everse-transcription PCR，RT-PCR)和定量 PCR(qRT-PCR)测 定了 '鲁麦15Ms2 '不同组织中丽S基因 mRNA的积累。RT-PCR使用丽S基因引物丽S-FP6 和丽S-RP6,还涉及内源参照基因 Actin (肌动蛋白基因），应用到PCR引物Actin-FPl和 Actin-RPl。由于'鲁麦15Ms2'中丽S/wms位点杂合，通过对RT-PCR产物的克隆和测序， 明确了显性丽S mRNA占据了表达产物（约98 % )。qRT-PCR使用丽S基因引物丽S-FP7 和丽S-RP7 及内源对照基因引物 Actin-FP2 和 Actin-RP2 (Fu et al. 2007. Molecular Genetics and Genomics 277:301-313)。结果表明，WMS基因只在小麦花药中特异表达，在 颖片（glume)、叶片（leaf)、外稃（lemma)、内稃（palea)、雌蕊（pistil)、根系（root)和莖 段（stem)中均检测不到（图3A);根据qRT-PCR结果，WMS基因在小麦花药中的表达较其它 测试过的组织高出上百倍（图3B)。
[0101] 实施例6 :丽S基因启动子的认定和功能分析
[0102] 真核生物中，通常将起始密码子上游一定长度的基因组DNA用作基因启动子。本 发明通过比较丽S和丽is两基因预测起始密码子上游的基因组序列来认定WMS基因启动 子。对于未知功能基因，通常克隆起始密码子上游2-4kb的片段，以期获得完整并具有活性 的启动子。通过分析wms基因组全长表达框架（SEQ ID NO: 3)和WMS基因组全长表达框架 (SEQIDN0:4)，本发明选取了预测起始密码子上游3,502bp( Wms)和 5,578bp(WMS)作为候 选启动子序列。对比候选启动子区段发现，所选区段最上游的2, 414bp在wms和WMS基因 之间序列相同；而wms候选启动子剩余的1，088bp则对应WMS候选启动子剩余的3, 164bp， 这种差异主要是由于WMS候选启动子存在两个转座子插入，分别为275bp和1，791bp ;除了 转座子插入之外，对应wms候选启动子剩余的1，088bp区段，wms和WMS两基因候选启动子 之间也存在十多个SNP。初步推测，wms和WMS两基因各自的启动子应当从最上游相同序列 (2, 414bp)的某个位置开始。为保险起见，本发明选择保留最上游2, 414bp的相同序列，连 同随后的序列一起认定为启动子。因此，本发明认定的显性WMS基因启动子为5, 578bp(SEQ ID NO: 5)，该启动子应当具有花药特异性驱动的活性。
[0103] 为确认WMS基因启动子（SEQ ID NO: 5)的功能，本发明构建了 2个载体：受体载体 (Destination vector) PC613 和 Pwms : : GFP 表达载体 PC966 (图 4A)，这里 Pwms代表 WMS 基因启 动子（SEQ ID N0:5)。PC613和PC966载体中GFP融合表达框架来自pGWB4载体（Nakagawa et al.2007.Journal of Bioscience and Bioengineering 104:34-41) ;PC613 和 PC966 两载体的质粒骨架为PCAMBIA1300。在载体PC966中，Pwms和GFP之间的连接序列为5' -TA GGGAGAGGCGCGCCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCATG-3'，5' 端的 TAGGGAG 碱基为 WMS 基 因启动子（SEQ ID NO: 5)的末端，3'端的ATG代表GFP基因的起始密码子。利用PC613和 PC966分别转化小麦的不同花器组织（外稃、内稃、雌蕊和雄蕊），基因强轰击转化方法参见 实施例9。瞬时表达三天后，在立体荧光显微镜下观察GFP绿色荧光，对照质粒PC613的转 化未造成绿色荧光，而质粒PC966 (携带Pwms: :GFP表达盒）的转化则产生了 GFP荧光信号， 尤其是在花药组织（图4B)。可见，本发明丽S基因启动子（SEQ ID N0:5)具有启动子活 性，能驱动GFP基因在花药组织的表达。
[0104] -方面为了开展小麦遗传互补实验（实施例9)，另一方面为了研宄丽S基因启 动子（SEQ ID N0:5)的功能，本发明克隆了 "鲁麦15Ms2"WMS基因组全长表达框架（SEQ ID NO: 7)，并构建了携带WMS基因组全长表达框架的双元表达载体PC976(图4A)。该载体的 创建办法以及小麦基因枪转化参见实施例9。值得强调的是，PC966和PC976中使用了长度 和序列完全一样的丽S基因启动子（SEQ ID NO: 5)。利用携带丽S基因组全长表达框架的 小麦转基因植株JZ7-2 (表3)，来确认了丽S cDNA表达的组织特异性，这里应用了丽S基 因引物丽S-FP6和丽S-RP6以及内参基因引物Actin-FPl和Actin-RP 1。结果发现本发明 认定的丽S基因启动子（SEQ ID N0:5)能够驱动丽S基因在小麦花药组织的特异表达，而 在颖片、叶片、外稃、内稃、雌蕊和茎段中均未检测到WMS cDNA的表达（图4C)。综上所述， WMS基因启动子（SEQ ID NO: 5)具备花药特异性驱动的活性。
[0105] 由此可见，构建WMS基因启动子（SEQ ID NO:5)和目的基因表达盒，将其导入植物 (如粮食作物、花丼植物，蔬菜和林木等），可能会实现目标基因的花药特异性表达，这对于 创建植物雄性不育等性状非常重要。
[0106] 实施例7 : '鲁麦15Ms2' EMS突变群体的创建
[0107] 为确认显性WMS基因的功能，本发明利用EMS水溶液处理了 11，000粒"鲁麦15Ms2/ 鲁麦15"组合的F1种子，经温室种植和分子标记筛选，保留了携带显性丽S基因的1，200 株突变个体（M 1世代）。群体的创建如下：将400粒种子（F 1或M ^种子）浸泡在100毫升 EMS水溶液（87. 4 μ M)，放置于水平摇床震荡IOh (150rpm，25°C )，然后在室温下用自来水冲 洗4h;将处理过的种子（M1种子）摆放到湿润滤纸，一起放入敞口塑料盆（长X宽X高 =40cmX3〇 CmX2〇Cm)，然后覆上一层保鲜薄膜，在温室下催芽8d ;将长势健康、根系健全 的幼苗移栽到营养土中，在春化室（4°C，12h光照）处理6w;将幼苗转移到温室生长，利用 丽S-EM标记鉴定突变单株的基因型，只保留携带显性丽S基因的植株，共1，200株％植 株）。为区分主茎和分蘖，在植株拔节期间，将单株上发育最快、长势最强的茎杆作为主茎， 并挂牌标注。
[0108] 实施例8 :利用TILLING技术筛选'鲁麦15Ms2' EMS突变群体
[0109] 实施例4结果表明，"鲁麦15Ms2/鲁麦15"后代中显性丽S基因和雄性不育性状完 全连锁。由于显性WMS基因的存在，现有的1，200株乂突变个体应当表现雄性不育。考虑 到WMS/wms区段在'鲁麦15 Ms2'中处于杂合状态，如果显性WMS基因发生点突变并且该突变 影响基因功能，在M1世代将可能看到突变表型。为此，实验统计了该突变群体M ^直株上所 有麦穗的育性情况，总计3, 138个麦穗，其中20麦穗表现雄性可育的特征（图5)，主要表现 为花药正常生长、花药外挂、花粉散粉和部分结实等现象。
[0110] 为开展TILLING筛选，需提取植物基因组DNA，这里采用十二烷基肌氨酸钠 (Sarkosyl)方法（Yuan et al. 2012. Journal of Genetics and Genomics 39:587-592) 〇 针对整个群体，首先收集单株主茎旗叶组织，获得基因组DNA，利用ND2000微量分光光度计 (Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA)测定 DNA 浓度，统一调整为 IOOng/ μ 1。分别 移取部分DNA样品，每4个DNA样品等量混合成池（四重池），于96孔板保存。对于鉴定到 的20个可育麦穗，分别提取与之对应的旗叶组织DNA ;当可育麦穗同时为主茎穗时，不需要 重复提取；移取部分DNA样品，分别与野生型'鲁麦15Ms2'的DNA等量混合成池（二重池）， 同样于96孔板保存。
[0111] WMS基因突变个体的筛选采用改良的TILLING技术（Uauy et al. 2009. BMC Plant Biology9:115)。利用普通聚丙烯酰胺胶电泳鉴定突变个体需要两轮筛选过程。第一轮 筛选又涉及两轮PCR反应：a)利用长片段KOD FX试剂盒（Toyobo Co.，Osaka，Japan)扩 增显性丽S基因，PCR引物丽S-FP8和丽S-RP10 ;反应体系为50 μ 1，包括IXPCR缓冲液 (KOD-Plus-Neo)，硫酸镁 I. 5mM, dNTPs 各 0· 2mM,引物各 0· 2 μΜ，基因组 DNA 200ng，IU 聚 合酶（KOD-Plus-Neo)，加双蒸水补足体系；PCR反应条件为，初始变性94°C、2min，35个循 环（变性98°C、lOsec，退火60°C、30sec，延伸68°C、6min)，终延伸68°C、IOmin ;用双蒸水稀 释PCR产物500倍，用作第二轮PCR反应的模板；b)第二轮PCR的反应体系为25 μ 1，包含 I XPCR 缓冲液（氯化镁 I. 5mM，dNTPs 各 0· 2mM ;Promega，Madison，USA)，引物各 0· 2 μ Μ，第 一轮稀释后的PCR产物2 μ 1，IU聚合酶（Promega)，加双蒸水补足体系；将全长5, 925bp的 模板分三段扩增，第一段使用PCR引物丽S-FP8和丽S-RP8,第二段使用PCR引物丽S-FP9 和WMS-RP9,第三段使用PCR引物WMS-FPlO和WMS-RPlO ;PCR反应条件为，初始变性94°C、 5min，35 个循环（变性 94°C、30sec，退火 61 °C、30sec，延伸 72°C、90sec)，终延伸 72°C、 IOmin ;最后经历变性和缓慢复性的过程（变性99°C、lOmin，从72°C开始90个循环，每循环 20sec，依次降低0. 3°C )，以保证携带突变碱基的PCR产物形成杂合链（heteroduplex)。
[0112] 对于经历了缓慢复性的第二轮PCR产物，用具有Cell核酸酶活性的芹菜粗提产 物（celery juice extract，CJE)进行酶切，CJE的提取以及CJE酶切缓冲液的配制参照 Till 等人的方法（Till et al. 2006. Nature Protocols 1:2465-2477)，CJE 用量的优化参 照 Uauy 等人的方法（Uauy et al. 2009. BMC Plant Biology 9:115)。本发明建立的 CJE 酶 切体系为，PCR产物14μ1，芹菜粗提产物1μ1，10Χ酶切缓冲液2μ1，加双蒸水3μ1补足 体系；将酶切体系放置到45°C条件下催化30min ;随后加入5 μ I EDTA(75mM)终止反应；最 后加入5 μ 1溴酚蓝缓冲液（6X)，混匀后，将其中的24 μ 1样品在3%的聚丙烯酰胺胶（丙 烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=19:1)上分离。对于携带突变的DNA池，单个泳道中酶切形成 的条带长度相加近似于非酶切完整条带。对于直接与野生型DNA混合的双重DNA池，如果 出现特异酶切小条带，说明与野生型DNA相混的那个DNA样品携带点突变。但对于四重DNA 混合池来讲，如果能鉴定到点突变，则需要第二轮筛选确定突变单株。
[0113] 第二轮筛选用来确定四重DNA混合池中携带点突变的单个样本。为此，挑取四重 阳性池对应的原始DNA样品，移取部分DNA样品，分别与野生型'鲁麦15 Ms2'的DNA等量混 合成池（二重池），然后重复第一轮筛选过程，确定携带点突变的单株。
[0114] 通过TILLING筛选，在1，200个主茎旗叶DNA样品中，发现大约35个主茎旗叶携 带丽S基因组DNA点突变；而对于20个雄性可育穗对应的旗叶DNA样品，其中8个携带丽S 基因点突变（图5)。根据主茎数据计算，WMS基因突变的概率为2. 92%。在20个雄性可 育穗对应的旗叶DNA样品中，实际观察到8样品携带丽S基因点突变而其它12个样品可能 不携带丽S基因点突变。假设丽S基因和雄性不育性状无关（H ci假设），对于20个雄性可 育穗对应的旗叶DNA样品，根据主茎丽S基因的突变概率（2.92% )，携带丽S基因点突变 和没有WMS基因点突变的预想值分别为0. 58和19. 42 ;据此开展卡方拟合优度检验（X 2 = 97. 13, df = 1，P = 6. 49E-23)，推翻Htl假设。据此，丽S基因很可能决定'太谷核不育小 麦'的雄性不育性状。
[0115] 实施例9 :转基因小麦的获得、表型分析及分子验证
[0116] 为开展小麦遗传互补实验，首先从"鲁麦15Ms2"上扩增了 WMS基因组全长表达框架 (SEQ ID N0:7)，这里应用到长片段KOD FX试剂盒以及PCR引物WMS-FPll和WMS-RPll ;克隆 PCR产物到入门载体；再重组到携带BAR筛选标记（Block et al. 1987. The EMBO Journal 6:2513-2518)的目的载体，得到植物表达载体PC976(图4A)。本发明获得了携带显性WMS 基因的BAC质粒，从质粒上克隆丽S基因组全长表达框架（SEQ ID NO:7)相对容易。如果需 要从'太谷核不育小麦'基因组DNA上直接扩增，可以采用重叠延伸PCR(Vasl et al. 2004. BioTechniques 37:726-730)等技术加以解决。
[0117] 小麦幼胚培养和基因枪轰击转化参照Lv等人的流程（Lv et al.2014.PLoS ONE 9:e94171)。本发明选择正常可育的普通小麦品种'Bobwhite'作为转化受体；取 '13<^￥11；^6'开花后7-14(1左右的幼胚，进行幼胚表面灭菌，首先70%酒精（含0.05%吐 温-20)处理5111；[11，然后20%高乐氏漂白液（(]1〇1'€^1^811]^13163(311，〇31^1311(1，0六，113八； 额外添加了 0.05%吐温-20)处理15min，最后用灭菌水冲洗3-5遍。在超净台上剥取幼 胚（幼胚长度介于1-1. 5mm)，按盾片朝上摆放到诱愈培养基（MS基本培养基4.