和美国西格玛奥 德里奇公司（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO, USA)，植物组织培养基购自美国植物技术公 司（PhytoTechnology Laboratories，Overland Park，KS，USA)，微生物培养基购自美国 BD 公司（Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ，USA)，抗生素和双丙氨勝 (bialaphos)购自美国 GoldBio 公司（Gold Biotechnology，St. Louis，M0，USA)。本发明 所涉及的PCR引物及序列见表1。
[0079] 表1 :本发明中应用到的PCR引物
[0080]
[0081] 备注：为方便基因克隆，PCR引物WMS-FPll携带限制性内切酶NotI位点，另外 在PCR引物丽S-FPll中添加了限制性内切酶AscI位点，下划线标注酶切位点识别序列。 #RT-PCR引物Actin-FPl和Actin-RPl在小麦和短柄草上都工作。
[0082] 实施例1 :利用转录组学鉴定'鲁麦15Ms2'花药特异性表达基因
[0083] RNA测序（RNA-seq)利用高通量测序技术直接测定样本衍生的全部或部分cDNA分 子。本发明通过RNA测序对比了小麦近等基因系'鲁麦15'和'鲁麦15 Ms2'各自花药组织的 转录组。当小麦主茎或分蘖的旗叶和倒二叶之间的叶环距达到4公分，花药大致处于减数 分裂I前期（本文称减数分裂初期），收集该主茎/分蘖的幼穗，采集幼穗中部5个小穗各自 第一和第二朵小花的花药。对于'鲁麦15'和'鲁麦15 Ms2'，分别收集了 3个生物学重复，每 个重复大约150个花药。总RNA的提取采用TRIzol试剂及相关方法（Life Technologies， Grand Island，NY，USA)。RNA测序涉及的文库构建（优选500bp左右的mRNA碎片）和高 通量双端测序（HiSeq 2500，Illumina，San Diego, CA，USA ;paired_end，PE125)由北京贝 瑞和康生物技术有限公司承担Oerry Genomics Company，Beijing，China)。
[0084] 对于RNA-seq原始数据，首先剔除接头信息、低质量碱基（Q值< 3的碱基，占整 个read的50%以上）和未测出碱基（N比例大于3%)，获得有效数据；利用Trinity软件 (Haas et al. 2013. Nature Protocols 8:1494-1512)开展有效数据的从头拼装；使用 RSEM 算法（Li and Dewey. 2011. BMC Bioinformatics 12:323)估算样品中基因表达丰度；利用 edgeR 程序包（Robinson et al. 2010. Bioinformatics 26:139-140)计算样品中转录本表 达的差异。通过比较'鲁麦15'和'鲁麦15Ms2'各自的花药转录组数据，发现个别基因在'鲁 麦15 Ms2'中的转录水平远超过'鲁麦15'。本发明鉴定到一个未知基因，其序列如SEQ ID NO: 1所示；该基因在'鲁麦15Ms2'花药中表达，但在'鲁麦15'花药中未被检测到。发明人 预测该基因 （SEQ ID N0:1)可能影响小麦雄蕊育性，暂定名为Wheat Male Sterility(WMS) 基因，并围绕该基因开展了功能研宄。
[0085] 实施例2 :小麦丽S基因全长cDNA的验证
[0086] 为验证WMS基因的全长（full-length) cDNA，使用TRIzol试剂提取了 '鲁麦 15Ms2' 幼糖的总 RNA，然后利用 RevertAid Frist Strand cDNA Synthesis 试剂盒（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)制备了 cDNA模板。采用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE)分离 WMS 基因 （SEQ ID NO: 1)全长 cDNA 的 5' 和 3' 末端，使用 SMARTer RACE cDNA Amplification试剂盒（Clontech Laboratories，Mountain View，CA，USA)，操作方法参照试剂盒说明书。5'端RACE PCR的嵌套引物为WMS-RPl和 WMS-RP2,其中 WMS-RP2 为 WMS-RPl 的巢式引物（nested primer) ;3' 端 RACE PCR 的嵌套引 物为丽S-FPl和丽S-FP2,其中丽S-FP2为丽S-FPl的巢式引物。对RACE PCR产物进行测 序，证实了丽S基因全长cDNA序列（SEQ ID NO: 1)两端的完整性，说明RNA测序及序列拼 装高度可靠。为此，根据WMS基因全长cDNA序列（SEQ ID N0:1)设计了 PCR引物WMS-FP3 和WMS-RP3,从'鲁麦15Ms2'的幼穗cDNA样本中扩增到WMS基因的全长cDNA克隆，该克隆 的序列和本发明得到的丽S基因核苷酸序列（SEQ ID N0:1)相同。丽S基因全长cDNA共 l，485bp，包含一个882bp的开放阅读框（open reading frame，0RF);在起始密码子的上 游，有两个框内终止密码子（in-frame stop codon)，预示当前ORF相对可靠、可能编码真正 意义上的丽S蛋白。据此，发明人将起始密码子或当前ORF上游的DNA片段认定为丽S基 因启动子区域。
[0087] 实施例3 : '鲁麦15Ms2'基因组BAC文库的构建
[0088] 为方便基因组DNA的克隆，创建了 '鲁麦15Ms2'基因组DNA的细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome，BAC)文库，构建方法参照已发表的文献（Grotewold/ ed.2003. Plant Functional Genomics/Humana/Totowa:3-19 ；Shi et al.2011. Plant Methods 7:33)。简而言之，从'鲁麦15Ms2'叶片中提取大分子量基因组DNA (high-molecular weight，HMW)，经限制性内切酶HindIII部分酶切，利用1 %的琼脂糖凝胶及脉冲电泳 (pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)分离酶切产物，从中纯化片段大小介于 100-300kb的DNA，重复脉冲电泳和片段纯化步骤，将经过两次纯化获得的DNA片段插入BAC 载体pIndig〇BAC536-S (经HindIII完全酶切和末端去磷酸化处理），然后转化大肠杆菌感 受态细胞（E coli DHlOB TlPhage-Resistant Cells，Invitrogene，Carlsbad，CA，USA)，并 用 LB 培养基（添加了 chloramphenicol 12. 5mg/L，X_gal 80mg/L，IPTG lOOmg/L)筛选转 化子（transformant)，最终挑取白色菌落于384孔板保存。
[0089] '鲁麦15Ms2'基因组BAC文库包含706, 176BAC克隆、保存在1，839个384孔板中。 根据随机挑选的337个BAC克隆检测文库质量，文库空载率为0. 5%，单克隆的平均插入片 段124. 6kb，整个文库覆盖小麦全基因组（按16Gb计算）约5. 5倍（表2)。
[0090] 表2 : '鲁麦15Ms2'基因组DNA BAC文库
[0091]
[0092] 表2说明成功构建了 '鲁麦15Ms2'基因组BAC文库。
[0093] 实施例4 : '鲁麦15Ms2' BAC文库的筛选、BAC克隆的测序及序列分析
[0094] 为建立'鲁麦15Ms2' BAC文库的筛选体系，首先复制了整套基因组文库，将复制后 的单块384孔板中的菌液混合（板内混合），并利用ZR BAC DNA Miniprep试剂盒（Zymo Research Corporation，Irvine，CA，USA)提取板内混合菌液中所有BAC质粒的初级池 (primary pool)，每10个BAC初级池再等量混合形成BAC质粒的高级池 （super pool)。针 对整套'鲁麦15Ms2'基因组BAC文库，共制备了 1，839个BAC质粒初级池和184个BAC质粒 尚级池。
[0095] 为获得携带WMS基因的BAC克隆，根据WMS基因全长cDNA(SEQ ID NO: 1)设计了 多套PCR引物，测试不同引物组合在'鲁麦15'和'鲁麦15Ms2'基因组DNA上的扩增效果， 确定了适用引物组合丽S-FP4和丽S-RP4。该引物组合在'鲁麦15'上扩增1个条带，但 在'鲁麦15 Ms2'上扩增2个条带；在1 %的琼脂糖凝胶上，'鲁麦15'来源的条带与'鲁麦 15Ms2'来源的长条带迀移位置相同（图1)。由此可见，'鲁麦15 Ms2'来源的短条带为特异条 带，可能来自决定'太谷核不育小麦'雄性不育的Ms2基因区段。为验证短条带和雄性不 育性状的关系，本发明检测了大约5, 000株来自"鲁麦15Ms2/鲁麦15"组合的F1单株，其中 正常可育和雄性不育的植株数目相当，而短条带的出现和雄性不育性状完全连锁。因此， WMS-FP4和WMS-RP4可以用作鉴定"鲁麦15Ms2/鲁麦15"后代植株雄蕊育性的分子标记，命 名为 WMS-EM (exon-derived marker)。
[0096] 利用WMS-EM标记筛选了 '鲁麦15Ms2'BAC质粒的高级池和初级池，并利用对应阳性 初级池的384孔板开展了菌液PCR，确认了阳性BAC单克隆的位置，并获得阳性BAC单克隆 质粒。针对丽S-EM标记，筛选到3个阳性BAC单克隆（P89、P1076和P1593)(图2)，其中 BAC克隆P1593对应短条带，而BAC克隆P89和P1076则对应长条带（图1)。考虑到Ms2 基因区段在'鲁麦15 Ms2'中处于杂合状态，初步推测，P1593来源于携带显性Ms2基因的小 麦4D染色体，而P89和P1076则来源于携带隐性ms2基因的小麦4D染色体。如前所述， 丽S-EM标记在P1593上的基因型（短条带）与"鲁麦15Ms2/鲁麦15"后代植株的雄蕊不育 性状完全连锁，但WMS-EM标记在P89和P1076上的基因型（长条带）则与雄蕊不育性状不 连锁。据此推测，P1593携带显性丽S基因，而P89和P1076则携带隐性wms基因。采用新 一代高通量测序技术，对以上3个阳性BAC克隆（P89、P1076和P1593)进行测序。BAC质 粒测序涉及的文库构建（优选300bp左右的DNA碎片）和高通量双端测序（HiSeq 2000， Illumina ;PE100)由北京贝瑞和康生物技术有限公司承担。
[0097] 对于获得的原始序列数据，首先剔除其中的接头信息、低质量碱基（Q值< 5的碱 基，占整个read的50%以上）和未测出的碱基（N比例大于10% );利用Phrap软件包Cross Match 软件（ http://www.phrap.org/)去除剩余序列中的 BAC 载体（pIndigoBAC536_S) 序列和大肠杆菌基因组序列，获得有效数据；利用拼接软件ABySS 1.5. 2(Simps〇n et al. 2009. Genome Research 19:1117-1123)对有效序列数据进行De novo拼接；在此过程 中，对比不同K-mer值（21-91)所对应的N50值，最终选择K-mer值为41时的拼接序列。对 比发现，P89和P1076共享54, 056bp的相同序列，说明二者代表同一条染色体，但二者的序 列与P1593的序列之间多态性丰富。对照WMS cDNA序列（SEQ ID N0:1)，发现P89，P1076和 P1593分别携带对应丽S基因全长cDNA的基因组转录区段。根据P1593预测的丽S cDNA与 本发明WMS基因全长cDNA(SEQ ID N0:1)的序列相同，但与P89/P1076预测的wms cDNA存 在 11 个单核苷酸多态性位点（single neucleotide polymorphism，SNP)。P89 和 P1076 克 隆中丽is基因的上游序列较长（SEQ ID N0:3)(图2)，估计该基因的启动子序列完整；P1593 克隆中丽S基因位于插入片段的一端，插入断点位于丽S基因启动子区域，因此P1593克隆 中的WMS基因启动子区域序列有待拓展（图2)。
[0098] 为拓展丽S基因启动子区域序列，根据现有丽is基因启动子序列（SEQ ID NO:3)设 计了多套PCR引物，测试不同引物组合在'鲁麦15'和'鲁麦15Ms2'基因组DNA上的扩增效 果，确定了适用引物组合丽S-FP5和丽S-RP5。该引物组合在'鲁麦15'基因组DNA扩增2 个条带，但在'鲁麦15 Ms2'基因组DNA扩增3个条带；在1 %的琼脂糖凝胶上，'鲁麦15'来 源的2个条带与'鲁麦15Ms2'来源的最长条带和最短条带迀移位置相同，而'鲁麦15 Ms2'来 源的中间条带为特异条带（图1)，可能来自决定'太谷核不育小麦'雄性不育的Ms2基因 区段。然后利用"鲁麦15 Ms2/鲁麦15"组合的F1群体证实了中间条带和雄性不育性状之间 紧密连锁。因此，WMS-FP5和WMS-RP5可以用作鉴定"鲁麦15 Ms2/鲁麦15"后代植株雄蕊育 性的分子标记，命名为WMS-PM (promoter-derived marker)。利用WMS-PM标记筛选了'鲁 麦15Ms2' BAC质粒的高级池、初级池和384孔板，额外鉴定到阳性BAC克隆P204(图1和图 2)，WMS-PM标记在P204克隆对应中间条带，说明该克隆来源于携带显性WMS基因的小麦4D 染色体。对P204质粒进行高通量测序和序列组装，发现P204与P1593重叠1，212bp，P204 和P1593两克隆拼接后的序列包含WMS基因组全长表达框架（SEQ ID NO:4)。序列比较显 示，本发明认定的隐性wms基因组全长表达框架（SEQ ID NO: 3)为8, 657bp，与之对应的显 性WMS基因组全长表达框架（SEQ ID N0:4)为10,592bp，两者之间的长度差异主要归结于 WMS基因启动子区段存在转座子插入。
[0099] 实施例5 :小麦丽S基因的花药特异性表达分析
[0100] 利用反转录 PCR(r