蛋白与丽S蛋白（SEQ ID N0:2)功能等价，这些DNA片段就属于本
【发明内容】
。这些DNA 片段所编码的氨基酸序列应当与本发明丽S蛋白氨基酸序列（SEQ ID N0:2)高度同源；这 里所指的高度同源，意味着两者之间在能够匹配的区段上，氨基酸序列的等同率（sequence identity)至少50%或更高，优选70%或更高，更优选90%或更高（比如95%、96%、97%、 98%和99%或更高）。
[0015] 氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定（Altschul et al. 1990. Journal of Molecular Biology 215:403-410 ；Karlin and Altschul.1993. Proceedings of the National Academy of Sciences 90:5873-5877)。根据此算法，衍生了 BLASTN、 BLASTP、BLASTX、TBLASTN 和 TBLASTX 算法（Korf et al./ed. 2003. An essential guide to the basic local alignment search tool:BLAST/0' Reilly Associates/ Sebastopol :P339)。BLASTN用核酸序列搜索核酸序列库；BLASTP用蛋白质序列搜索蛋白质 序列库；BLASTX执行核酸序列和蛋白质序列库的比对，核酸序列在比对之前自动按照六个 读码框翻译成蛋白质序列；TBLASTN执行蛋白质序列和核酸序列库的比对，核酸序列库中 的序列按照六个读码框翻译后与蛋白质序列进行比对搜索；TBLASTX执行核酸序列对核酸 序列库在蛋白质水平的比对，两者在搜索之前都翻译成为蛋白质再进行比对。以上各算法 在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI， blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)网站有专门介绍。
[0016] 基因组DNA或cDNA文库文库的筛选可能会用到Southern印迹杂交技术 (Southern. 1975. Journal of Molecular Biology 98:503-517);主要包括两个过程，一是 将待测定的核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物，二是固定于膜上的 核酸与标记的探针退火杂交；在退火杂交后的洗膜过程中，通过调节温度、离子强度和冲 洗时间来控制实验的严格性，随着SCC溶液浓度的降低（20 X、10 X、6 X、2 X、I X、0. 5 X、 0· 2Χ、0· IX)、温度的升高（42°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C )和冲洗时间的延长 (lmin、2min、5min、lOmin、15min、20min、30min)，严格性逐渐升高；本发明所指的"在严格条 件下"意味着在在洗膜过程中，优选SCC溶液为IX或更低、温度为55°C或更高、冲洗时间 为IOmin或更长。
[0017] 从应用角度出发，本发明WMS基因 （SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:6)或其同源基因的 DNA片段，当导入正常可育植物后，很可能诱导雄性不育表型。换句话说，对于本发明WMS基 因 （SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:6)或其同源基因的DNA片段或该DNA片段的重组载体，将 它们导入具备形成正常可育植株能力的细胞，转基因细胞则分化再生形成雄性不育的转基 因植株，从而将可育植物转换为雄性不育植物。由于雄性不育植物无法自交结实，需要借助 雄性可育植株的花粉完成授精，方能维持世代交替。反过来，也可以创制WMS基因 （SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:6)或其同源基因表达抑制的转基因植物。这里所指的"表达抑制"包括 DNA转录水平和cDNA翻译水平两个层面，又包括完全抑制和部分抑制两种程度。比如说，根 据本发明丽S基因 （SEQ ID NO: 1)或其同源基因设计能够形成反义RNA(antisense RNA， 8成嫩）或形成发夹结构1?嫩〇^1印1111?嫩，1^1?嫩）的0嫩片段，或将它们插入合适质粒载 体，将以上DNA片段或其承载质粒导入携带丽S基因 （SEQ ID N0:4)或其同源基因的植株 细胞，转基因细胞分化形成正常可育的转基因植株，从而将雄性不育植物转换成正常可育 植物。当把以上DNA片段或其承载质粒导入具备形成正常可育植株能力的细胞，转基因植 株的育性原则上不受影响；利用这类转基因植株的花粉给携带WMS基因 （SEQ ID N0:4)或 其同源基因的雄性不育植株授粉，后代则能分离出携带丽S基因 （SEQ ID N0:4)或其同源 基因但雄性可育的植株。由于雄性不育植物无法自交结实，对于自花授粉植物，如何保持雄 性不育性状存在难度，对于携带其它优异性状的雄性不育系的保持更值得考虑。利用针对 WMS基因 （SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:6)或其同源基因的asRNA或hpRNA等技术，可恢复 WMS基因的雄性不育功能，使得携带WMS基因或其同源基因的植株可以自交结实，有利于优 异性状的保持和利用。
[0018] 对于本领域的技术人员，asRNA技术常被用来抑制植物内源基因的表达。如依据 本发明WMS基因序列（SEQ ID NO: 1)，针对WMS cDNA的5'端非翻译区（5'untranslated region，5UTR)设计的asRNA将可能有效抑制翻译过程，但针对WMS cDNA的编码区（coding DNA sequence，CDS)或 3' 端非翻译区（3, untranslated region，3UTR)设计的 asRNA 同 样可能奏效。可见，WMS基因的编码区和非翻译区都可选作设计asRNA的区段。本发明涉 及的asRNA技术，可以采用适合启动子驱动反义核酸片段的转录，如玉米泛素启动子（Ubi) (Christensen et al. 1992. Plant Molecular Biology 18:675-689)和 WMS 基因启动子 (SEQ ID N0:5);在反义核酸片段的3'端接入带有转录终止信号的终止子片段；最后利用各 种技术将构建的asRNA表达盒或asRNA表达载体导入目标植物。制备反义核酸片段，优选 与被转化植物中内源基因在全长范围或部分片段互补的DNA模板，反义核酸与内源基因之 间不见得完全互补，只要所设计的asRNA具有抑制内源目标基因表达的效果。对比所形成 的asRNA和目标基因 mRNA之间的互补程度，优选互补程度在90%或以上，更优选互补程度 在95%或以上（比如96%、97%、98%、99%或以上）的反义核酸片段。为了有效抑制内源 目标基因的表达，所选反义核酸片段应当包含至少15bp或以上，优选IOObp或以上，更优选 500bp或以上，但反义核酸片段的长度一般不超过5kb，优选不超过2. 5kb的反义核酸片段。
[0019] 利用内源基因本身同样可以实现对内源基因的表达抑制（Hammond et al. 2001. Nature Reviews Genetics 2:110-119 ;Paddison et al.2002.Genes&Development 16:948-958)。为了在植物中形成hpRNA，需要设计转录后即能形成hpRNA并可引起RNA干 涉（RNA interference，RNAi)的DNA表达盒，该DNA表达盒包含适合的启动子（如玉米Ubi 启动子）和有效的终止子。应用hpRNA或RNAi，可以有效地抑制本
【发明内容】
DNA片段的表 达。
[0020] 通过导入与内源基因序列相同或相似的DNA片段也可能造成共抑制 (co-suppression)现象，即外源导入基因和植物内源基因的表达同时抑制（511171:11.1997· Current Biology 7:R793_R796;Ketting and PlasterL 2000. Nature 404:296-298)。为 抑制丽S基因 （SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:6)或其同源基因，可将承载丽S或其同源基因 的表达载体导入携带WMS或其同源基因的植物，比较转基因植株和未转基因对照植株的雄 蕊发育情况，选择雄性不育表型减弱的转基因植株。为实现共抑制，导入基因序列不必等同 于内源基因，但导入基因和内源基因之间核苷酸序列的等同率至少70%或以上，优选80% 或以上，更优选90%或以上（比如95%、96%、97%、98%、99%或以上）。序列等同率采用 前面介绍的算法判定。
[0021] 导入对植物内源基因有显性抑制（dominant-negative)作用的核酸片段，也可达 到抑制植物内源基因表达的效果。假设某基因具有显性抑制功能，该基因的表达会消除或 降低目标基因的活性。比如，在短柄草中，微小RNA分子（microRNA，miRNA)miR5200特异 靶标开花基因 FT，造成FT mRNA的切割；在短柄草中过量表达miR5200,有效下调FT mRNA 的积累水平，转基因植株的开花受阻（Wu et al. 2013. Plant Cell 25:4363-4377)。对于 丽S基因或其同源基因，或存在与之作用的miRNA或干扰小RNA(small interfering RNA， siRNA)，或可以设计与之作用的人工miRNA(artificial microRNA，amiRNA);合理控制特异 小RNA分子（amiRNA、miRNA和siRNA)的合成，将会影响WMS基因或其同源基因 mRNA的积 累，调控植物雄蕊育性。
[0022] 本发明对用于开展植物细胞转化的质粒载体没有限制，只要它们在植物细胞中能 够表达承载基因。比如，使用携带组织特异性启动子（如WMS基因启动子，SEQ ID N0:5)、组 成型启动子（如玉米Ubi启动子）或诱导型启动子的载体。本发明所指的"植物细胞"形式 多样，包括各类具备生命全能性的单细胞、多细胞、植物组织或器官，可以是悬浮培养细胞、 原生质体细胞，也可以是植物切片组织、植物愈伤组织，它们统一的特点是通过分化再生或 无性繁殖能形成植株或部分植株。本发明所指的"植物细胞"还涵盖各种植物来源的细胞， 比如粮食作物、花丼植物、蔬菜和林木，它们统一的特点是通过分化再生或无性繁殖能形成 植株或部分植株。
[0023] 对于本领域的技术人员，可以使用各种手段将质粒载体导入植物细胞，比如聚乙 二醇（polyethylene glycol，PEG)法，电穿孔（electroporation)法，农杆菌介导方法，基 因枪轰击法等，并将转化细胞发展成为转基因植株。在植物领域，各种转基因技术趋向成 熟，并得到广泛应用。比如，利用PEG方法将基因导入原生质体然后再生成苗，或利用电穿 孔方法将基因导入原生质体然后再生成苗，或利用基因枪轰击方法将基因导入植物细胞然 后再生成苗，或利用农杆菌介导方法将基因导入植物细胞然后再生成苗。以上这些方法均 适用于本发明领域。
[0024] 对于携带本发明DNA片段的转基因植株，进而通过有性或无性方式得到它们的有 性后代（如种子）、无性克隆（如不定枝、愈伤、原生质体等）、分生组织（如芽点、茎尖、根 尖等），大量繁殖转基因植株。因此，本发明涵盖：a)所有携带本
【发明内容】
DNA片段的转基 因植物细胞；b)携带a)项转基因细胞的植株；c)来自b)项植株的无性克隆和植株后代等， 只要它们仍携带a)项转基因细胞；d)来自b)和c)项内容的植物种子、植物组织或植物器 官等，只要它们仍携带a)项转基因细胞。
[0025] 利用以上方式获得的转基因植株或携带转基因细胞的植株，其雄蕊育性在理论上 将有别于野生型植株。比如，通过基因互补技术，将小麦WMS基因 （SEQ ID N0:4)或其同源 基因导入正常可育植株，将可能创制雄性不育表型；通过反义核酸或同类技术，抑制植物内 源WMS基因或其同源基因，将可能把本来雄性不育的植物转变为正常可育的植物。因此，可 以利用本
【发明内容】
调控植物雄蕊育性，比如利用植物获得性雄性不育，可以遏制自花授粉 (self-pollination)、强制开放授粉（cross-pollination)，充分发挥杂种优势，创新杂交 制种技术。
[0026] 本发明还提供了具有花药特异性驱动活性的启动子DM片段，比如WMS基因 （SEQ ID N0:4)起始密码子上游的基因组DNA(SEQ ID N0:5)。本发明中花药特异性启动子DNA 片段包括丽S基因启动子（SEQ ID NO: 5)或与之同源的DNA片段；与丽S基因启动子（SEQ ID N0:5)相比，同源DNA片段可能存在一个、数个或数十个碱基的替换、删除、或插入等现 象，只要它们仍具有花药特异性启动子的活性。本发明启动子DNA片段的植物来源不限，优 选单子叶植物，更优选禾本科植物，最优选小麦族植物，只要这些DNA片段呈现花药特异性 启动子的活性。
[0027] 如果获得了编码本发明WMS蛋白或其同源蛋白的DNA片段，也可利用它们捕获具 有花药特异性启动子活性的DNA片段。比如，利用WMS基因组转录区段（SEQ ID N0:6)或 其部分片段作为探针，筛选不同植物来源的基因组DNA文库，有可能获得WMS基因或其同源 基因的上游启动子片段。由于本发明认定的启动子具有花药特异性驱动的活性，可以利用 它们驱动任意基因 （arbitrary gene)在花药组织的特异性表达，具有良好的应用前景和产 业化价值。本文所指的"任意基因"包括编码蛋白的DNA片段和非编码蛋白的DNA片段（如 能形成amiRNA、asRNA、hpRNA、miRNA、siRNA和呈现核酶活性RNA的DNA片段），当连接到 丽S基因启动子（SEQ ID NO: 5)之后，这些DNA片段在丽S基因启动子的作用下，在花药组 织特异性表达。
[0028] 通过 PCR 克隆（Saiki et al. 1985. Science 230:1350-1354)、DNA 重组和人工合 成（Kosuri and Church. 2014. Nature Methods 11:499-507)等手段也能获得类似本发明 丽S基因启动子核苷酸序列（SEQ ID NO: 5)的DNA片段。比如，针对本发明核苷酸序列（SEQ ID N0:5)设计PCR引物，从携带丽S基因或其同源基因的物种上扩增目标DNA片段，从而分 离到类似本发明核苷酸序列（SEQ ID NO: 5)的DNA片段。
[0029] 对于本领域的