一种n-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种如通式I所示的N?取代哌啶胺?4?嘧啶类衍生物及其药学上可接受的盐、酯或前药，其制备方法以及含有一个或多个此类化合物的组合物在预防和治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染药物中的应用。
【专利说明】
一种N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种衍生物及其制备方法与应用，具体涉及N-取代哌啶胺-4-嘧啶类 衍生物及其制备方法与应用，属于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 获得性免疫缺陷综合征(艾滋病，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的 危害人类生命健康的重大传染性疾病。现有抗艾滋病药物及高效抗逆转录病毒疗法 (HAART)的应用虽然可以显著延缓病情，但存在易产生耐药性、服药量大、毒副反应严重以 及治疗费用昂贵等诸多问题，因此研发新型抗艾滋病药物仍刻不容缓。底物非竞争性非核 苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs)具 有高效、低毒的优点，目前已成为HAART的重要组成部分。已经有5个该类药先后上市，即奈 韦拉平（nevirapine )、地拉韦啶（de lav irdine)、依法韦仑（efavirine)、依曲韦林 (etravirine，TMC125)和利匹韦林(rilpivirine，TMC278)。但是随着该类药物的临床的普 遍应用，耐药病毒株也迅速产生并蔓延，大大降低了其临床效价。因此，寻找结构新颖并能 克服现有药物问题的抗艾滋病新药是目前抗艾滋病药物研究领域的重要课题。
[0003] 04?￥类化合物(0丨3巧]^1'：[1111(1;[116 8，二芳基啼啶）是一类新型、高效抗耐药的HI V-1NNRTI。其中依曲韦林(TMC125,2008年上市)和利匹韦林(TMC278,2011年上市)作为新一代 NNRTIs已在临床得到广泛的应用。它们对野生型和多种耐药病毒株（如K103N、Y181C、 K103N/Y181C等)均具有相当强的抑制活性。但是，该类化合物水溶性极差、口服生物利用度 低、过敏等副作用使其临床应用受到极大限制。因此，通过广泛的结构修饰以改善该类抑制 剂的生物利用度对发现具有自主知识产权的新型抗HIV药物具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物或其药 学上可接受的盐、酯或前药;本发明还提供上述化合物的制备方法以及活性筛选结果和应 用。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -、N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物
[0008]本发明的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物或其药学上可接受的盐、酯或前药，具有 如下通式I所示的结构：
[0010] 其中，
[0011] R为CH3、CN、卤素或E-氰基丙烯基；
[0012] X为-NH-、-〇-或-S-;
[0013] n等于〇或 1;
[0014] Ar为苯基或吡啶基;所述的苯基可被邻间对单取代或多取代，取代基选自卤素、 N〇2、CN、NH 2、NHCH3、OH、C00H、CH20H、CONH2、COOCH3、COOCH2CH3、0CH 3、OCH2CH3、SO2NH2、SO2CH3、C =CCH2CH2OH或 C=C-CH=CH-CH2-OH。
[0015] 根据本发明优选的，通式I化合物为下列结构的化合物之一：
[0017]
[0018] 二、N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物的制备方法
[0019] 本发明以5-硝基_2,4_二氯嘧啶（1)为起始原料，与1-叔丁氧羰基(Boc)-4-胺基哌 啶在三乙胺的碱性条件下缩合得到中间体化合物2;与不同取代的苯酚，苯硫酚或苯胺经过 亲核取代反应得中间体化合物3，用三氟乙酸脱去Boc保护基得到中间体化合物4，再与取代 的苯基或苄基反应得到中间体化合物5，将化合物5的硝基还原成氨基或与含炔取代基相连 后再还原得到终产物I;
[0020] 合成路线如下：
[0022]试剂和条件：（i) 1 -Boc-4-氨基哌啶，三乙胺，四氢呋喃，0 °C ; (i i)不同取代的苯 酚，苯硫酚或苯胺，碳酸钾，N，N-二甲基甲酰胺，60°C;(iii)三氟乙酸，二氯甲烷；（iv)取代 的卤苄或芳卤；（v)钯碳，氢气，乙醇；（vi)双三苯基磷二氯化钯，碘化亚铜，三乙胺，2-戊烯- 4-炔-1-醇，二氯化锡二水合物。
[0023] 其中R、n、X和Ar的定义同上通式I所述。
[0024] 根据本发明优选的，一种N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物的制备方法，包括如下步 骤：
[0025] 以5-硝基_2,4_二氯嘧啶（T)为起始原料，与1-叔丁氧羰基(Boc)-4-胺基哌啶在 三乙胺的碱性条件下缩合得到中间体化合物2'；与不同三甲基苯酚或3,5_二甲基-4-羟基 苯腈经过亲核取代反应得中间体化合物3 '，用三氟乙酸脱去Boc保护基得到中间体化合物 4'，再与取代的苯基或苄基反应得到中间体化合物5'，将化合物5'的硝基还原成氨基或与 含炔取代基相连后再还原得到终产物I;
[0026] 合成路线如下：
[0028] 试剂和条件：（i) l-Boc-4-氨基哌啶，三乙胺，四氢呋喃，0°C ; (ii)2，4，6-三甲基苯 酚或4-羟基-3,5-二甲基苯甲腈，碳酸钾，N，N-二甲基甲酰胺，60°C;(iii)三氟乙酸，二氯甲 烷；（iv)取代的卤苄；（v)钯碳，氢气，乙醇；（vi)双三苯基磷二氯化钯，碘化亚铜，三乙胺，2-戊稀-4_块-1-醇，二氯化锡二水合物。
[0029]其中，R为CH3或CN;Ar为苯基或吡啶基;所述的苯基对位被单取代，取代基为C0NH2、 COOCH3、SO2CH3、C=C-CH=CH-CH2-OH 〇 [0030]具体的制备方法详见实施例1~8。
[0031]三、N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物类化合物的应用
[0032]本发明通式I的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物类化合物在抑制HIV复制的MT-4细 胞试验中显示出显著的抗病毒活性和较高的选择性。因此，本发明还提供：
[0033]通式I的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物在制备抗HIV的药物中的应用。
[0034] 一种抗HIV药物组合物，包含本发明所述化合物或其药学上可接受的盐以及一种 或多种药学上可接受载体或赋形剂。
[0035]本发明化合物既可以其本身也可以其药学上可接受的盐或溶剂化物的形式使用。 通式I化合物的药学上可接受的盐包括与药学上可接受的无机酸或有机酸或者无机碱或有 机碱形成的常规盐。合适的酸加成盐的例子包括与盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢溴酸、高氯酸、 富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、 羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺 酸、羟基苯甲酸、氢碘酸、苹果酸、鞣酸等形成的盐。合适的碱加成盐的例子包括与钠、锂、 钾、镁、铝、钙、锌、N，N'_二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖 按和普鲁卡因等形成的盐。本文中涉及到本发明化合物时，包括通式I化合物及其药学上可 接受的盐或溶剂化物。
[0036] 根据本发明，本发明式I化合物可与常规药物载体或赋形剂组成药物组合物。该药 物组合物可通过口服或非肠道途径给药。本发明的药物组合物可按本领域常规方法制备成 各种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、溶液、悬浮液、颗粒剂或注射剂等，经口服或非肠道途 径给药。
[0037] 本发明在对二芳基嘧啶类化合物构效关系和分子模拟深入研究的基础上，按照生 物电子等排药物设计原理，将TMC125中嘧啶环1位N用C代替并引入氨基以保持与HIV-1逆转 录酶(RT)的氢键作用。在新构建的分子左翼引入高活性取代基的同时，应用优势药效团片 段的组合，通过在分子的右翼引入N-取代苄基哌啶结构以增加与周围氨基酸的潜在氢键作 用，进而提高与靶标的亲和力及抗病毒活性。活性结果表明，所有化合物均具有了突出的抗 野生型HIV-1活性，且大部分化合物对多种HIV-1突变株（L100I、K103N、Y181C、Y188L、 E138K)保持了纳摩尔的抑制活性，显著优于上市药物NVP和DLV，并与EFV处于同一水平，特 别是针对个别严重的单突变病毒如K103N和Y181C。此外，本发明提供的N-取代哌啶胺-4-嘧 啶类衍生物对细胞的毒性较上市药物大大降低，特别是相对ETV，所涉及化合物的CC 5Q值提 高了5.2-53.3倍。且化合物1-1、1-3、1-6的选择指数不论是对野生型还是多种单或双突变 型病毒株都远好于所有阳性对照药物。因此，本发明提供的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物 具有显著的进步性，具有较大的开发价值，在此基础上进行新的结构修饰及深入研究有助 于开发出新的抗HIV药物。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。
[0039] 实施例甲砜基)苄基）哌啶-4-胺基)-5_氨基嘧啶-2-基氧基)-3， 5-二甲基苯甲腈(1-1)的制备
[0040] 2,4-二氯-5-硝基嘧啶（1'）（0.5(^，2.58111111〇1)称于圆底烧瓶中，151^干燥的四氢 呋喃溶解，冰浴搅拌下向其中滴加Boc-4-氨基哌啶（0.52g，2.58mmol)和三乙胺（0.287g， 2.838mmol，0.39mL)的四氢呋喃混合溶液（15mL)。滴毕，转为室温继续反应10小时。反应完 全后，过滤除掉生成的有机盐，滤液浓缩并柱层析纯化（乙酸乙酯:石油醚=1:4)，得黄色固 体2' ?产率:65.6%.mp:130-131°C.
[0041] 上步制得中间体2'（0? 10g，0.28mmol) ,4-氰基-2,6-二甲基苯酚（0.045g, 0.308mmo 1)，碳酸钾(0.0425g, 0.308mmo 1)共置于圆底烧瓶中，加入N, N-二甲基甲酰胺5mL， 室温搅拌6小时。反应停止后减压蒸除大部分溶剂，向其中加水50mL，乙酸乙酯萃取（3 X 10mL)，有机相合并饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤浓缩并快速柱层析纯化（乙酸乙 酯:石油醚= 1:8)，得黄色固体3'。产率:60.7%.mp:129-130°C.
[0042] 中间体3'（2. Og，4.2mmo 1)置于圆底烧瓶中，2mL干燥的二氯甲烷将其溶解，室温下 缓慢滴加三氟乙酸2mL，滴毕反应液继续室温反应6小时。减压蒸除大部分溶剂和三氟乙酸， 50mL二氯甲烷复溶，饱和碳酸氢钠溶液洗涤(3 X 30mL)，有机相无水硫酸镁干燥，加压过滤 浓缩，得油状中间体4' ?产率85 ? 0% ? ESI-MS:m/z 369 ? 3(M+l)，Ci8H2qN6〇3[368 ? 16] ?
[0043] 中间体4'（0.4g, 1.09mmol)和碳酸钾(0.226g, 1.57mmol)共置于圆底烧瓶中，加入 N，N-二甲基甲酰胺1 OmL，室温搅拌下加入4-甲基磺酰基苄溴(0.299g，1.20mmol)，反应6小 时后蒸除大部分溶剂，加入水50mL，二氯甲烷萃取(3X10mL)。有机相合并，饱和食盐水洗涤 后无水硫酸镁干燥。过滤浓缩，柱层析纯化（乙酸乙酯:石油醚= 1:1)。所得黄色固体乙酸乙 酯/异丙醚重结晶得5'。产率46.5% .mp:153-154°C，ESI-MS:m/z 537.5(M+1)，559.5(M+ 23).C26H28N6〇5S[536.18].
[0044]中间体5'（0.10258)，20%的钯碳(0.0218，质量分数的20%)共置于圆底烧瓶中， 加入甲醇10mL，抽真空氢气置换3次，保持反应体系氢气过量，室温下搅拌24小时。反应停止 后，硅藻土过滤掉钯碳，滤液浓缩。乙酸乙酯/石油醚重结晶得终产物1-1.产率76.5% .mp: 153-154〇0.^ NMR(400MHz,DMS0-d6,ppm)8：7.90(d,2H,J = 8.00Hz,PhH),7.58-7.56(m,4H, benzonitrile-H,PhH),7.25(s,lH,pyrimidine-H),6.48(d,lH,J=8.00Hz,NH),4.45(s, 2H,NH2),3.57(s,2H,benzyl-H),3.21(s,3H,CH3),2.78(d,2H,J=12.00Hz,piperidine-H), '2.04(s ,6H,2XCH3) , 1.96-1.94(m, 3H,piperidine-H) , 1.80 (d , 2H, J = 12.00Hz , piperidine-H)，1.47(dd，2H，Ji = 12.00Hz，j2 = 8.00Hz，piperidine-H) .13C NMR(100MHz, DMS0_d6，ppm)5:156?61(C2-pyrimidine)，155.27(Ci_benzonitrile)，154.31,139.91， 136.89,133.26(2 X C,benzonitrile),132.52(2 X C,benzonitrile),129.84(2 XC,Ph), 127.42(2 XC,Ph) ,124.00,119.38,107.45,65.38,61.82,52.57,48.35,44.07(2 XC, piperidine),31.17(2XC,piperidine),16.30(2XC,CH3).ESI-MS:m/z 507.5(M+1) .C26H3〇N6〇3S[506.21].
[0045] 实施例2:甲基4-((4-(5-氨基-2-(4-氰基-2,6-二甲基苯酚)嘧啶-4-基胺)哌啶-1-基）甲基)苯甲酸（1-2)的制备
[0046] 1-2的制备方法同1-1，所不同的是使用甲基4-(溴甲基)苯甲酸（1.20mm〇l)代替4- 甲基磺酰基苄溴。产率70 ? 2% ? mp: 196-197°C ? NMR(400MHz，DMS〇-d6，ppm)S: 7 ? 95(d，2H，J = 8.00Hz,PhH) ,7.58(s,2H,benzonitrile-H) ,7.47(d,2H,J = 8.00Hz,PhH) ,7.26(s,lH, pyrimidine-H),6.48(d,lH ,J = 8.00Hz,NH),4.45(s,2H,NH2),3.85(s,3H,CH3),3.53(s,2H, benzyl-H) ,2.77(d,2H,J=12.00Hz,piperidine-H) ,2.04(s,6H,2XCH3) ,1.99(s,1H, piperidine-H) , 1.94(t,2H,J=12.00Hz,piperidine-H) , 1.79(d,2H,J = 8.00Hz, piperidine-H),1.46(dd,2H ,Ji = 12.00Hz j2 = 8.00Hz,piperidine-H) ,13C NMR(100MHz, DMS0_d6，卯m) 5 :166.63(C = 0)，156.61 (C2-pyrimidine)，155 ? 27 (Ci-benzonitri le)， 154.31,144.93,136.89,133.26 (2XC, benzonitri le) ,132.52(2XC, benzonitri le), 129.35(2 XC,Ph), 129.60(2 XC,Ph), 128.76,123.99,119.36,107.46,62.12,52.57,52.49 (2XC,piperidine) ,48.41,31.17( 2 X C, piperidine), 16.30 (2 X C, CH3). ESI-MS :m/z 487.6(M+1),509.5(M+23).C27H3〇N6〇3[486.24].
[0047] 实施例3:4-((4-(5-氨基一2-(4-氰基-2,6-二甲基苯酚)嘧啶-基胺）哌啶-1-基） 甲基)苯甲酸(1-3)的制备
[0048] 1-3的制备方法同1-1，所不同的是使用甲基4_(溴甲基)苯甲酰胺（1.20mmol)代替 4-甲基磺酰基苄溴。产率69 ? 8 % ? mp: 150-151°C ? NMR(400MHz，DMS〇-d6，ppm)S : 7 ? 94(s， lH，NH2)，7.85(d，2H，J = 8.00Hz，PhH)，7.58(s，2H，PhH)，7.38(d，2H，J = 8.00Hz，PhH)，7.37 (s，lH，NH2)，7.25(s，lH，pyrimidine-H)，6.51(d，lH，J=8.00Hz，NH)，4.47(s，2H，NH2)，3.49 (s,3H,benzyl-H,piperidine-H),2.77(s,2H,piperidine-H),2.04(s,6H,2 XCH3) ,1.90 (s,2H,piperidine-H),1.79(d,2H,J=8.00Hz,piperidine-H),1.44(s,2H,piperidine-H) ? 13C 匪R( 100MHz，DMS〇-d6，ppm)S : 168 ? 26(C = 0)，156 ? 60，155 ? 27，154 ? 30，136 ? 85， 133.48(2XC),133.27(2XC),132.53(2XC),128.95,127.92(2XC),124.02,123.95, 119.37,107.46,62.31,52.55(2 XC) ,48.43,31.72(2 XC) ,16.31(2 XC) ,ESI-MS:m/z 472 ? 5 (M+l), 494 ? 5 (M+23) ? C26H29N7O2 [ 471 ? 24 ]?
[0049] 实施例4:N4-(l-(4-(甲砜基)苄基）哌啶-4-基)-2-(2,4,6-三甲苯氧基）嘧啶-4， 二胺(1>4)的制备
[0050] 1-4的制备方法同1-1，所不同的是使用2,4,6_二甲基苯酚(0.308mmol)代替4-氰 基-2,6-二甲基苯酚。产率:40.0%.11^ :148-149°(：.111匪1?(4001抱，0150-(16，口口111)5:7.90((1， 2H,J=8.00Hz,PhH),7.59(s,2H,PhH),7.23(s,lH,pyrimidine-H),6.82(s,2H,PhH),6.34 (d,lH,NH),4.35(s,2H,NH 2) ,3.57(s,2H,benzyl-H),3.21(s,3H,CH3),2.77(d,2H,J = 8.00Hz,piperidine-H),2.21(s,3H,CH3) ,1.99(s,lH,piperidine-H),1.95(s,8H, piperidine-H,2XCH3),1.83(d,2H ,J = 8.00Hz,piperidine-H),1.47(dd,2H ,Ji = 20.00Hz, J2 = 12.00Hz,piperidine-H). 13C NMR(100MHz,DMS〇-d6 ,ppm)8：157.46(C2-pyrimidine), 154.43(Ci-benzonitrile),149.02,145.55,139.89,137.33,133.31 (2 X C, benzonitrile) ,130.46(2 XC,benzonitrile) ,129.81(2 XC,Ph) ,129.03(2 XC,Ph), 127.41,123.34,61.85,52.62(2XC,piperidine),48.16,44.08(2XC,piperidine), 31.80,20.80,16.30(2 XC,CH3) .ESI-MS:m/z 496.5 (M+l) , 498.5 (M+3). C26H33N5O3S [495.23],
[0051] 实施例5:甲基4-((4-(5-氨基一2-(2,4,6-三甲苯氧基）嘧啶-4-基胺）哌啶-1基） 甲基)苯甲酸(1-5)的制备
[0052] 1-5的制备方法同1-2,所不同的是使用2,4,6_二甲基苯酚(0.308mmol)代替4-氰 基-2，6-二甲基苯酚。产率：67 ? 1 % ? mp: 223-224°C，NMR(400MHz，DMS〇-d6，ppm)S: 7 ? 94(d， 2H ,J = 8.00Hz,PhH),7.46(d,2H ,J = 8.00Hz,PhH),7.24(s,lH,pyrimidine-H),6.82(s,2H, PhH)，6.34(d，lH，J = 8.00Hz，NH)，4.34(s，2H，NH2)，3.85(s，3H，CH3)，3.58(s，2H，benzyl-H),3.53(s,lH,piperidine-H),2.76(d,2H,J=12.00Hz,piperidine-H),2.12(s,3H,CH 3), 1.95(s,8H,piperidine-H, 2 XCH3),1.83(d,2H,J = 8.00Hz,piperidine-H), 1.46(dd,2H,Ji =12 ? 00Hz，J2 = 8 ? 00Hz，piperidine-H) ? 13C NMR( 100MHz，DMS〇-d6，ppm)S : 166 ? 63(C = 0), 157.47(C2-pyrimidine),154.43(Ci-benzonitrile),149.04,144.99,137.35,133.29, 130.46 (2 XC) ,129.59(2 XC) ,129.32(2 XC) ,129.02(2 XC) ,128.75,123.33,65.37, 62.13,52.61,52.49,48.22,31.83(2 XC,piperidine), 20.78,16.60(2 XC,CH3) .ESI-MS: m/z 476.4(M+l). C27H33N5O3[475.26],
[0053] 实施例6:甲基4-((4-(5-氨基一2-(2,4,6-三甲苯氧基）嘧啶-4-基胺）哌啶-1基） 甲基)苯甲酰胺(1-6)的制备
[0054] 1-6的制备方法同1-3,所不同的是使用2,4,6_二甲基苯酚(0.308mmol)代替4-氰 基-2，6-二甲基苯酚。产率：70 ? 1 % ? mp: 170-171°C ? 4 NMR(400MHz，DMS〇-d6，ppm)S: 7 ? 94(s， 1H，NH2)，7.85(d，2H，J = 8.00Hz，PhH)，7.38(d，2H，J = 8.00Hz，PhH)，7.32(s，lH，NH2)，7.23 (s,lH,pyrimidine-H),6.82(s,2H,PhH),6.37(d,lH,J = 8.00Hz,NH),4.36(s,2H,NH2), 3.58-3.50(b,3H,benzyl-H,piperidine-H),2.76(s,2H,piperidine-H),2.21(s,3H,CH3), 1.95(s,8H,2XCH 3,piperidine-H) ,1.82(d,2H,J = 8.00Hz,piperidine-H),1.44(d,2H,J = 12.00Hz，piperidine-H).13CMffi(100MHz，DMS0-d6，ppm)S :168.25(C = 0)，157.45(C2-pyrimidine) ,154.42,149.04,137.30,133.51,133.30,130.46(2 XC) ,129.02(2 XC), 128.93(2 XC), 127.91 (2 XC) ,123.36,62.14(CH2) ,52.57(2 XC, piperidine) ,48.23(CH, piperidine),31.17(2XC,piperidine),20.80(CH3), 16.76(2XC,CH3).ESI-MS:m/z 461.5 (M+l).C26H32N6〇2[460.26L
[0055] 实施例7:2-(2,4,6-三甲苯氧基)-N4-(l-(吡啶-4-基甲基)哌啶-4-基）嘧啶-4,5-二胺(1-7)的制备
[0056] 1-7的制备方法同1-4，所不同的是使用3-(溴甲基)P比啶盐酸盐（1.20mmo 1)代替4- 甲基磺酰基苄溴。产率：70.1% .mpdSg-ieCTCH NMR(400MHz，DMS0-d6，ppm)S:8.52(d，2H， J = 4 ? 00Hz，pyridine_H)，7.32(d，2H，J = 4.00Hz，pyridine_H)，7 ? 24(s，1H，pyrimidine-H)，6.82(s，2H，Ph-H),6.35(d，lH，J=8.00Hz，NH),4.45(s，2H，NH 2)，3.60(s，lH， piperidine-H),3.49(s,2H,benzyl-H),2.76(d,2H,J=12.00Hz,piperidine-H),2.51(s, 3H,CH3),1.98-1.95(b,8H,2XCH3)piperidine-H),1.83(d,2H,J = 12.00Hz,piperidine-H), 1.48 (dd, 2H ,Ji = 24.00Hz ,J2 = 12.00Hz, piper idine-H). 13C NMR( 100MHz , DMSO-de, ppm) 8：157.46(C2-pyrimidine),154.43,149.99(2XC),149.03,148.21,137.34,133.30, 130.46(2 X C)，129.03(3 X C) ,124.12(2 XC), 123 ? 34,61.26,52.63(2 XC，piperidine-C), 48.16,31,80(piperidine-C),20.79(CH3),16.30(2XC,CH 3) .ESI-MS:m/z 419.5(M+1) .C24H3〇N6〇[418.25].
[0057] 实施例8:(E)-4-(4-(l-(4-(5-羟苯基-3-戊烯基-1-炔基)苄基)哌啶-4-基胺)-5-氨基嘧啶-2-基氧基)-3,5_二甲基苯甲腈(1-8)的制备
[0058]中间体5'的制备方法如上所述，所不同的是使用3_(溴甲基）碘苯。中间体5' (0.18,0.171111111〇1)，双（三苯基膦）二氯化钯（0.00728,0.0102111111〇1)，碘化亚铜（0.0039 8， 0.020mmol)，共称于圆底烧瓶中，加入乙腈10mL后依次加入2-戊烯-4-炔-1-醇（0.0168g， 0.205_〇1，17.6此)和三乙胺（24此，0.171111111〇1)，氮气置换三次，65°(：反应10小时。反应结 束后，冷却至室温，减压蒸除溶剂，乙酸乙酯萃取(3X10mL)，有机相合并无水硫酸镁干燥， 过滤浓缩。得到的粗品置于圆底烧瓶中，加入四氢呋喃3mL和乙醇6mL，搅拌下加入二氯化锡 二水化物，氮气置换三次，70°C反应6小时。反应结束后，减压蒸除溶剂，甲醇复溶后加入碳 酸氢钠，过滤，滤液柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚重结晶得终产物1-8 .产率:23.1 % .mp: 152-154°C . XH NMR(400MHz,DMSO-de,ppm)8 ： 11.20(s,1H,NH),8.35-8.24(br,lH,0H),7.69-7.63(m,4H,J=4.00Hz,benzyl-H),7.56(s,lH,pyrimidine-H),7.52-7.48(m,2H,Ph-H), 6.40(d,lH ,J = 16.00Hz,-CH=CH-), 5.98(d,lH,J = 16.00Hz,-CH=CH-), 4.31 (d,2H,J = 16.00Hz,NH2),4.08(s,2H,CH2-0),3.59(s,2H,CH2-N),3.27(s,2H,piperidine-H),3.07(s, lH,piperidine-H),2.76(s,2H,piperidine-H),2.09(s,6H,2XCH 3),1.95-1.80(m,2H, piperidine-H).13CMlR(100MHz，DMS0-d6，ppm)S :160.48(C2-pyrimidine)，155.89， 153.66,146.29,133.04(2XC),133.00(2XC),132.92,132.36(2XC),132.06(2XC), 131.84,130.28,124.28,119.04,108.69,107.89,89.88,88.98,61.32(CH 2),58.50(CH2), 50.32(piperidine-C),47.61(piperidine-C),46.92(piperidine-C),27.90(2XC, piperidine-C) ,16.13(2XC，CH3) .ESI-MS:m/z 509.4(M+1) .C3()H32N6〇2[508.26] ?
[0059]实施例9:抗HIV活性实验(MT-4细胞模型）
[0060]具体实验方法参见① Pauwels R，et al.J.Virol.Methods.1988,20,309?② Pannecouque C,et al.Nat Protocols 2008,3,427.
[0061 ] 术语解释：
[0062] MT-4细胞:人急性淋巴母细胞白血病细胞；
[0063] MTT分析法:MTT即为3- (4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻 唑蓝。
[0064] DMS0:二甲基亚砜。
[0065] Nevirapine:抗艾滋病上市药物奈韦拉平。
[0066] Efavirenz :抗艾滋病上市药物依法韦仑。
[0067] Delavirdine:抗艾滋病上市药物地拉韦啶。
[0068] Etravirine:抗艾滋病上市药物依曲伟林。
[0069] 测试原理
[0070] 由于HIV感染的MT-4细胞在一定时间内（5-7天)会发生病变，因此向HIV感染的MT-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间（5-7天)的培养后，用MTT 分析法测定MT-4细胞活力，得到保护50%细胞免于细胞病变的药物浓度(EC 5Q)即可得出目 标化合物的抗HIV的活性。同时得到目标化合物使50 %未感染HIV的细胞发生病变的浓度 (CC50)，计算出选择系数(selectivity index，SI = CC5〇/EC5〇) 〇
[0071] MIT分析法原理:MIT即溴化-3-( 4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑氮，可与 活的细胞内琥珀酸脱氢酶相结合，而不与死亡细胞发生反应。目前MTT法是一种快捷反映细 胞活力的酶分析方法。
[0072]测试材料和方法
[0073] (1)HIV-1(IIIB)、HIV-2(R0D)毒株、HIV-1 双突变(K103N/Y181C)耐药株RES056:由 比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供。
[0074] (2)MT_4细胞：由比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供。
[0075] (3)MTT:购自美国 Sigma 公司。
[0076] (4)样品处理:样品临用前溶于DMS0配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个 稀释度。
[0077] (5)阳性对照药：Nevirapine(NVP)、ETV、Efavirenz(EFV)、Delavirdine(DLV) 〇
[0078] (6)测试方法:样品稀释后加入到HIV感染MT-4细胞悬浊液中，经过一段时间后用 MTT比色法测定细胞活力，于酶标仪中，在590nm下记录吸光度(A)值，计算出EC5〇、CC5q以及 SI〇
[0079] (7 )MTT染色法:加入样品培养一段时间后，再向每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20yL， 继续培养若干小时，弃染色液，并向每孔加入150yLDMS0，充分混合，于酶标仪中，在590nm下 记录吸光度。
[0080] 具体操作如下：将化合物用DMS0或水溶解后用磷酸盐缓冲液稀释，将3 X 105MT-4 细胞与1 〇〇yL不同浓度的化合物溶液在37 °C共同预孵育lh。然后向该混合物中加入1 OOyL适 当浓度的病毒稀释液，将细胞于37°C孵育lh。洗涤三次后，将细胞再次分别悬浮于含有或不 含化合物的培养基质中。接着将细胞在5%C0 2环境中，于37°C下再孵育7天，并于感染后的 第三天用含有或不含化合物的培养基质补充原培养液。每种培养条件都重复操作两次。对 病毒的细胞病变作用每天都用反向光学显微镜监控。一般来讲，本实验中所用的病毒稀释 液常常会在病毒感染后第五天发生细胞病变。药物抑制浓度以药物对病毒致细胞病变作用 产生50%抑制作用而同时对细胞无直接毒性的浓度(EC 5Q)表示。值得强调的是，当化合物水 溶性较差，需要用DMS0才能溶解时，DMS0体积比浓度相对于水来讲，一般会低于10 % (DMS0 在MT-4细胞培养介质中最终浓度小于2 % )。因为DMS0能影响测试化合物抗病毒活性，对含 有相同浓度DMS0溶液的抗病毒活性对比空白实验也应该平行操作进行。另外，DMS0最终浓 度（1/1000)远远低于影响HIV-1在MT-4细胞中复制所需浓度。
[0081 ]目标化合物的体外抗HIV-l(IIIB)及HIV-1临床常见双、单突变耐药株活性筛选数 据由比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供，所有的活性数据都经过至 少两次独立、平行的实验测得，结果见表1，2，3。
[0082] 表1化合物抗野生型HIV-l(IIIB)及双突变株(F227L/V106A，RES056)的细胞活性 和毒性
[0084] a:半数有效浓度;b:野生型HIV-1毒株;°:双突变HIV-1毒株; d:半数致死浓度。
[0085] 表2化合物抗多种单突变HIV-1病毒株(L100I，K103N，Y181C，Y188L，E138K)活性
[0086]
[0088] a:同表l;e:化合物对野生型和突变型HIV-1抑制活性的降低倍数;^单突变型HIV-1毒株。
[0089]表 3 化合物抗野生型 HIV-l(IIIB)及多种单（L100I，K103N，Y181C，Y188L，E138K)或 双(F227L/V106A，RES056)突变株的选择指数(SI)
[0091] 。心:同表l;g:治疗指数。
[0092] 实施例10:抗逆转录酶活性测试实验
[0093] 本实验采用色度法逆转录酶活性测定实验，所使用试剂盒Re verse Transcriptase Assay,colorimetric Version 13.0购自罗氏公司，阳性对照药物选用 卩，￡!7。（参见@11〇伽&11，厶.0.&8&的？〇证，8.&1^￥7，了.厶.（1985)￥化〇1(^7 147,326-335.@ Ukkonen,P.et al.(1988)Eur.J.Cl in.Microbiol.&Infect.Dis.7,518-523.)
[0094]测试原理
[0095]色度法逆转录酶活性测定使用模板/引物聚合物poly (A) Xoligo(dT)作为起始原 料，并用地高辛和生物素标记的核苷酸代替用放射性同位素[3H]_或[32P]_标记的核苷酸， 这些是此方法的优势之处。所合成出的DNA是测定逆转录酶活性的重要参数，检测和定量 DNA使用了以下三明治式的ELISA测定方法:生物素标记的DNA能够与包被了抗生物素链霉 菌素的微版模块(MP)的表面进行结合。在接下来的一步中，聚合了过氧化物酶的地高辛抗 体需要结合到地高辛标记的DNA上。最终，加入过氧化物酶的底物2，2-联氮-二(3-乙基-苯 并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS )，使它们在酶的催化作用下分解，产生带有明显颜色的产物。 通过酶标仪测定载有样品的微板吸光度，此吸光度值与逆转录酶的活性呈现直接的关联， 通过公式计算可得到化合物对逆转录酶的抑制浓度。
[0096]测试方法
[0097] (1)首先配置各种工作溶液，并将样品用适量DMS0溶解，并用裂解缓冲液稀释成5 个浓度梯度。在各个不同的反应管中，将4_6ng重组HIV-1-RT用裂解缓冲液(20yL/well)稀 释。同时，准备只有裂解缓冲液而没有RT的阴性对照组。然后每个反应罐加入20yl含有不同 浓度所测试样品的缓冲溶液以及20yL反应物混合液，在37摄氏度下孵育一个小时。
[0098] (2)准备足够的微版模块，按照方向牢固地安装在框架内。将孵育好的样品(60此） 转移到微板的孔中，用薄膜覆盖好后第二次37摄氏度孵育一小时。
[0099] 将溶液移除，每孔用洗液仔细地冲洗5遍，每遍用250此，保留30秒。每孔加入200yL 抗地高辛-过氧化物酶聚合物，将微板用薄膜覆盖好后第三次在37摄氏度下孵育一小时。
[0100] (3)将溶液移除，每孔用洗液仔细地冲洗5遍，每遍用250yL，保留30秒。每孔加入 200yLABTS溶液，在15-25摄氏度下孵育，直到绿颜色出现并足够通过光度检测（一般为10-30分钟）。
[0101] (4)用酶标仪测定载有样品在波长405nm处的吸光度值，通过以下公式计算可得化 合物对逆转录酶的抑制浓度。
[0102] 抑制率％ =(阳性对照荧光强度-样品荧光强度)/(阳性对照荧光强度-背景荧光 强度）X 100%进行线性回归，将抑制率带入线性方程，求得的浓度C既是IC5Q，单位是(yg/ mL)，再根据化合物分子量转化为yM，此实验选取了细胞活性突出的一个代表性化合物，以 及阳性对照药奈韦拉平(NVP)和依曲韦林(ETV)，实验结果见表4。
[0103] 表4代表化合物对HIV-1逆转录酶抑制活性
[0105]本发明对合成的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物进行了体外抗HIV病毒活性试验。 结果表明几乎所有化合物均具有了突出的抗野生型HIV-1活性，且大部分化合物对多种 HIV-1突变株(L100I、K103N、Y181C、Y188L、E138K)保持了纳摩尔的抑制活性，显著优于上市 药物NVP和DLV，并与EFV处于同一水平，特别是针对个别严重的单突变病毒如K103N和Y181C 本发明提供的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物较以上上市药物具有显著进步性，如化合物 1-1、1-4、1-6、对Y181C突变株的抑制活性较野生株下降在2-3倍之间，好于第二代NNRTI ETV，其下降倍数为5.3。再如对于突变病毒株￡1381(抑制作用，化合物1-4、1-6、1-7也具有显 著的优势，特别是1-4和1-6的抑制活性较野生株仅分别下降了 1.7和1.8倍，相较之下ETV抑 制活性则下降了 4.4倍。而对于临床上最严重的双突变病毒株?227八1064和1(103~八181(：， N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物也具有明显的抑制作用，活性在亚微摩尔到纳摩尔之间，普 遍优于上市药物NVP、DLV和EFV。此外，本发明提供的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物对细胞 的毒性较上市药物大大降低，特别是相对ETV，所涉及化合物的CC 5Q值提高了5.2-53.3倍。且 化合物1-1、1-3、1-6的选择指数不论是对野生型还是多种单或双突变型病毒株都远好于所 有阳性对照药物，具有显著的进步性。
[0106]在对代表性化合物进行的体外抑制HIV-1逆转录酶活性试验中，1-1的逆转录酶抑 制活性好于对照药NVP和ETV。鉴于以上显著的进步性和突出的技术效果，本发明提供的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物具有较大的开发价值，在此基础上进行新的结构修饰及深入 研究有助于开发出新的抗HIV药物。
【主权项】
1. N-取代赃晚胺-4-喀晚类衍生物或其药学上可接受的盐、醋或前药，其特征在于，具 有如下通式I所示的结构：其中， R为CH3、CN、面素或E-氛基丙烯基； X为-NH-、-〇-或-S-; η等于0或1; Ar为苯基或化晚基;所述的苯基可被邻间对单取代或多取代，取代基选自面素、N02、CN、 畑2、NHC 出、OH、COOH、CH2OH、CON 出、COOCH3、COOC 出邸3、0C 出、OCH2CH3、S〇2畑2、SO2CH3、C = CCH2C 出 0H或 C=C-CH=CH-C 出-OH。2. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于为下列结构的化合物之一：3.如权利要求1所述的N-取代赃晚胺-4-喀晚类衍生物的制备方法，其特征在于，包括 如下步骤：W5-硝基-2,4-二氯喀晚（1)为起始原料，与1-叔下氧幾基(Boc)-4-胺基赃晚在 Ξ乙胺的碱性条件下缩合得到中间体化合物2;与不同取代的苯酪，苯硫酪或苯胺经过亲核 取代反应得中间体化合物3,用Ξ氣乙酸脱去Boc保护基得到中间体化合物4,再与取代的苯 基或苄基反应得到中间体化合物5,将化合物5的硝基还原成氨基或与含烘取代基相连后再 还原得到终产物I; 合成路线如下：试剂和条件：（i)l-Boc-4-氨基赃晚，Ξ乙胺，四氨巧喃，0°C ; (ii)2，4，6-Ξ甲基苯酪或 4-径基-3,5-二甲基苯甲腊，碳酸钟，N，N-二甲基甲酯胺，60°C;(iii)S氣乙酸，二氯甲烧； (iV)取代的面节；（V)钮碳，氨气，乙醇；（Vi)双Ξ苯基憐二氯化钮，舰化亚铜，Ξ乙胺，2-戊 締-4-烘-1-醇，二氯化锡二水合物； 其中，R为CH3或CN;Ar为苯基或化晚基；所述的苯基对位被单取代，取代基为CON出、 C00CH3、SO2CH3、C 三 C-CH=CH-CH2-OH。4. 如权利要求2所述的N-取代赃晚胺-4-喀晚类衍生物的制备方法，其特征在于，包括 如下步骤： W5-硝基-2,4-二氯喀晚（Γ)为起始原料，与1-叔下氧幾基(Boc)-4-胺基赃晚在Ξ乙 胺的碱性条件下缩合得到中间体化合物2'；与不同Ξ甲基苯酪或3,5-二甲基-4-径基苯腊 经过亲核取代反应得中间体化合物3'，用Ξ氣乙酸脱去Boc保护基得到中间体化合物4'，再 与取代的苯基或苄基反应得到中间体化合物5'，将化合物5 '的硝基还原成氨基或与含烘取 代基相连后再还原得到终产物I; 合成路线如下：试剂和条件：（i)l-Boc-4-氨基赃晚，Ξ乙胺，四氨巧喃，0°C ; (ii)2，4，6-Ξ甲基苯酪或 4-径基-3,5-二甲基苯甲腊，碳酸钟，N，N-二甲基甲酯胺，60°C;(iii)S氣乙酸，二氯甲烧； (iV)取代的面节；（V)钮碳，氨气，乙醇；（Vi)双Ξ苯基憐二氯化钮，舰化亚铜，Ξ乙胺，2-戊 締-4-烘-1-醇，二氯化锡二水合物； R为C出或CN; Ar为苯基或化晚基；苯基对位被单取代，取代基为CON出、C00C曲、S〇2C出、C 三 C-CH=CH-CH2-OH。5. -种抗HIV药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或2所述化合物或其药学上可接 受的盐W及一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。6. 如权利要求1或2所述化合物在制备抗HIV的药物中的应用。
【文档编号】C07D401/14GK105968096SQ201610305178
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】刘新泳, 李潇, 展鹏
【申请人】山东大学