专利名称：一种邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法
技术领域：
本发明涉及一种酞酸酯残留检测方法，具体的说是对邻苯二甲酸二己酯的 一种酶联免疫检测方法，属于免疫检测技术领域。
背景技术：
邻苯二甲酸二己酯(di-n-Hexyl phthalate， DHP )是酞酸酯的一种。酞酸酯作 为增塑剂在塑料的加工生产中尤其是聚氯乙烯(PVC)的加工生产中被广泛的使 用。由于酞酸酯增塑剂与塑料基质之间没有形成共价键，而是以氢键和范德华 力连接，彼此保持各自独立的化学性质，因而在接触到包装食品中所含的水、 油脂时便会溶出。经过研究发现酞酸酯是一种环境激素物质，它千扰生物为保 持体内平衡并调节生长过程的正常激素的产生、释放、转移、代谢、反应和消 除，或在未受损的生物后代中引起不良的健康影响和内分泌功能的改变。美国 环保局将六种酞酸酯列入重点控制的污染物名单中，我国优先污染物黑名单中 包括邻苯二甲酸二己酯。目前，国内外有关邻苯二甲酸二己酯的检测主要有高 效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC -MS)等，但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要 求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检 测对快速、方便、准确的要求。近年来，国内外己经开展了对酞酸酯类免疫分 析方法的研究，但国内外尚没有针对邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测的报道， 为了弥补这一空白，有必要针对邻苯二甲酸二己酯建立一种酶联免疫检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测邻苯二甲酸二己酯残留的免疫学检测 方法并且有较高的灵敏度和特异性。
本发明的技术方案利用胥传来、徐丽广、马伟等(一种邻苯二甲酸二己酯 人工抗原的制备方法)合成的免疫原免疫得到多克隆抗体，以邻苯二甲酸二己
酯半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了邻苯二甲酸二己酯残留的间接
竞争酶联免疫法。
一种邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法，步骤如下 (1)抗原的包被
以邻苯二甲酸二己酯半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物作为包被抗原，以0.05M、 pH9.6的碳酸盐缓冲溶液将包被抗原以1:5000 l:8000进行稀释，作为 包被液，在酶标板的每孔中加入100pL， 4'C孵育过夜，然后用含0.1%明胶的 上述碳酸盐缓冲液20(VL/孔作为封闭液，封闭2h;
(2) 竞争反应
每孔分别加入以标准品稀释液PBST稀释的0.01ng/mL、 0.1ng/mL、 0.5ng/mL、 lng/mL、 5ng/mL、 10ng/mL、 20ng/mL系列浓度之一的邻苯二甲 酸二己酯标准品或处理好的样品50pL到各自的酶标孔中，将免疫制备的邻苯 二甲酸二己酯多克隆抗体以抗体稀释液含0.1%明胶、含0.05%吐温-20、 pH 7.4、 0.01M的磷酸盐缓冲溶液PBST，按1:6000 1:9000比例稀释后，加入 酶标板中，每孔加50jiL， 37。C孵育lh后以PBST洗涤液洗涤3 5次；
(3) 加酶标二抗
以抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP以1:3000 1:5000 进行稀释，每孔加100pL， 37'C温育lh后以PBST洗涤液洗涤3 5次；
(4) 显色
每孔加入显色液100pL， 37'C显色15min;最后每孔加入终止液2M硫 酸溶液lOOpL;用酶标仪450nm测吸光值A45。，与所作标准曲线对比算出待 测样品的邻苯二甲酸二己酯浓度。
显色液配方A液0.933 g柠檬酸，3.68 gNa2HPCV12H20， 18 |iL30%H2O2 用超纯水定容至lOOmL; B液60mg3乂5,5C四甲基联苯胺溶于100mL乙二 醇中；使用前将A液与B液以5:1体积混合。
标准品稀释液PBST为含0.15mol/LNaCl、含0. 5%吐温-20的0.01mol/L、 pH7.4PBST溶液。
更详细的步骤为
主要溶液配制
1) 配制磷酸盐0.01M(PBS)缓冲液 Na2HP04 12H20 3,62 g KH2P04 0.2 g NaCl 0.2g KC1 8.0g 加超纯水稀释至1000 mL。
2) 配制碳酸盐(CBS)缓冲溶液(0.05M) pH9.6 Na2C03 1.59g
NaHC03 2.93g 加超纯水稀释至1000 mL。3) 配制PBST溶液含0.05% Tween—20的PBS溶液。
4) 配制封闭液含0.1%明胶的碳酸盐缓冲液。
5) 配制抗体稀释液含0.m明胶的PBST溶液。
6) 显色液
A液:0.933 g拧檬酸，3.68 gNa2HP04'12H20， 18 |iL30%H2O2用超纯水 定容至100 mL;
B液60 mg3,3",5,5^四甲基联苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中； 使用前将A与B以5:1体积比混合。
7) 终止液2M的H2S。4。 间接竞争ELISA实验方法的步骤如下
预先将邻苯二甲酸二己酯的标准品配制成100吗/mL的甲醇溶液作为工作 母液，在4。C保存待用。配制PBST溶液(0.01mol/L， pH7.4， 0.15mol/LNaCl， 0.5%Tween-20)，以此为基础配制系列反应液，用以稀释竞争物标准液和抗血清。
a、 包被用设定浓度的包被原包被酶标板，100pL/孔，4'C过夜。
b、 洗涤:用PBST洗涤酶标板3次，每次3min, 20(VL / L，然后甩干酶标板。
c、 封闭含0.1%明胶的包被缓冲液，20(HiL/孔37。C封闭2h。
d、 洗涤同b。
e、 竞争:用PBST将邻苯二甲酸二己酯稀释成O.Ol， 0.1， 0.5， 1， 5， 10， 20ng/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照，50fiL /孔。然后每孔加入50|iL 稀释8100倍的抗血清，于37。C温育lh。
f、 洗涤同b。
g、 加酶标二抗(羊抗兔GAR-HRP， 1:4000 ), lOO(iL /孔，37 C反应lh。
h、 洗涤:同b。
i、 显色加显色液100pL/孔，显色15min。 j、终止加终止液100(xL/孔。
k、测定用酶标仪检测450nm的吸光值。
本发明的有益效果本发明建立了邻苯二甲酸二己酯的间接ELISA方法， 为邻苯二甲酸二己酯残留检测提供了一种快速高效的检测手段，由于采用的是 多克隆抗体，费用较低且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.1ng/mL，线性范围 为0-100ng/mL，半数抑制量(ICs。)为11.6ng/mL。免疫反应的高特异性和高亲和 性使ELISA具有极高的选择性和灵敏性，样本前处理过程简单。
图1邻苯二甲酸二己酯的标准抑制曲线。具体实施方案
以下通过实施例进一步说明本发明。
一、 仪器-
TGL - 40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂； KFLOW纯水机，凯佛隆公司； ZD-9556水平摇床，太仓科教器材厂；
Costar96孔8x12可拆酶标板，上海吉泰生物科技有限公司； MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司； 可调试移a支器，Thermo Labsystems公司；
涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂。
二、 试剂
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，康成生物工程公司； 四甲基联苯胺(TMB)，华美生物工程公司； 其他试剂均为分析纯试剂。
三、 步骤
1.免疫原和包被原的合成
合成免疫原(邻苯二甲酸二己酯半抗原与牛血清白蛋白BSA的偶联物)，包 被原(邻苯二甲酸二己酯半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物)用重氮化法偶联，具 体步骤如下
① 制备A液取0.023mmol半抗原于25mL烧杯中，加入2mL 二甲基甲 酰胺、0.2mL水和0.2mL的lmol/L盐酸，形成黄色溶液，冷却至0-5。C。然后 逐步滴加lmol/L亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝灰色停 止滴加，低温下搅拌lh，此液为A液。
② 制备B液称取150mg的牛血清蛋白(或102mg的卵清蛋白)溶于6mL 的pH9.0硼酸盐缓冲液，低温保存，此液为B液。
硼酸盐缓冲液0.2mol/L硼酸硼酸12.37g加水至1000mL; 0.05mol/L硼 砂硼砂19.07g加水至1000mL，将上述两溶液以体积比2:8的比例混合即为pH 9.0的硼酸盐缓冲液。
③ 在低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液，并用lmol/L的氢氧化钠溶 液调节pH,使pH保持在9， 4'C条件下，搅拌过夜，即得到人工抗原混合液。
④ 将人工抗原混合液移入透析袋中，用6X1L的去离子水透析4-6天。最 后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原邻苯二甲酸二己 酯-牛血清蛋白(或包被原邻苯二甲酸二己酯-卵清蛋白)。抗体效价测定步骤
1) 将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 pL/ L，于4 °C 冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200pLPBST溶液，摇床上振 荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。(以下洗涤 方法相同)。
2) 充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200)iL/孔，于37 。C温育箱 内温育2h后取出烘干待用。
3) 将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血 清，100pL/孔，37。C孵育lh后洗涤、拍干。
4) 每孔加入100pL， 1:4000稀释的标记的羊抗兔GAR-HRP， 37"C孵育lh 后洗涤、拍干。
5) 每孔加入100^L显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37。C反应 15min，取出后每孔加入100{iL终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值 A450。
抗体特异性测定步骤
a、 包被用设定浓度的包被原包被酶标板，100pL/孔，4t:过夜。
b、 洗涤用PBST洗涤酶标板三次，每次3min， 20(^17孔，甩干酶标板。
c、 封闭含0.1%明胶的碳酸盐缓冲液，20(^L/孔.37。C封闭2h。
d、 洗涤同b。
e、 竞争用PBST将邻苯二甲酸二己酯母液稀释成O.Ol， 0.1， 0.5， 1， 5， 10， 20 ng/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照，50pL/孔。然后每孔加入 50pL稀释4000倍的抗血清，于37。C温育lh。
f、 洗涤同b。
g、 加酶标二抗(羊抗兔GAR-HRP， 1:4000), 100fiL/ L 37 C反应lh。
h、 洗涤同b。
i、 显色加显色液100jiL/孔，显色15min。 j、终止加终止液100pL/孔。
k、测定用酶标仪检测450nm的吸光值。 试验结果如下
1、 标准曲线本实验所获得的抗体检测的线性范围是为0 100ng/mL。
2、 灵敏度灵敏度是所得90%最大吸光值所对应的标准品的浓度，即ICw 为0. lng/mL。
权利要求
1、一种邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法，其特征在于步骤如下(1)抗原的包被以邻苯二甲酸二己酯半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物作为包被抗原，以0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液将包被抗原以1∶5000～1∶8000进行稀释，作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液200μL/孔作为封闭液，封闭2h；(2)竞争反应每孔分别加入以标准品稀释液PBST稀释的0.01ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL系列浓度之一的邻苯二甲酸二己酯标准品或处理好的样品50μL到各自的酶标孔中，将免疫制备的邻苯二甲酸二己酯多克隆抗体以抗体稀释液含0.1％明胶、含0.05％吐温-20、pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲溶液PBST，按1∶6000～1∶9000比例稀释后，加入酶标板中，每孔加50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；(3)加酶标二抗以抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP以1∶3000～1∶5000进行稀释，每孔加100μL，37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；(4)显色每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；最后每孔加入终止液2M硫酸溶液100μL；用酶标仪450nm测吸光值A450，与所作标准曲线对比算出待测样品的邻苯二甲酸二己酯浓度。
2、 根据权利要求l所述的邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法，其特征 在于显色液配方A液0.933 g柠檬酸，3.68gNa2HPCVl2H20， 18 pL30%H2O2 用超纯水定容至100mL; B液60mg3,3:5,5^四甲基联苯胺溶于lOOmL乙二 醇中；使用前将A液与B液以5:1体积比混合。
3、 根据权利要求l所述的邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法，其特征 在于标准品稀释液PBST为含0.15mol/LNaCl、含0. 5%吐温-20的0.01mol/L、 pH7.4 PBST溶液。
全文摘要
一种邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法，属于免疫检测技术领域。本发明利用合成的邻苯二甲酸二己酯免疫原免疫得到多克隆抗体，以邻苯二甲酸二己酯为标准品，以邻苯二甲酸二己酯半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了邻苯二甲酸二己酯的间接竞争酶联免疫分析方法。本发明建立了邻苯二甲酸二己酯的间接竞争ELISA方法，为邻苯二甲酸二己酯的残留检测提供了一种快速高效的检测方法，由于采用的是多克隆抗体，费用较低且稳定性和重复性好。免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏度，灵敏度为0.1ng/mL，线性范围为0～100ng/mL。
文档编号G01N33/543GK101419232SQ20081019534
公开日2009年4月29日 申请日期2008年10月14日 优先权日2008年10月14日
发明者徐丽广, 李灼坤, 胥传来, 伟 马 申请人:江南大学