3H20 12. 5, ΚΗ2Ρ042· 5, CaC035,微量元素lOml/L;微量元素溶液按g/L计含有：MnS04 · 5H20 1. 0, Cocl 2 · 6H20 0· 4, NaMo04 · 2H20 0· 2, ZnS04 · 7H20 0· 2, Alcl3 · 6H20 0· 1， Cucl 2 · H200. 1，H3B040 . 05,含5M HCl〇
[0023] 培养条件：将37°C、220rpm下培养8h的种子以3%的接种量转入发酵培养基，接 种2h后加入诱导剂木糖5g/L，于3L发酵罐、35-37°C、600-800rpm条件下培养。
[0024] 实施例1 :敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA
[0025] 根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis168购自美国典型微生物 保藏中心，ATCCNo. 27370)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA的上下游序列，以及 博来霉素抗性基因的序列，构建序列如SEQIDNO. 1所示的敲除框。
[0026] 将构建好的敲除框转化重组枯草芽孢杆菌BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNAl(即专利申 请201510394205. 7中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNK)，通过博来霉素抗性平板筛选、菌 落PCR验证，确认敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（pckA)敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌 BSGNKA。重组枯草芽孢杆菌BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNAl是在文献（Liu,Y.etal.Modular pathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamine production.Metab.Eng. 23:42-52, 2014)构建的BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl的基础上敲除 了葡萄糖激酶编码基因glcK，pP43-GNAl质粒游离表达GNA1基因，pM7Z6M-PxylA-glmS质粒 整合表达glmS基因。
[0027] 实施例2 :发酵生产乙酰氨基葡萄糖
[0028] 将37°C、220rpm下培养8h的种子以3%的接种量转入发酵培养基，于3L发酵罐、 35-37°C、600-800rpm条件下培养52-72h。发酵52h时，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含 量达到29. 27g/L，与对照菌BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNAl相比提高了 28. 1% (结果如表1所 示），实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。此外，本发明的BSGNKA 菌株的乙酰氨基葡萄糖比合成速率达到0. 〇85g/gDCW/h，与对照菌株BSGNK相比，提高了 46. 5%。同时本发明菌株副产物乙偶姻的产量为23. 5g/L，是对照菌株的68. 5%。因此通 过敲除pckA基因，可以有效的减少副广物生成，提尚GlcNAc的积累。
[0029] 表lGlcNAc的比合成速率、产量以及副产物产量的比较
[0030]
[0031] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆 菌是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA ;所 述枯草芽抱杆菌 BSGNK，以 B. subtilis 168 A nagP A gamP A gamA A nagA A nagB A Idh A pta ::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNAl的重组表达，并在此基础上敲除 了葡萄糖激酶编码基因glcK。2. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶编码基因PckA是NCBI上Gene ID :937235的基因。3. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BSGNK是 专利申请201510394205. 7中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNK。4. 一种权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法是 先构建磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因敲除框，经同源重组，用敲除框中的博来霉素抗 性基因zeo替代枯草芽孢杆菌BSGNK基因组中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pckA，阻断 了宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量， 促进了乙酰氨基葡萄糖积累。5. -种促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，是以重组枯草芽孢杆菌 BSGNKA为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖；BSGNKA是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上， 敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pckA是NCBI上Gene ID :937235的 基因。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基，按g/L计含 有：初始葡萄糖 20,蛋白胨 6,酵母粉 12,（NH4) S046, K2HPO4 ? 3H20 12. 5, KH2P042. 5, CaC035， 微量元素溶液l〇_15ml ;其中微量元素溶液按g/L计含有=MnSO4 ? 5H20 I. 0, CoCl2 ? 6H20 0? 4, NaMoO4 ? 2H20 0? 2, ZnSO4 ? 7H20 0? 2, Alcl3 ? 6H20 0? 1，Cucl2 ? H2O 0? 1，H3BO40.0 5,含 5MHClo8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵是将生产菌株活化后，以3 %的 接种量转入发酵培养基，接种2h后加入诱导剂木糖，于3L发酵罐、35-37°C、600-800rpm条 件下培养52-72h。
【专利摘要】本发明公开了一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，属于遗传工程领域。本发明以BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNA1作为出发菌株，通过同源重组敲除磷酸烯醇式羧化酶编码基因pckA，阻断了宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量，促进了乙酰氨基葡萄糖积累。在使用复合培养基发酵过程中，敲除pckA的重组枯草芽孢杆菌的乙酰氨基葡萄糖的产量达到29.27g/L，比对照菌株提高了28.1％。本发明为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/125, C12P19/26
【公开号】CN105238724
【申请号】CN201510762271
【发明人】刘龙, 顾洋, 邓洁莹, 陈坚, 堵国成, 李江华
【申请人】江南大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月10日