PprsA-APg i,命名为CG323。
[0189] 将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB_Petfu: :Ptkt电转化至谷氨酸棒杆菌 CG323中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死 反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P61和P59为引物进行PCR 扩增鉴定，得到874bp的为重组菌WT-P glyA: iPhi^-hisG^-P glyA. .PhisDCB Peftu. .Ptkt Psod. .PprsA -A pgi，命名为谷氨酸棒杆菌CG324。
[0190] 经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将L-组氨酸重组菌 CG161中的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子和prsA基因的启动子分别替换为谷氨酸棒杆菌 内源强启动子Peftu和PS()d，无质粒L-组氨酸重组菌CG324(WT-PglyA: :PhisE(；-hiSGfblr-PglyA: :Phi sDCB Peftu? ?Ptkt Psod? ?PprsAA pgi)构建成功。
[0191] 实施例4、枯茗酸诱导型L-组氨酸高产重组菌CG322的构建
[0192] -、枯茗酸诱导表达载体的构建
[0193] 分别以恶臭假单胞杆菌F1 (购自DSMZ公司）的基因组DNA和谷氨酸棒杆菌 ATCC13032基因组为模板，分别以P42/P43和P44/P45为引物PCR扩增阻遏蛋白基因cymR (635bp)和P hM (130bp)启动子。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以P46和P47 为引物PCR扩增含枯茗酸诱导表达操纵区片段的P glyA启动子，命名为枯茗酸诱导型启动子 Pcum (158bp)〇
[0194] 采用重叠延伸PCR将上述三个片段连接，以扩增的Ph"、 CymR和P_为模板，用P42 和P47为引物进行PCR扩增，得到923bp的PCR产物为PhM- CymR-P_片段(序列8 )。
[0195] 其中，序列8自5'末端第1-635位核苷酸为cymR,序列8自5'末端第636-765位 核苷酸为P h(M，序列8自5'末端第766-923位核苷酸为Peum (枯茗酸诱导型启动子)。
[0196] 将上述PCR产物经Nar I和Hind III双酶切后，与经同样双酶切处理的谷氨酸 棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒PXMJ19连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌 DH5 a，在含氯霉素（20 y g/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P28和 P33为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到923bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子 提取质粒，并对质粒进行Nar I和Hind III双酶切鉴定，得到923bp的为阳性。经进一步 序列测定分析，该质粒为将Pta-cymR-P^片段(序列8)插入质粒pXMJ19的Nar I和Hind III酶切位点间得到的载体，命名为重组质粒pWYE1233 (图6所示)。
[0197] 上述所用的引物序列如下：
[0198] P42:AGTCATGGCGCCGATCGCGAACTTAAAGCGC(Nar I)
[0199] P43:GCTTTGTTTCATTTTCCTCCTGTTGGTACCACTAGTACTCAGGT
[0200] P44:AACAGGAGGAAAATGAAACAAAGCCGGTGG
[0201] P45:CCACGTCTTTTAGAAAAATCAAAAGTTGCC
[0202] P46:TCAAAAGTTGCCTAAAAGACGTGGGCACGT
[0203] P47:CCCAAGCTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTT