胞。固定后的细胞通过流式细胞仪 (FACScan)测定FITC巧光强度。算出平均巧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)的 溶剂比，将1.5W上判断为阳性。
[0186] 结果不于表1。由该结果可知，W序列编号3、4、5和6表不的肤均呈现化A-A*02:01 结合性和HLA-A24结合性。
[0187][表 1]
[018 引
[01例实施例3 :使用HLA-A*02:01基因导入小鼠和HLA-A巧4:02基因导入小鼠的体内的 CTL诱导能力的评价
[0190] 被判断为存在与HLA-A*02:01和HLA-A巧4:02的结合的来源于0R7C1的肤(序列编 号3、4、5和6)的CTL诱导能力通过使用HLA-A*02:01基因导入小鼠和HLA-A巧4:02基因导入 小鼠的体内的CTL诱导试验进行了评价。
[0191] HLA-A*02:01基因导入小鼠（C57化/6CrHLA-A2.1DR1)是缺失小鼠的MHC并表达作 为人的Μ肥的HLA-A*02:01和HLA-DRB1*01:01的小鼠，通过使用本小鼠，可筛选能够在人体 中诱导CTL的肤。另一方面，HLA-A巧4:02基因导入小鼠表达作为人的MHC的HLA-A巧4:02和 作为小鼠的MHC的H-2Kb的嵌合体HLA的小鼠，通过使用本小鼠，可筛选HLA-A24阳性的能够 在人体中诱导CTL的肤（Int J化ncer. 2002; 100:565-70)。通过给予肤是否诱导CTL通过测 定用给予肤对来源于给予了肤的上述小鼠的脾细胞进行再刺激的情况下产生的IFN 丫来判 断。
[0192] 具体来说，将肤用PBS(-)溶解至lOmg/mL，与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合，乳 液化。经乳液化的肤W50yg/处的使用量向小鼠的尾根部皮内的2处给药。1周后，通过C〇2气 体使小鼠安乐死后，取出脾脏，制备脾细胞。IFN 丫产生的测定使用IFN 丫 ELISP0T测试试剂 盒(碧迪公司（パ夕bシ·テVッ年シッシ社）制）。脾细胞制备的前一天，将化ISP0T板用抗IFN 丫抗体处理，当天用含10%FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的脾细胞W0.5X106个/孔 接种至经封闭的化ISP0T板。将来源于0R7C1的肤用DMS0溶解至40mg/mL，再用10 % RPMI1640 培养基稀释至20yg/mL。将经稀释的肤W50化/孔添加至来源于给予了该肤的动物的脾细 胞。将添加了肤的脾细胞在37°C、5%C02下培养16~18小时，从而施加体外的肤再刺激。培 养后除去上清，按照所附的实验方法使化ISP0T板显色。显色的斑点数通过KS-ELISPOT测 定。
[0193] IFN丫 ELISP0T测试的结果示于图1、2、3和4。
[0194] 本试验的结果是，来源于HLA-A*02:01基因导入小鼠的脾细胞和来源于HLA-A巧4: 02基因导入小鼠的脾细胞中，确认产生各肤特异性的IFN丫，从而可知W序列编号3、4、5和6 表示的来源于0R7C1的各肤具有CTL诱导能力。
[01巧]实施例4:采用人外周血单核细胞的CTL诱导能力的评价
[0196] 对于添加 W序列编号3、5和6表示的巧巾肤的情况下来源于健康人的外周血单核细 胞是否诱导CTL进行了评价。
[0197] 具体来说，将来源于化4-4*02:01阳性或化4-4巧4:02阳性的健康人的外周血单核 细胞(细胞技术有限公司（Cellular Technology Limited社）制）用含10%来源于人的血 清的AIM-V培养基悬浮后，接种1X105个至U型底96孔板的各孔，在37°C、5%C02下培养。运 时，添加 lOOU/mL人化-2和20yg/mL上述肤。每3天或4天更换1次培养基，约2周后实施IFN 丫 ELISP0T测试。测试的前一天，将化ISP0T板用抗IFN 丫抗体处理，当天用含10%来源于人的 血清的AIM-V培养基在室溫下封闭约2小时。将培养中的人外周血单核细胞用AIM-V培养基 清洗，将3分之1的量接种至经封闭的ELI SPOT板的各孔。运时，对于用W序列编号3、5和6表 示的肤培养了的人外周血单核细胞，将任意的2孔混合而并成1孔后，将各孔再次分成2孔接 种，一个孔添加肤溶液，另一个孔添加仅不含肤的对照溶液，作为非再刺激对照，各60孔。在 此，W序列编号3、5和6表示的巧巾肤用DMS0溶解至40mg/mL，再用含10%来源于人的血清的 AIM-V培养基稀释。W最终浓度达到20yg/mL的条件添加，对人外周血单核细胞进行再刺激。 在37°C、5 % C〇2下培养，16~18小时后除去上清，按照所附的实验方法使化ISP0T板显色。显 色的斑点数通过细胞技术有限公司制ELISP0T分析仪测定。序列编号3、5和6的IFN 丫 ELISP0T测试的结果分别示于图5、6和7。纵轴表示各孔中确认的斑点数，横轴表示阳性的 孔。此外，黑柱表示在肤刺激条件下检测到的斑点数，白柱表示在肤非刺激条件下检测到的 斑点数(对照）。仅限肤刺激时的斑点数在50个W上且黑柱与白柱的差在2倍W上的情况判 断为阳性孔。
[0198] 本试验的结果是发现W序列编号3、5和6表示的3种肤通过化A-A*02 : 01阳性和 HLA-A巧4:02阳性的来源于健康人的外周血单核细胞诱导对运些肤特异性的CTL。由此可 知，运巧中肤不仅在小鼠中，在人体中也具有CTL诱导能力。
[0199] 实施例5:来源于0R7C1的肤的C末端氨基酸置换体肤的评价
[0200] (1)肤的合成
[0201] 与实施例1同样地通过Fmoc法化学合成W序列编号3表示的肤的C末端氨基酸由鄉 氨酸被置换为异亮氨酸的肤(序列编号11)，供于HLA结合试验和体内的CTL诱导试验。
[0202] (2)HLA-A02 和 HLA-A24 结合性评价
[0203] 通过与实施例2同样的方法，对于上述(1)中合成的W序列编号11表示的肤，进行） 化A-A02和HLA-A24的结合性评价。结果示于表2。由该结果可知，W序列编号11表示的肤也 呈现HLA-A*02:01结合性和HLA-A24结合性。
[0204] [表 2]
[0205]
[0206] (3)体内的CTL诱导能力的评价
[0207] CTL诱导能力仿照实施例3通过使用HLA-A*02:01基因导入小鼠和HLA-A*24:02基 因导入小鼠的体内的CTL诱导试验进行了评价。具体来说，除了将W序列编号11表示的肤用 注射用水溶解至40mg/mL，与等量的IFA混合，乳液化，将经乳液化的肤W15化g/处的使用量 向小鼠的尾根部皮内的2处给药W外，与实施例3同样地进行。结果示于图8。
[020引来源于HLA-A*02:01基因导入小鼠的脾细胞和来源于HLA-A巧4:02基因导入小鼠 的脾细胞中，确认产生该肤特异性的IFN 丫，从而可知W序列编号11表示的肤具有CTL诱导 能力。
[0209] (4)采用人外周血单核细胞的CTL诱导能力的评价
[0210] 对于添加 W序列编号11表示的肤的情况下来源于健康人的外周血单核细胞是否 诱导CTL仿照实施例4进行了评价。具体来说，除了将用W序列编号11表示的肤培养了的人 外周血单核细胞供于IFN丫 ELISP0T测试时，不将任意的2孔混合而并成1孔，并将各孔分成 2孔接种进行评价W外，与实施例4同样地进行。结果示于图9。发现W序列编号11表示的肤 通过HLA-A*02:01阳性和HLA-A巧4:02阳性的来源于健康人的外周血单核细胞诱导对该肤 特异性的CTL，可知不仅是小鼠，在人体中也具有CTL诱导能力。
[0211] 工业上利用的可能性
[0212] 通过本发明，可提供具有CTL的诱导活性的来源于0R7C1的肿瘤抗原肤等。本发明 的肤可用作癌症的预防和/或治疗剂。 序列表的自由文字部分 序列编号3:合成肤 序列编号4:合成肤 序列编号5:合成肤 序列编号6:合成肤 序列编号7:合成肤 序列编号8:合成肤 序列编号9:合成肤 序列编号10:合成肤 序列编号11:合成肤
【主权项】
1. 由以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表不的 氨基酸序列形成的肽。2. 由以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表不的 氨基酸序列中， (1) 将C末端的氨基酸置换为疏水性氨基酸的氨基酸序列，和/或 (2) 在N末端和/或C末端添加有1个~数个氨基酸的氨基酸序列 形成的肽。3. 如权利要求2所述的肽，其中，该肽由将以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编 号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列的C末端的氨基酸置换为亮氨酸、缬氨酸或 异亮氨酸的氨基酸序列形成。4. 如权利要求2所述的肽，其中，该肽由在以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编 号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列的N末端或C末端添加了 1个氨基酸的氨基 酸序列形成。5. 将多条表位肽连结而成的多表位肽，其中，作为该表位肽，包含至少1条权利要求1~ 4中的任一项所述的肽。6. 含有权利要求1~4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽作为有效成分 的医药组合物。7. 如权利要求6所述的医药组合物，其中，包含佐剂。8. 含有权利要求1~4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽作为有效成分 的癌症的预防和/或治疗用疫苗。9. 含有权利要求1~4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽作为有效成分 的癌症的预防和/或治疗用剂。10. 含有权利要求1~4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽作为有效成 分的细胞毒性T细胞(CTL)的诱导剂。11. 编码权利要求1~4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽中的至少1个 的多聚核苷酸。12. 含有权利要求11所述的多聚核苷酸的表达载体。13. 包含权利要求12所述的表达载体的基因导入用组合物。14. 含有以下的(a)或(b): (a) 权利要求11所述的多聚核苷酸、 (b) 权利要求12所述的表达载体 中的任一种作为有效成分的用于癌症的治疗或预防的医药组合物。15. 包括使以下的(a)或(b): (a) 权利要求1~4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽、 (b) 编码上述(a)记载的肽中的至少1个的多聚核苷酸、 与具有抗原递呈能力的细胞在体外接触的抗原递呈细胞的制造方法。16. 包括使以下的(a)或(b): (a) 权利要求1~4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽、 (b) 编码上述(a)记载的肽中的至少1个的多聚核苷酸 中的任一个与外周血淋巴细胞在体外接触的CTL的诱导方法。17. 含有权利要求1~4中的任一项所述的肽和HLA的HLA多聚体。18. 含有权利要求17所述的HLA多聚体的诊断药物。19. 识别权利要求1~4所述的肽与HLA的复合物的TCR样抗体。20. 含有权利要求19所述的TCR样抗体的肿瘤检测剂。21. 用于筛选可有效地适用权利要求6、7或14所述的医药组合物的患者的诊断药物，其 中，包含权利要求17所述的HLA多聚体或权利要求19所述的TCR样抗体。
【专利摘要】本发明提高可用作癌症的预防和/或治疗剂的肿瘤抗原肽等。由以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽，包含所述肽中的至少一种作为表位肽之一的将多条表位肽连结而成的多表位肽，编码所述肽或多表位肽中的至少一种的多聚核苷酸，以及含有这些作为有效成分的医药组合物，以诱导CTL为特征的癌症的预防和/或治疗剂等。
【IPC分类】C07K16/30, C07K7/06, C12N15/00, A61P43/00, A61P35/00, C12N15/09, A61K39/00
【公开号】CN105531368
【申请号】CN201480039862
【发明人】增田圭基, 井口晴久, 后藤正志, 鸟越俊彦, 广桥良彦, 守田玲菜
【申请人】大日本住友制药株式会社, 北海道公立大学法人札幌医科大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年7月11日
【公告号】CA2917785A1, EP3020806A1, US20160166666, WO2015005479A1