专利名称：治疗乳腺癌的cxcr4受体拮抗性多肽的筛选与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗乳腺癌转移药物，具体地说是一种治疗乳腺癌的CXCR4 受体拮抗性多肽的筛选与应用。
技术背景乳腺癌的发病率己逐渐上升到女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌细胞只有 转移到维持生命所必需的器官如肝和肺时，才会变得致命。降低死亡率的 最好方法是早发现、早治疗。发明一种能够早期发现和治疗乳腺癌的方法， 对于挽救乳腺癌病人的生命是十分重要的，是现代医学科学的一个重要任 务。现代医学研究认为远隔部位处转移灶的建立和生长依赖于肿瘤细胞和 宿主环境之间的相互作用。转移是若干个连续步骤的结果，是一种器官选 择性的过程。2001年Muller等在《Nature》杂志首次发表的关于趋化因子 受体CXCR4 (CXCchemokine receptor 4)与其特异性配体基质细胞衍生 因子(SDF-1， Stromal cell-derived factor-l)相互作用密切介导肿瘤转移的研究成果提供了乳腺癌转移分子机制的有力证据。他们证实乳腺癌转移的部位都是些高表达趋化因子受体配体SDF-la的部位，如肝、肺、骨。 癌细胞高表达趋化因子受体CXCR4,与配体SDF-1的结合是乳腺癌转移的 分子生物学基础。当SDF-la与CXCR4结合时，CXCR4活化Gai-蛋白-介 导的信号一Ras/MAP激酶和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) /AKt。阻断CXCR4 与SDF-la的相互作用能有效消弱乳腺癌细胞向局部淋巴结和肺组织的转 移。因此以趋化因子及其受体分子为药物靶点，在近十年引起了学术界和 医学研究单位的高度重视和注意。多种CXCR4受体的肽拮抗剂已被公开。 如Tamamura等人报道的CXCR4抑制剂T140在这些疾病中有着良好的治 疗前景。但是肽抑制剂的不适当的吸收、分布、代谢、排泄或毒性性质限 制了它们的临床应用。CXCR4特异性抑制剂AMD3100，其作为一种阻断 CXCR4-介导的病毒进入的抗-HIV药物进入临床试验，目前尚未有报道 AMD3100是否能够有效地阻断通过CXCR4调节的乳腺癌转移。更重要的是，临床研究显示AMD3100与心脏有关的副作用，近来被推出临床试验。 因此，针对CXCR4受体涉及癌症转移信号以及许多其他病原性疾病的 事实，鉴定新的有效的受体拮抗剂十分重要。本发明的一个目的是提供来源于趋化因子类似物特定序列，通过竞争 性结合抑制CXCR4受体信号而不引起生理性剌激作用的多肽药物。卡波济氏肉瘤相关的疱疹病毒编码的趋化因子vMIP-II (virus macrophage inflammatoiy protein-II )已证明是广谱的人趋化因子受体拮抗 剂。由人疱疹病毒8的K4基因编码，是一个广谱趋化因子受体拮抗剂， 特别是对CCR5和CXCR4有较高的亲和力。我们的目的是根据趋化因子 家族的结构相似性，通过对vMIP-II与其他趋化因子序列以及分子结构建 模对比，寻找趋化因子与受体结合相关的高度保守区，合成相应部位来源 于vMIP-II能具有CXCR4受体结合活性的多肽。这方面的内容大多国外文 献均在探索研究中或针对与fflV-l病毒的抗感染研究，而在乳腺癌转移方 面未见相关应用研究报道。首先通过对IL-8、 SDF-1 a 、 MIP-1 P 、 RANTES 进行X线晶体衍射和对其溶液中的结构研究表明CXC和CC类的趋化因子 单体都有相似的三维结构。每个趋化因子的C末端均有三股反平行的P-片层包绕的a -螺旋。趋化因子通过和相应受体的高亲和结合产生生物学功 能。对CXC及CC类趋化因子来说，N末端有很大的活动度，是和相应受 体高亲和作用的部位，而C末端a螺旋中带大量电荷的区域是和肝素或 GAG低亲和结合位点，这种低亲和结合对趋化因子发挥生物学功能极其重 要。趋化因子完全发挥其生物学功能需要高亲和结合和低亲和结合同时发 挥作用。基于SDF-la三维结构的分析，Crump等提出了 SDF-la和CXCR4 相互作用的双位点模型，即CXCR4 N端Glul5和Asp20通过静电吸引与 SDF-laN端Arg8和Argl2形成第一相互作用位点后，SDF-la N端处于无 序状态的第1 11位氨基酸(KPVSLSYRCPC)形成特定构象，并与CXCR4 螺旋区的凹槽结合，从而诱导CXCR4跨膜螺旋区的构象变化，CXCR4从 低能量构象状态进入过渡态，由此产生的静电信号促使CXCR4 ELC2 Argl88与ELC3 Glu277通过静电相互作用和氢键形成的盐桥断裂，暴露出 CXCR4ELC3 Asp262， SDF-laLysl与Asp262的侧链通过两个强氢键结合形成第二结合位点，CXCR4进入激活状态，从而启动下游的PKs或MAPKs 信号转导过程。通过EMBL Clustalw软件对比分析SDF-la与vMIP-II的 同源性，发现在N端有较大的同源性，SDF-laN端是结合趋化因子受体的 部位，而CXCR4是SDF-la的唯一受体，因此认为vMIP-II的N末端部 分主要结合CXCR4受体。同时NMR显示其N端具有较大流动性，可伸 入溶液中并具有二级结构，5 8个残基组成的圈样结构，和其他构像之间 能快速转换，提示在小片段的N端趋化因子肽的结构和他们结合受体的能 力间可能有联系。我们通过化学合成法合成N端21个氨基酸多肽，命名 为NT21MP，并通过D型氨基酸修饰增强其结合活性。由于此合成肽不包 含具有生物学活性的C端结构域，因此与CXCR4结合后不引起胞内Ca2+ 迅速内流，故不引起信号传导，从而对细胞增殖、趋化及黏附活性未见激 活作用，但可通过竞争性结合作用对趋化因子与相应受体的结合起到拮抗 作用。在体内外药效实验中均表现出抗乳腺癌活性。前哨淋巴结(SLN)是原发肿瘤发生淋巴结转移所必经的第一批淋巴 结。作为阻止肿瘤细胞从淋巴道扩散的屏障的临床意义已受到人们的重视。 通过对SLN定位活检，预测区域淋巴结转移情况，可避免腋窝淋巴结的盲 目清扫，是乳腺癌手术治疗技术的又一次革命。准确定位和活检SLN是成 功预测腋窝淋巴结转移的关键。乳腺癌SLNB归纳起来有三种方法 一是 利用生物染料使淋巴管淋巴结着色的方法，二是注射放射性胶体，用淋巴 闪烁显像和Y计数器探测仪检测的方法，三是联合应用生物染料与放射性 胶体识别的方法。活体染料注射法是用蓝色染料显示淋巴引流的路径，并 利用淋巴引流路径上淋巴结出现的顺序以及相对于肿瘤的位置，协助SLN 的定位。活体染料注射法虽然有简单、价廉、无放射性污染等优点，但由 于各种染料的注射方法及用量没有统一的标准，假阴性率高达30% 40%; 而且，在寻找SLN时比较盲目，若SLN离肿瘤部位较远时寻找更为困难。 放射性核素标记法是利用放射性核素的示踪作用协助定位SLN的方法，术 前应用淋巴闪烁显像或术中应用Y计数器探测仪定位追踪探测"热"结节， 即为SLN。核素标记物普遍采用99mTc。常用的被标记物有硫胶体、葡聚糖 等。应用放射性核素标记法定位SLN，大多数学者研究结果表明此方法是可行的，是一种有前途的方法。但由于目前所用的放射性药物没有一种有很高的SLN的检出率的效果，各人报道的假阴性率从0%~12%不等，其效 果还不尽人意。综上所述，为了进一步提高SLN定位的准确性，满足临床 需要，探索一种新的淋巴显像剂更显迫切。CXCR4受体在转移性乳腺癌细 胞表面高表达，是乳腺癌细胞比较特异的生物学标志物。将其应用于SLN 的检测定位应该有其无可比拟的优越性。我们通过采用放射性核素对 CXCR4特异性拮抗肽NT21MP进行标记，利用受配体结合效应，可靶向 特异性的定位于转移的淋巴结，提高SLN定位的准确性和特异性，探索一 种SLN定位的新途径。可作为临床术前和术中前哨淋巴结检测指标，准确 反应区域淋巴结的转移情况。因而更敏感并减少因淋巴管阻塞造成的假阴 性；另一方面，通过不同的放射性标记，可通过靶向受体配体结合作用， 于术后靶向定位于转移部位行局部放射治疗。经广泛查阅国内外各种公开出版物和医学教科书，广泛检索世界各国 专利资料，均未见有与本发明相同的治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多 肽的筛选与应用方法的发明，尤其是放射性标记后前哨淋巴结的检测和术 后耙向放射性治疗。因此本发明具有新颖性和创造性，由于本发明在制药 工业中有着重要的应用，所以本发明具有实用性。经检索，专利文献中与治疗乳腺癌有关的多肽的发明，仅有日本肿瘤 疗法科学股份有限公司申请的申请号200580034527.5的"与乳腺癌相关的 基因和多肽"一项。该申请提供了新的人体基因B1194、A2282V1、A2282V2、 A2282V3，它们的表达在乳腺癌中显著增加。这些基因及其编码的多肽， 可用于例如诊断乳腺癌，并作为开发抗乳腺癌药物的靶分子。该发明的技 术内容与本发明完全不同，具有不同的技术路线和方法，是完全不同的两项发明。因此本发明具有新颖性和创造性。 发明内容本发明目的有三 一是提供用于治疗或预防与病原性或不希望的CXCR4受体活性和/或信号相关的疾病的多肽药物。尤其是，现认为本发 明提供的多肽药物干扰生理性SDF-la配体与CXCR4受体的结合，并且抑 制受体的活性以及随后的下游信号途径。提供了在有此需要的宿主中靶向诊断或者耙向治疗，抑制乳腺癌细胞生长和降低转移的多肽药物。因此，本发明的首要目的在于提供一种对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效 应、无生理性剌激作用的天然来源蛋白成份。通过生物信息学比对，确定 来源于HHV8 MIP-II特异结合CXCR4受体的氨基酸序列，为提高其生物 学活性，进行部分氨基酸的D型修饰。二是在此所述的多肽药物具有与 CXCR4受体相互结合的能力，可标记后靶向诊断前哨淋巴结转移状况。三 是通过多肽特异性的结合CXCR4，可通过放射性标记的多肽药物提高局部 放疗浓度。因此本发明的主要内容是该药物来源于HHV8 MIP-IIN端21个氨基 酸，是以对趋化因子受体CXCR4的拮抗作用为基础，并通过D型氨基酸 修饰提高其生物学活性；通过"mTc-合成肽靶向诊断前哨淋巴结转移状况； 通过放射性标记的合成肽提高原发灶和转移部位的放疗浓度。本发明来源于HHV8 vMIP-II的CXCR4受体拮抗活性多肽NT21MP 包含了 vMIP-II结合趋化因子受体CXCR4的活性位点，具有特异结合 CXCR4受体的活性，能阻断SDF-la/CXCR4间的相互作用，而具有抗乳腺 癌转移的作用。通过标记的NT21MP—方面可靶向诊断前哨淋巴结转移状 况，指导手术清扫区域；另一方面，提高局部放疗浓度，从而提高疗效， 减少副作用。同时，它作为一个CXCR4受体特异的拮抗剂，在治疗HIV/ 艾滋病感染等CXCR4受体相关的疾病具有良好的作用，在制药工业具有 光明的前景。本明的目的通过下述技术方案实现的一种治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多肽的筛选与应用，来源于 HHV8 MIP-II N端特异结合CXCR4受体多肽的制备与标记，应用于 CXCR4介导的乳腺癌靶向诊断与靶向放射性治疗。治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多肽来源于HHV8 MIP-II N端部分 氨基酸序列，通过化学合成法并进行D型氨基酸修饰获得。NT21MP具有特异性结合CXCR4的作用，并无生理性生物活性作用， 是趋化因子受体结合剂。NT21MP可下调乳腺癌细胞的CXCR4的活性表达，对SDF-1引起细胞粘附和趋化有剂量依赖的阻断作用，可阻断SDF-la/CXCR4间作用，是 CXCR4受体的封闭剂。NT21MP可用于治疗趋化因子受体CXCR4相关疾病如恶性肿瘤的转 移和HIV-1感染等。NT21MP可抑制乳腺癌原发瘤的生长、腋窝淋巴结转移和肺转移结节 的形成。NT21MP可用99mTc标记。标记的99mTc-NT21MP可耙向结合与乳腺癌 转移小鼠的腋窝淋巴结。通过放射性标记多肽，可术前术中靶向诊断乳腺癌转移淋巴结和术后 靶向放射性治疗。NT21MP可下调HER2的表达，并提高Herceptin抑制乳腺癌细胞株增 殖的药物敏感性。本发明来源于HHV8 MIP-II的CXCR4受体拮抗活性肽是利用趋化因 子家族高度同源的特点，利用多序列比较分析来寻找与CXCR4受体结合 的多个趋化因子间的高度保守区，也就是它们可能与CXCR4受体结合相 关的区域或残基。通过分子三维空间显示的方法来分析这些位点的空间位 置的基础上遴选出包含有CXCR4受体结合位点的而且来源于vMIP-II的 多肽片段，并利用生物信息学软件分析多肽片段是否具有与CXCR4特异 结合的生理性趋化因子相应部位相似的空间结构。然后通过化学合成法取 得相应的源于vMIP-II的CXCR4受体拮抗活性多肽。本发明所述的多肽的前十个氨基酸进行D型氨基酸修饰，增强了其受 体结合活性。本发明所述的多肽具有特异性结合CXCR4的作用，但无生理性生物 学活性作用，是趋化因子受体的封闭剂。可下调细胞表面CXCR4的表达， 并抑制生理性趋化因子SDF-la对CXCR4高表达乳腺癌细胞的粘附和趋化 活性。本发明所述多肽能与体内生理性趋化因子竞争结合趋化因子受体，从 而阻断生理性趋化因子引起信号传导作用，在趋化因子受体相关疾病如恶 性肿瘤的转移，重症贫血，动脉粥样硬化等有治疗作用。本发明所述多肽可抑制乳腺癌原发肿瘤的生长，并可抑制腋窝淋巴结 和肺转移。本发明所述的多肽可下调PCNA，上调乳腺癌细胞的凋亡指数。本发明所述的多肽具有下调乳腺癌细胞株表面受体HER2的表达，从 而增加HER2特异性拮抗剂Herceptin的药物敏感性。本发明所述多肽具有特异性结合CXCR4的作用，可靶向诊断乳腺癌 患者前哨淋巴结转移状况。并可靶向增强肿瘤原发和转移部位局部放疗。经广泛査阅国内外各种公开出版物和医学教科书，广泛检索世界各国 专利资料，均未见有与本发明相同的治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多 肽的筛选与应用方法的发明。尤其是放射性标记后前哨淋巴结的检测和术 后靶向放射性治疗，因此本发明具有新颖性和创造性。由于本发明在制药 工业中有着重要的应用，所以本发明具有实用性。由于乳腺癌的发病率已 逐渐上升到女性恶性肿瘤的首位，所以本发明具有重要的意义。本发明的优点是(1)来源于趋化因子类似物的部分序列，仅结合受体 而无生理性刺激作用；(2)合成的多肽序列来源于乳腺癌转移中起关键作用 的趋化因子受体CXCR4的唯一配体类似物，因此具有高特异性结合活性， 阻断生理性趋化因子的趋化作用，可阻断乳腺癌的靶器官转移能力；(3)标 记的合成肽通过受体配体特异性结合， 一方面将其放射性与正常组织预定 阈表达水平进行比较，评价前哨淋巴结转移状况，从而指导手术清扫区域; 另一方面，通过特异性的受体配体结合靶向作用，使局部放射性治疗效果 提高。说明书附1为发明的NT21MP与CXCR4受体生理性趋化因子SDF-la的多重 序列对比分析，保守性极高的残基位置由星号标记在序列下方的相应位置， 保守性稍低的残基由打点标记出来；图2 SDF-la与CXCR4受体结合模式图；图3 SDF-la和vMIP- II核磁共振图比较；图4不同浓度NT21MP作用后MCF-7和SKBR3细胞CXCR4的蛋白 表达(X400)。 A ，a.对照组；B，b. NT21MP Q.5昭；C， c. NT21MP 2吗；D，d.NT21MP IO吗；E,e. NT21MP 50ng/ml. A~E. MCF-7细胞；a~e. SKBR3细 胞；图5不同浓度NT21MP作用后SKBR3和MCF-7细胞中CXCR4蛋白 的表达。l.对照组；2. NT21MP lpg/ml; 3. NT21MP 10pg/ml; 4.对照组；5. NT21MP lng/ml; 6. NT21MP 10吗/ml.其中1~3为SKBR3细胞；4 6为 MCF-7细胞；图6不同浓度NT21MP作用后SKBR3和MCF-7细胞中CXCR4 mRNA 的表达。M为Marker; l.对照组；2. NT21MP ljig/ml; 3. NT21MP 10jig/ml; 4. 对照组；5. NT21MP l吗/ml; 6. NT21MP 10pg/ml.其中1~3为SKBR3细胞； 4 6为MCF-7细胞；图7 NT21MP对乳腺癌细胞MCF-7细胞的黏附抑制作用；图8 NT21MP对乳腺癌细胞MCF-7细胞的趋化抑制作用；图9不同浓度NT21MP对乳腺癌细胞株SKBR3细胞周期变化的影响。 A.对照组；B.NT21MPlpg/ml;C.NT21MP10|ig/ml;
图10不同处理组对乳腺癌细胞株SKBR3细胞周期变化的影响。A: 对照组;B:多肽处理组;C: Herceptin处理组;D:联合用药组；图11荷乳腺癌小鼠肿瘤大小。1. NT21MP 500pig/Kg; 2. NT21MP 50ng/Kg; 3. NT21MP 5pg/Kg; 4.多西他赛17.86pg/Kg +NT21MP 50pg/Kg; 5.多西他赛17.86pg/Kg/;图12荷乳腺癌小鼠转移组肿瘤大小和肺转移结节。1. NT21MP 500pg/Kg; 2. NT21MP 50^g/Kg; 3. NT21MP 5ng/Kg; 4. Herc印tin 36.04jig/Kg+NT21MP 50ng/Kg; 5. Herc印tin 36 g;图13荷乳腺癌小鼠肺转移HE染色。l.NT21MP500ng/Kg;2.NT21MP 50pg/Kg; 3. NT21MP 5pg/Kg; 4. Herc印tin 36.04pg/Kg + NT21MP 5(Hig/Kg;5.Herc印tin 36.04pg/Kg; 6.荷乳腺癌小鼠未用药组；图14 99 Tcm-NT21MP在荷乳腺癌小鼠放射性活性。图15荷乳腺癌小鼠肿瘤细胞PCNA检领!)(X200)丄NT21MP500)ig/kg; 2. NT21MP 50ng/kg; 3. NT21MP 5pg/kg; 4. NT21MP 50pg/kg+Herc印tin 36.04吗/kg; 5. Herc印tin 36. 04pg/kg; 6.荷乳腺癌小鼠未加药组；7.试剂盒阳性片；8.阴性对照组；图16荷乳腺癌小鼠肿瘤细胞凋亡检测(X200)。 1. NT21MP500吗/kg; 2. NT21MP 50pg/kg; 3. NT21MP 5pg/kg; 4. NT21MP 50ng/kg+Herc印tin 36.04pg/kg; 5. Herc印tin 36. 04|ig/kg; 6.荷乳腺癌小鼠未加药组；7.试 剂盒阳性片；8.试剂盒乳腺癌标本对照组；具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明进一步说明。实施例1， vMIP-II与CXCR4受体结合因子的多重序列对比分析 先选用与CXCR4受体特异结合的人源性趋化因子序列进行基于结构 的多重序列对齐分析，在全部趋化因子序列中均存在的残基即可能是与该 受体结合有关的残基(即标准结合残基模型的建立)。再将vMIP-II的序列 引入标准结合残基模型中进行多重序列比较分析从而得出vMIP-II与该受 体结合有关的残基即vMIP- II与受体结合高度相关的残基。我们对从NCBI 获得的几种趋化因子的蛋白序列进行了序列比对(包括IL-8、 SDF-la、 MIP-1P、 RANTES)。从结果看，趋化因子的C末端均有三股反平行的P -片层包绕的a-螺旋，带大量的电荷，是和肝素或GAG低亲和结合位点， 这种低亲和结合对形成趋化梯度、稳定高亲和力结合、刺激细胞的活化都 有作用。而N末端有很大的活动度，是和相应受体高亲和作用的部位，趋 化因子通过和相应受体的高亲和结合产生生物学功能。趋化因子完全发挥 其生物学功能需要高亲和结合和低亲和结合同时发挥作用。由于SDF-la 唯一的受体是CXCR4，因此推测SDF-1 a的N端可能是结合CXCR4的部 分。采用EMBLClustalw软件进行蛋白序列多重对齐比较分析SDF-lct和 vMIP-II的同源性。从图1 (在比对下方， 一些位点被标记为星号或圆点，这些标记分别 显示这些残基在序列中是绝对或是高度保守的)的结果可以看出vMIP-II 与SDF-1 a具高度同源性，SDF-1 a与CXCR4结合位点的主要在变异较 大的N端，而SDF-1 a N端前23个和vMIP- II N端前20个氨基酸序列为 信号肽。因此，根据图1上面序列分析和残基空间位置分析结果，可以设 计对应CXCR4受体结合理论位点的多肽，具有结合CXCR4活性，但无生理性趋化因子的生物学活性。本发明的源于HHV8 MIP-II的CXCR4受体 拮抗活性多肽分别包含对应CXCR4结合理论位点的多肽，序列是 LGASWHRPDKCCLGY(NT21MP)。并将前1 10个氨基酸进行D型氨基 酸修饰。实施例2， NT21MP的制备。本发明所述的多肽是在生物信息学分析的基础上，得到vMIP-II与 CXCR4受体的结合位点，然后通过化学合成法获得。实施例3, NT21MP下调乳腺癌细胞表面表达的CXCR4受体。 SK-BR3及MCF-7乳腺癌细胞株分别加不同浓度的NT21MP处理后， 分别以免疫组化、RT-PCR及Western blot法，检测NT21MP对细胞表面 CXCR4受体蛋白表达的影响。实验结果显示，相对与阴性对照组，NT21MP 可明显降低细胞内CXCR4的表达量。实施例4， NT21MP的对乳腺癌细胞的趋化、黏附和增殖活性。 SKBR3细胞预先用不同浓度NT21MP处理后，分别加到平板内和 Transwell趋化小室上室。未经NT21MP处理的细胞作为空白对照，用含有 SDF-la (stromal cell-derived factor-la)的培养基作为阳性对照。观察 NT21MP作用下SKBR3细胞的黏附和趋化活性。实验结果显示NT21MP 具有特异性结合趋化因子受体CXCR4的作用，是一个高效而特异的 CXCR4拮抗剂，能结合趋化因子受体，却不引起乳腺癌细胞趋化、黏附及 增殖活性，为趋化因子受体的封闭因子。实施例5， NT21MP对生理性趋化因子引起的细胞趋化抑制实验。 SKBR3细胞预先分别用不同浓度的NT21MP处理30min。未经多肽 处理的细胞作为空白对照。加到Transwell趋化小室上室，下室加1640培 养基(含SDF-la)，孵育30min，收集迁移到下室的细胞并用血细胞记数 板记数。观察NT21MP封闭SKBR3细胞表面的趋化因子受体而导致的趋 化抑制作用。实验结果显示，NT21MP对SDF-1引起细胞趋化有剂量依赖 的阻断作用，是CXCR4受体的拮抗剂。乳腺癌转移正是以特异性耙器官 表达的SDF-la对高表达CXCR4的乳腺癌趋化作用实现的。NT21MP通过 拮抗和封闭CXCR4受体，与体内生理性趋化因子竞争结合趋化因子受体，有效阻断SDF-lci/CXCR4的相互作用，阻断SDF-la引起的白细胞趋化 活动以及细胞内钙离子流动，具有抗乳腺癌转移的作用。实施6, NT21MP对乳腺癌细胞株CXCR4表达及细胞周期的影响。 为进一步探讨NT21MP生物学活性的潜能及其可能的信号机制，通过 RT-PCR、免疫组化、共聚焦显微镜和流式细胞仪检测NT21MP对乳腺癌 细胞株SKBR3中CXCR4表达和细胞周期的影响。结果显示，SKBR3细 胞高表达CXCR4和HER2。 NT21MP显著下调SKBR3细胞中CXCR4受 体的表达。通过细胞周期测定，NT21MP在lug至lOug的浓度范围对 SKBR3细胞周期影响与对照组相比无明显变化(P〉0.05)。实施例7， NT21MP对乳腺癌化疗药物多西他赛和郝赛汀的敏感性影响。为进一步了解CXCR4与HER2在癌转移机制中的相关性，我们选择 了两者均高表达的细胞株SKBR3。 NT21MP和Herceptin可下调SKBR3细 胞中CXCR4和HER-2的表达；Herceptin显著抑制SKBR3细胞的生长。 与NT21MP联合用药后增加了 herceptin的敏感性；herceptin作用后细胞周 期阻滞于G1期，并且能减少S期的比例，与NT21MP联合作用后，细胞 周期又进一步阻滞于G2期，S期细胞进一步降低。实施例8，体内抗乳腺癌发展及抑制转移作用。已建立近交系小鼠BALB/C小鼠，乳腺癌细胞株4T1建立的乳腺癌小 鼠模型。试验以乳腺癌临床化疗药物多西他赛为抑瘤组阳性对照，以郝赛 汀为转移组的阳性对照。NT21MP设不同剂量组及联合用药组，静脉注射 给药，每日一次，连续给药4w，每5天停药2天。结果显示，在成功制造 动物模型的基础上，各剂量组NT21MP抗小鼠乳腺癌的效应与阴性对照组 比较有明显的抗肿瘤增殖和抑制肿瘤转移的治疗作用，肺转移结节明显减 少减小；在小鼠乳腺癌模型中，除检测上述指标以外，检测了肝、肾功能 的生化指标，结果显示NT21MP明显改善肝肾功能，血清ALP、 ASP及肌 酐均较未用药组明显下调，差异有显著性意义；采用免疫组化S—P法检测 PCNA，结果显示，相对于阴性对照组，多肽作用下PCNA指数呈剂量依 赖性下调(尸<0.01)，尤其以联合用药组明显；TUNEL法检测小鼠肿瘤组织凋亡，阳性结果判定标准为凋亡的细胞核中有棕黄色颗粒。凋亡指数AI (凋亡细胞个/104ixm2) =10个视野凋亡细胞的平均数/每个视野的面积。 结果阴性对照组凋亡细胞形态典型，相对于阴性对照组，多肽用药组凋亡 指数呈剂量依赖性提高(P<0.01)，以联合用药组显著。 实施例9， NT21MP的同位素标记及前哨淋巴结的检测。 以"m丁c标记NT21MP，放射性标记率〉98%。小鼠种瘤7天，出现肿 块后，分4点注射于肿块周围腺体内，按摩乳腺数分钟。剥离腋窝淋巴结， 制备匀浆，以Y探测仪测定放射性活性。转移判定标准，以测定淋巴结放 射性活性高于空白对照组10倍以上，同时送肺组织标本常规病理检査， HE染色。结果显示，腋窝淋巴结阳性率与肺转移有直接相关性。上述本发明的实施例，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员 来说，本发明可以有类似的变化和更改。凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改，改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多肽的筛选与应用来源于HHV8 MIP-II N端特异结合CXCR4受体多肽的制备与标记，应用于CXCR4介导的乳腺癌靶向诊断与靶向放射性治疗。
2. 如权利要求1所述的治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多肽的筛选与应 用，其特征在于来源于HHV8MIP-IIN端部分氨基酸序列，通过化学合成 法并进行D型氨基酸修饰获得。
3. 如权利要求2所述的治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多肽的筛选与应 用，其特征在于NT21MP具有特异性结合CXCR4的作用，并无生理性生物 活性作用，是趋化因子受体结合剂。
4. 如权利要求3所述的治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多肽的筛选与应 用，其特征在于NT21MP可下调乳腺癌细胞的CXCR4的活性表达，对SDF-1 引起细胞粘附和趋化有剂量依赖的阻断作用，可阻断SDF-ld/CXCR4间作 用，是CXCR4受体的封闭剂。
5. 如权利要求4所述的治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多肽的筛选与应 用，其特征在于NT21MP可用于治疗趋化因子受体CXCR4相关疾病如恶性 肿瘤的转移和HIV-1感染等。
6. 如权利要求4或5所述的治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多肽的筛选 与应用，其特征在于NT21MP可抑制乳腺癌原发瘤的生长、腋窝淋巴结转 移和肺转移结节的形成。
7. 如权利要求2或3所述的治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多肽的筛选 与应用，其特征在于NT21MP可用"，c标记。标记的99mTc-NT21MP可耙 向结合与乳腺癌转移小鼠的腋窝淋巴结。
8. 如权利要求2至7中任一权利要求所述的治疗乳腺癌的CXCR4受体拮 抗性多肽的筛选与应用，其特征在于通过放射性标记多肽，可术前术中耙 向诊断乳腺癌转移淋巴结和术后耙向放射性治疗。
9. 如权利要求2或3所述的治疗乳腺癌的CXCR4受体拮抗性多肽的筛选 与应用，其特征在于NT21MP可下调HER2的表达，并提高Herceptin抑制 乳腺癌细胞株增殖的药物敏感性。
全文摘要
本发明提供了作用于治疗CXCR4受体介导的乳腺癌的多肽药物的筛选、修饰方法、标记及其应用。比较人源性趋化因子SDF-1α与人疱疹病毒8 MIP-II的同源区域，得到vMIP-II与CXCR4受体的结合位点，获得CXCR4特异结合活性肽。具有特异结合CXCR4的作用，阻断生理性SDF-1α与CXCR4的结合，是一个高效而特异的趋化因子受体拮抗剂。可抑制野生型SDF-1α对乳腺癌细胞的趋化活性及乳腺癌细胞的生长，同时抑制CXCR4阳性肿瘤细胞的生长和转移，具有双重靶效应。本发明还提供标记性多肽靶向定位于前哨淋巴结和转移部位，用于乳腺癌术前术中前哨淋巴结转移状况的检测和靶向放射性治疗。
文档编号G01N33/68GK101334411SQ20081001686
公开日2008年12月31日 申请日期2008年6月17日 优先权日2008年6月17日
发明者丁勇兴, 杨清玲, 陈昌杰 申请人:杨清玲