3g/L，麦芽 糖40g/L，维生素 B1O. 5mg/L，天冬氨酸0· 15g/L，2, 4-D 2mg/L，硫酸铜0· 78mg/L，植物凝胶 2. 5g/L，PH 5. 8)，于22-23°C条件下暗培养4-6d。将幼胚转移到高渗培养基（即诱愈培养基 +蔗糖171. 15g/L，PH 5.8)处理4h，随后开展基因枪轰击。轰击处理20h后，将幼胚转移到 恢复培养基（等同于诱愈培养基），22-23°C条件下暗培养2w。将幼胚衍生的胚性愈伤转移 到分化培养基（即诱愈培养基+6-苄氨基嘌呤0· lmg/L+双丙氨膦3mg/L，PH 5.8)，22-23°C 和16h光照（25ymol/m2/sl)条件下培养2w。将分化出的再生苗（高度2-3cm)转移至生 根培养基（MS基本培养基2. 15g/L，麦芽糖20g/L，维生素 B1O. 25mg/L，天冬氨酸0. 075g/L， 2, 4-D lmg/L，硫酸铜0· 39mg/L，植物凝胶2. 5g/L，双丙氨膦3mg/L，PH 5. 8)，并在同样环境 条件下培养。待再生苗根系发育完全后，转为盆栽，在温室条件下种植。
[0118] 轰击处理米用 FOS-lOOO/He 台式基因枪（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA， USA)。轰击微粒混合物的准备步骤如下：在I. 5ml的硅化离心管中加入2mg金粉（直径 〇· 6 μπι)，再加入35 μ 1无水乙醇，震荡混勾，离心收集（12, 000rpm，5sec)，弃上清；加入 200 μ 1冰预冷的灭菌水，震荡混勾，离心收集（12, OOOrpm，5sec)，弃上清；加20 μ g质粒 DNA (浓度约1 μ g/ μ 1)，再加入冰预冷的灭菌水至245 μ 1，震荡混匀；然后加入250 μ 1冰 预冷的氯化钙（2. 5Μ)，震荡混匀；最后加入50μ1亚精胺（1.45%，v/v)，4°C条件下震荡 15-20min，离心收集（12, OOOrpm，IOsec)，弃上清；再加入36 μ 1冰预冷的无水乙醇，震荡混 匀。吸取IOul金粉和DNA悬浊液至载体膜中央，无菌风干后，将载体膜（金粉面朝下）置 入微粒发射器（microcarrier launch assembly)，该发射器位于可裂膜（1，IOOpsi)下方 3cm处。接受轰击的愈伤摆放到高渗培养基（直径约3. 5cm的区域），然后放置于载体膜下 方6cm处。PDS-1000/He基因枪的使用参照仪器说明书，轰击参数为1，300psi (轰击压力） 和25mm Hg (真空度）。
[0119] 本发明共轰击了 2, 742个小麦幼胚，经过组培、筛选和移栽，成功获得来自26个 幼胚的26棵独立株系（表3)。在小麦拔节期，测试了所有茎杆/分蘖对草胺磷的抗性 (Finale% 〇· 3%，v/v ;Bayer Corporation，Pittsburgh，PA，USA)，每个莖杆 / 分蘖涂抹一 个叶片（涂抹长度3cm);涂抹5天后检查效果，抗性叶片涂抹部位持绿，感性叶片涂抹部位 枯死；在26棵独立株系中，只有5棵植株对草胺磷表现抗性（图6 ;表3)。在小麦开花期， 观察了植株的雄蕊发育情况，有3棵植株表现雄性不育，其中2棵植株同时抗草胺磷（图6 ; 表3)。分子方面，用常规PCR检测了 BAR基因和丽S基因在26棵独立株系中的整合情况， 发现7棵植株同时为BAR和丽S阳性（表3) ;BAR基因整合的检测应用PCR引物BAR-FPl 和BAR-RP1，WMS基因整合的检测应用PCR引物WMS-FP8和WMS-RP12。利用RT-PCR，还检测 了丽S基因在幼穗中的表达情况，只在3棵呈现雄性不育的植株中检测到丽S cDNA的表达 (图6) ;RT-PCR应用到丽S基因引物丽S-FP6和丽S-RP6以及内源参照基因引物Actin-FPl 和Actin-RPl。综上所述，丽S基因组全长表达框架（SEQ ID N0:7)的导入和丽S基因 cDNA(SEQ ID NO: 1)的表达可以引起雄性不育，将正常可育小麦转变为雄性不育小麦。
[0120] 由此可见，将WMS基因组全长表达框架（SEQ ID N0:7)或其它启动子驱动下的WMS 基因 cDNA (SEQ ID NO: 1)导入正常可育植物（如粮食作物、花丼植物，蔬菜和林木等），可以 创建植物雄性不育系，这将在建立植物轮回选择体系、发展植物杂交制种技术等发面发挥 重大作用。
[0121] 表3 :针对丽S基因的候选转基因小麦植株
[0122]
[0123] 备注：" + "表示抗除草剂，BAR基因整合阳性，丽S基因整合阳性，能检测到丽S cDNA，或植株表现雄性不育；表示不抗除草剂，BAR基因整合阴性，丽S基因整合阴性，未 能检测到WMS cDNA，或植株表现雄性可育。带" + "的表格使用灰色背景标注。
[0124] 实施例10 :转基因短柄草的获得、表型分析和分子验证
[0125] 本发明还在短柄草（Brachypodium distachyon L.)上开展了遗传互补实验。短柄 草的转化采用农杆菌介导方法（Bragg et al. 2012. PLoS ONE 7: e41916)。为此，将小麦转 化中使用的丽S基因组全长表达载体PC976 (图4A)导入农杆菌AGLl感受态细胞（电击转 化），然后在添加了卡那50mg/L、羧苄lOOmg/L和利福平40mg/L的MG/L培养基中筛选农杆 菌转化细胞。每升MG/L培养基的配方为：蛋白胨5g、酵母粉2. 5g、氯化钠5g、甘露醇5g、硫 酸镁0. lg、磷酸氢二钾0. 25g、谷氨酸I. 2g和琼脂粉15g，并用氢氧化钠（IM)调pH至7. 2。
[0126] 本发明选择正常可育的短柄草自交系'Bd21-3'作为转化受体，转化方法参照 Bragg等人的方法（Bragg et al. 2012. PLoS ONE 7: e41916)。将农杆菌涂布于额外添加了 卡那50mg/L、羧苄100mg/L和利福平40mg/L的MG/L固体培养基中，28°C暗培养2d。用枪 头刮取农杆菌，放到液体诱愈培养基（MS基本培养基4. 43g/L，蔗糖30g/L，硫酸铜0. 6mg/L， 2,4-D 2.5mg/L，植物凝胶 2g/L，PH 5.8;Bragg et al.2012.PLoS ONE 7:e41916)悬浮，用 液体CM培养基调整0D_值至0. 6,再根据悬浮液体积加入乙酰丁香酮（AS，200uM)和PE/ F68(0. 1 % )。使用农杆菌悬浮液侵染短柄草愈伤组织，然后置于3层灭菌滤纸上，在22°C 条件下暗培养3d ;将愈伤从滤纸转移到含有潮霉素40mg/L和特美汀150mg/L的CIM培养 基，28°C暗培养lw，筛选抗潮霉素的愈伤。每14d继代一次，如果愈伤状态良好，把它们转 移到含有潮霉素40mg/L和特美汀150mg/L的再生培养基（LS基本培养基4. 43g/L，麦芽糖 30g/L，激动素 0.2mg/L，植物凝胶 2g/L，PH 5.8;Bragg et al.2012.PLoS ONE 7:e41916) 上，培养条件为28°C和16h光照（20 μ m〇l/m2/sl)。待幼苗长至l-2cm(高度），将它们转移 到含特美汀150mg/L的生根培养基（MS基本培养基4. 42g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶2g/L， PH 5.7;Bragg et al.2012.PLoS ONE 7:e41916)中，待根发育完善（长度 2-3cm)、须根较 多时，把它们放到4°C培养箱春化2w，然后转移到温室种植。
[0127] 本发明共侵染了 100块短柄草愈伤，经过组培、筛选和移栽，成功获得来自8块愈 伤的11棵植株（表4)。待幼苗长至3叶期（大约IOcm高度），测试候选植株对草胺磷的抗 性（Finale"，0. 3%，v/v)，每个莖杆/分蘖涂抹一个叶片（涂抹长度Icm);涂抹5天后检查 效果，抗性叶片涂抹部位持绿，感性叶片涂抹部位枯死；在11棵植株中，有10棵植株对抗草 胺磷表现抗性（图7 ;表4)。在短柄草开花期，观察了所有植株的雄蕊发育情况，发现有10 棵植株表现雄性不育，并且这10棵植株都对草胺磷表现抗性（图7 ;表4)。分子方面，用常 规PCR检测了 BAR基因和丽S基因在11棵植株中的整合情况，发现其中10棵植株同时携带 BAR基因和丽S基因；BAR基因的检测应用到PCR引物BAR-FP1和BAR-RP1，丽S基因的检测 应用到PCR引物丽S-FP8和丽S-RP12。利用RT-PCR，还检测了丽S基因在短柄草幼穗中的 表达情况，发现10棵呈现雄性不育的植株中均能检测到WMS cDNA (图7 ;表4) ;RT-PCR应用 了丽S基因引物丽S-FP6和丽S-RP6以及内源参照基因引物Actin-FPl和Actin-RPl。总 之，在所有11棵植株中，其中10棵抗除草剂、携带BAR基因和丽S基因、并表达丽S cDNA， 而且这10棵植株都表现雄性不育；只有1棵植株为隐性，不抗除草剂、无 BAR基因和WMS基 因的整合、正常可育。由此可见，WMS基因组全长表达框架（SEQ ID NO: 7)能提供雄性不育 功能，可以将正常可育短柄草植株转变为雄性不育短柄草植株。
[0128] 以上结果再次表明，将WMS基因组全长表达框架（SEQ ID NO: 7)或其它启动子驱 动下的丽S基因 cDNA (SEQ ID NO: 1)导入正常可育植物（如粮食作物、花丼植物，蔬菜和林 木等），可以创建植物雄性不育系，这将在建立植物轮回选择体系、发展植物杂交制种技术 等方面发挥重大作用。
[0129] 表4 :针对丽S基因的候选转基因短柄草植株
[0130]
[0131] 备注：" + "表示抗除草剂，BAR基因整合阳性，丽S基因整合阳性，能检测到丽S cDNA，或植株表现雄性不育；表示不抗除草剂，BAR基因整合阴性，丽S基因整合阴性，未 能检测到WMS cDNA，或植株表现雄性可育。带" + "的表格使用灰色背景标注。愈伤22-5、 22-6和22-12各对应两个植株，其余愈伤则只对应一个植株。
【主权项】
1. 如下a)至e)项所述的任何DNA片段：a)cDNA片段如SEQIDNO: 1所示；b)DNA片 段，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示；c)DNA片段如SEQIDNO:6所示；d)DNA片 段，其编码的蛋白（i)功能上如SEQIDNO: 2所示的蛋白；（ii)序列上如SEQIDNO: 2所示 的氨基酸序列，但存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象；e)DNA片段，其 编码的蛋白（i)功能上如SEQIDNO:2所示的蛋白；（ii)在严格条件下能与SEQIDNO: 1 或SEQIDN0:6所示的DNA片段退火杂交。 2. DNA片段，其转录产物RNA与SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 6所对应的转录产物RNA互 补或部分互补。 3. DNA片段，其转录产物RNA呈现核酶活性，能特异切割与SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 6 对应的转录产物RNA。 4. DNA片段，其转录产物RNA在植物细胞中通过共抑制下调与SEQIDNO: 1或SEQID NO:6对应基因的表达。 5. DNA片段，其转录产物RNA在植物细胞中对权利要求1所述的任何DNA片段的转录本 RNA具有显性抑制作用；或DNA片段，其在植物细胞中所编码的蛋白对权利要求1所述的任 何DNA片段所编码的蛋白具有显性抑制作用。6. 携带如权利要求1-5所述的任何DNA片段的质粒载体。7. 携带如权利要求1-6所述的任何DNA片段或质粒的植物转基因细胞。8. 携带如权利要求7所述细胞的转基因植株。9. 来源于如权利要求8所述植株的无性克隆或植株后代，该无性克隆或植株后代携带 如权利要求7所述的植物转基因细胞。10. 来源于如权利要求8或9所述植株、无性克隆或植株后代的种子、植物组织或植物 器官，它们携带如权利要求7所述的植物转基因细胞。11. 如a)至c)所述的任何具有花药特异性启动子活性的DNA片段：a)DNA片段如SEQ IDNO: 5所示；b)DNA片段如SEQIDNO: 5所示，但存在一个、数个或数十个核苷酸的替换、 删除或插入现象；c)DNA片段在严格条件下能与SEQIDN0:5所示的DNA片段退火杂交。12. 携带如权利要求11所述的质粒载体。13. 携带如权利要求11或12所述DNA片段的植物转基因细胞。14. 携带如权利要求13所述细胞的转基因植株。15. 来源于如权利要求14所述植株的无性克隆或植株后代，该无性克隆或植株后代携 带如权利要求13所述的植物转基因细胞。16. 来源于如权利要求14或15所述植株、无性克隆或植株后代的种子、植物组织或植 物器官，它们携带如权利要求13所述的植物转基因细胞。17. 利用基因组编辑、诱导突变或种质筛选等手段获得的植物细胞，该植物细胞携带如 SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 4所示DNA片段的变异体，只要该DNA片段的变异足以引起植物 雄蕊育性的改变。18. 携带如权利要求17所述细胞的植株。19. 来源于如权利要求18所述植株的无性克隆或植株后代，该无性克隆或植株后代携 带如权利要求17所述的细胞。20. 来源于如权利要求18或19所述植株、无性克隆或植株后代的种子、植物组织或植 物器官，它们携带如权利要求17所述的细胞。
【专利摘要】本发明涉及一种小麦雄性不育基因WMS及其花药特异性启动子的应用。本发明利用RNA测序技术对比了小麦近等基因系‘鲁麦15’和‘鲁麦15+Ms2’(简称‘鲁麦15Ms2’)在减数分裂初期的花药转录组，从中发现了只在‘鲁麦15Ms2’花药组织表达的基因WMS。WMS基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；WMS基因编码的蛋白(即WMS蛋白)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；WMS基因启动子具有花药组织特异性驱动的活性，人为操作WMS基因能够改变小麦和短柄草的雄蕊育性。因此，本发明可用于实现目标基因的花药特异性表达、创建植物雄性不育特性、建立植物轮回选择体系、发展植物杂交制种技术。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00, C12N5/10, C12N15/29
【公开号】CN104911194
【申请号】CN201510303817
【发明人】付道林, 倪飞, 齐娟, 吕波, 罗明成, 王树芸
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月4日