专利名称：一种cftr重组蛋白及其编码基因和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学和生物工程技术领域，尤其涉及ー种CFTR重组蛋白及其编码基因和用途。
背景技术：
囊性纤维化(cystic fibrosis, CF)是ー种主要影响呼吸道、消化道和生埴道的常染色体隐性遗传疾病，可导致呼吸道致慢性阻塞性肺疾患、由胰腺外分泌功能不全引起109^15%患儿胎粪性肠梗阻、累及汗腺出现多汗乃至休克，以及使大多数男性伴有先天性单/双侧输精管缺失的不育。1989年与CF疾病直接相关的基因被克隆(Riordan JR, et al.1dentification ofthe cystic fibrosis gene: cloning and characterization of compIementary DNA. Science, 245(4922) :1066-1073, 1989)，其编码的由1480个氨基酸残基组成的蛋白被命名为囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)或cAMP激活的氯离子通道。随后证明CFTR与人类生殖紧密联系的一个关键蛋白，在人类生殖健康方面具有重要意义。研究表明，CF相关疾病的发生是由于广泛分布于机体上皮组织的CFTR分子突变造成其功能改变所致，即突变改变了由CFTR促进水盐转运而控制上皮细胞分泌物的量和组成，进而严重影响跨上皮离子转运，引起或加重某些疾病(李红宇，蔡志伟，陈正豪，等.囊性纤维化跨膜转运调节体氯离子通道跨上皮离子转运的多功能引擎.ActaPhysiologica Sinica, 59:416-430，2007)。关于CFTR与生殖系统疾病特别是不孕不育的关系，就女性而言，CFTR被发现參与介导子宫内膜HC03-分泌和转运，这是精子获能的ー个重要条件。CFTR的缺失或突变影响了精子在女性生殖道内的获能，导致CF女性患者不孕。此外CFTR还与女性生殖疾病输卵管积水、沙眼衣原体感染和卵巢过度刺激综合症(OHSS)等病理过程相关。这些研究都表明，CFTR在女性生殖道液体环境的调节中起着重要的作用，并且与女性不孕也存在着明显的相关性。就男性而言，在CF伴男性不育患者中，约97 %为双侧输精管缺失(congenitalabsence of the vas deferens, CBAVD)导致的梗阻性无精症,提示CFTR或者CFTR介导的分泌异常在男性生殖道胚胎发育时期起着重要作用。为此，目前欧洲国家多建议应对因不孕就诊的男性要进行CFTR表达量和突变的研究。随着国内外对CFTR相关的研究日益深入，CFTR在男性或女性生殖生理过程中的作用将更加明晰，因而针对CFTR检测技术需求也日益扩大。目前CF疾病除了常用分析基因突变型与疾病关系的DNA扩增和測定汗液中氯/钠离子浓度技术检测外，也有測定CFTR表达量分析方法。但是，运用这些方法检测时操作复杂 ，费时费力，效率低下
发明内容
本发明提供了ー种CFTR重组蛋白，该CFTR重组蛋白具有多个抗原表位，可用于制备CFTR多克隆抗体。ー种CFTR重组蛋白，具有如SEQ No.1所示的氨基酸序列。所述CFTR重组蛋白中含有三种抗原性肽段，分别是来自CFTR蛋白的CFTR25_36(Pl)XFTR103-117 (P2)和 CFTR1387-1480 (P3)，这三种抗原性肽段能分别被 MM13_4、CF3 和 CFTR单抗识别。 优选地，所述CFTR重组蛋白中含两个首尾相连的CF3单抗识别肽段(P2A-P2B)，以使其分子达到一定的长度(理论分子量为15. 7kDa)，便于原核生物表达以及表达后对所述CFTR重组蛋白进行SDS-PAGE分析，省却小分子蛋白通常需与其他大分子蛋白载体偶联的费钱费时步骤；也能增强该重组蛋白的抗原性。同吋，为适合原核生物表达，本发明去掉了两段CF3单抗识别肽段中P2B肽段的N端的两个含强碱性R基团的氨基酸残基，使所述CFTR重组蛋白的理论等电点略偏酸性。综上所述，所述CFTR重组蛋白中，四个抗原性肽段的连接顺序为P1-P3-P2A-P2B。本发明还提供了一种编码所述CFTR重组蛋白的基因,其喊基序列如SEQ No. 2所
/Jn o本发明还提供了含有所述基因的重组载体或转化子。所述重组载体的原始载体为PSY621,所述转化子的受体细胞为原核细胞,优选为大肠杆菌。在本发明的ー个具体实施方式
中，所述大肠杆菌为BL21菌株。
本发明还提供了所述CFTR重组蛋白的制备方法，包括(I)人工合成所述基因；(2)在所述基因的两端引入限制性酶切位点；(3)通过所述限制性酶切位点将所述基因接入载体，获得重组载体；(4)将所述重组载体转化宿主细胞，构建重组工程菌，诱导培养后对获得的总蛋白进行分离纯化，获得所述CFTR重组蛋白。步骤(I)中，依据CFTR蛋白编码基因的公开信息(GenBank登录号NM_000492. 3)，按照所述CFTR重组蛋白中抗原性肽段的连接顺序，推測出相应的mRNA序列，然后根据碱基互补配对原则，推測出结构基因的核苷酸序列，并在其5’端添加一个起始密码子(ATG)，3’端添加一个终止密码子(TAA)，通过化学合成方法获得本发明所述基因。在步骤(2)引入限制性酶切位点之前，为提高目的蛋白表达率，可在所述基因的5’端引入前导序列，该前导序列表达的肽段应不具备免疫原性。步骤(3)中，利用所述基因两端的限制性酶切位点将该基因重组插入载体中，在一个具体实施例中，选用的载体为PSY621质粒，由此获得的重组载体可在大肠杆菌中以包涵体形式高表达CFTR重组蛋白，其约占细菌总蛋白20%左右的表达量，保证了可用简便经济的割胶回收方式对目标蛋白进行纯化。本发明还提供了ー种CFTR多克隆抗体。将所述CFTR重组蛋白接种动物，通过动物主动免疫，获得抗血清，进ー步获得所述CFTR多克隆抗体。本发明还提供了所述CFTR多克隆抗体在制备CFTR定量检测免疫试剂盒中的应用。与现有的单克隆抗体相比，所述CFTR多克隆抗体显著提高了靶分子的检测灵敏度。
与现有技术相比，本发明的有益效果为(I)本发明的CFTR重组蛋白具有多个抗原表位，利用该蛋白获得的CFTR多克隆抗体，显著提高了靶分子的检测灵敏度；(2)本发明采用原核生物表达所述CFTR重组蛋白，成本低，蛋白的表达量和纯度均较高。
图1为CFTR-3P表达和纯化的SDS-PAGE分析和免疫印迹鉴定结果图； 其中，IA为CFTR-3P的SDS-PAGE分析結果，箭头指示表达和纯化的CFTR-3P蛋白；IB和IC分别为使用单抗MM13-4和CF3的印迹反应结果；箭头指示免疫印迹阳性条带；其中，1:预染蛋白分子量标准；2 :未诱导工程菌总蛋白；3 :诱导的工程菌总蛋白；4 :纯化的CFTR-3P蛋白；图2为兔抗CFTR-3P血清抗体应答水平的ELISA分析结果图；图3为兔抗CFTR-3P血清中各嵌入表位肽抗体的蛋白印迹分析结果图；其中，3A为各表位肽融合蛋白的SDS-PAGE分析结果，箭头指示各表位肽融合蛋白表达条带；3B为使用兔抗CFTR-3P血清的印迹反应结果，箭头指示免疫印迹反应性条带；其中，1:预染蛋白分子量标准；2 GST188 蛋白；3 GST188-CFTR27-34 ；4 GST188-CFTR103-110 ；5 :GST188_CFTR1CI7_114 ；6 :GST188_CFTR1443—1457。
具体实施例方式
实施例1人CFTR-3P制备1CFTR-3P 分子设计作为制备抗体的免疫原，依据CFTR公开信息(GenBank登录号NM_000492. 3)以及參考相关单抗说明，所设计构建的CFTR-3P蛋白分别选用了以三种不同单抗(MM13-4、CF3和CFTR)识别肽段为根据的三个抗原性肽CFTR25_36 (PD、CFTR1Q3_117 (P2)和CFTR1387_148°(P3)。虽然有上述三种之外的其他CFTR单抗可识别CFTR1387_148°肽段内的21肽(CFTR1440 ^146°)，但为了使设计蛋白符合原核系统表达和表达后SDS-PAGE检测要求，同时也为了增强其免疫原性，仍然选用94肽作为ー个抗原性肽。另外，在所设计CFTR-3P蛋白中含2个P2肽(P2A和P2B)，也出于同样目的。这两个P2肽首尾相连，并依据PC基因软件分析结果去掉了 P2B肽N端最前面2个氨基酸残基(GR)，使整个设计分子等电点pi显示略偏酸性(pl=5. 91)。最終确定上述四个抗原性肽按照P1-P3-P2A-P2B的连接方式构成本发明的CFTR-3P分子，其氨基酸序列如SEQ No.1所示。2CFTR-3P 表达(I)基因合成I)依据CFTR蛋白公开信息，按照CFTR-3P分子中各肽段的连接方式，推测出相应的mRNA序列，然后根据碱基互补配对原则，推測出结构基因的核苷酸序列，并在其5’端添加一个起始密码子(ATG)；
2)在CFTR-3P编码基因的5’端引入可重组插入pSY621表达质粒的EcoR I限制性酶切位点，在其3’端引入连接有TAA终止密码子的Sal I限制性酶切位点；3)通过计算机软件分析确认该CFTR-3P编码基因序列内部无上述两个限制性酶切位点后合成靶基因。该基因的核苷酸序列如SEQ No. 2所示，其5’端和3’端分别具有起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)。 (2)获取工程菌利用EcoR I和Sal I限制性酶对靶基因进行酶切后，连入同样处理的pSY621质粒，16°C连接过夜，获得重组载体。CaCl2法制备感受态大肠杆菌BL21菌株。37°C培养过夜，将获得的重组载体转化大肠杆菌BL21菌株，获得工程菌(BL21/pSY621-ZPCP)。(3)诱导表达将BL21/pSY621-CFTR-3P工程菌接种至含有100 u g/mLAmp的3mLLB培养液中，于30°C振荡培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含IOOii g/mLAmp的LB培养液中，30°C振荡培养2 3h至菌体浓度达到OD值0. 6 0. 8后，调高温度至42°C热诱导4h，离心收集菌体，加上样裂解液煮沸5min备用。(4)分离纯化I)收集经热诱导表达的细胞沉淀物，以5mL/g湿菌体的比例加入细菌裂解液悬浮细胞后，超声破碎，于4°C离心收集菌体沉淀；2)在菌体沉淀中加入IOmL含0. 5%triton X-100的裂解液进行超声打匀，于4°C离心收集沉淀；3)加IOmLlM尿素对沉淀进行洗漆,离心，沉淀物加5mL8M尿素进行超声悬浮；4)用ddH20溶解沉淀物，然后走制备性SDS-PAGE，切割CFTR-3P表达带17kDa处凝胶放入含PBS的透析袋内，并用琼脂糖凝胶电泳装置进行电洗脱lh，收集透析袋内PBS，对水透析过夜后，冷冻干燥收集纯化的CFTR-3P蛋白，其氨基酸序列如SEQ No.1所示。(5)蛋白印迹法确认I)将诱导的细菌总蛋白样品进行15% SDS-PAGE分析，电泳后一块凝胶用考马斯亮蓝染色，分析靶CFTR-3P的特异表达，染色结果见图1A ；2) —块凝胶进行硝酸纤维素膜电转移2h，印迹膜用生理盐水(PBS，pH7. 2)缓冲液反复洗涤四次，用5%脱脂奶粉封闭过夜；PBS洗涤四次后，在ImL反应液中分别加入3 UL单抗丽13-4或单抗CF3，室温反应2h ;用PBS洗涤后加入I y L ニ抗羊抗兔IgG/HRP( 1:2000稀释)，室温反应Ih ;用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色，确认靶CFTR-3P的表达，显色结果如图1B和IC所不。由图1可见，CFTR-3P蛋白已成功表达，且从每升大肠杆菌培养液中可获得电泳条带均一性高于95%的IOmg CFTR-3P表达蛋白。 实施例2重组CFTR-3P蛋白的免疫接种及其免疫原性分析I用纯化CFTR-3P蛋白的主动免疫按常规方法免疫新西兰雄性白兔，第一次免疫用经弗氏佐剂乳化的Img CFTR-3P免疫原；ニ周后间隔ニ周用经不完全弗氏佐剂乳化的0. 5mgCFTR-3P免疫原加强免疫二次；一周后采集兔抗血清，备用。阴性对照兔仅注射弗氏佐剂。
2兔CFTR-3P抗血清滴度的ELISA分析(I)在96孔ELISA板上，加100 u L纯化的CFTR-3P蛋白(IOOng/每孔)，作为包埋抗原，于4°C放置过夜；(2)第二天用含0. 05%Tween-20的PBS (PBST)冲洗未结合的CFTR-3P蛋白，然后用封闭液(0.0IM PBS中含5%脱脂奶粉和0. 05%Tween-20)以1:4000稀释兔抗CFTR-3P抗血清，每孔加入100 u L逐一加倍稀释的抗血清，37°C放置2h ；(3)用PBST冲洗三次后加入IOOii L辣根过氧化酶标记的ニ抗羊抗兔IgG/HRP(1:2,000 稀释)，37°C放置 Ih ；(4)姆一孔加入 100 ii L 邻苯ニ胺(0. 4mg/mL)和 5 ii L H2O2 (0.03%)进行显色3(T60sec，最后用2M H2SO4-止反应，在酶标读数仪490nm波长处进行读数。阴性对照(NRS)包埋抗原为不相关重组蛋白，一抗反应使用对照兔血清。分析结果如图2所示。由图2可见，与阴性对照兔(NRS)血清相比，三个免疫兔抗血清在ELISA测定中都显示了 1:512,000的抗CFTR-3P抗体滴度，表明抗血清中，抗CFTR抗体的浓度较高。3兔CFTR-3P抗血清中3个单抗识别表位肽的抗体生成分析(I)构建检测抗原检测抗原分别选用Pl和P2各表位最小基序的一个反应性8肽(CFTR27-34 GYRQRLEL ;CFTR1CIト110 GRIIASYD ;CFTR1CI卜114 ASYDPDNK)以及 P3 中ー个单抗识别 15肽(CFTR1443_1457 PSDRVK LFPHRNSSK),并利用谷胱甘肽-S转移酶(GST)，分别构建GST188-CFTR27_34、GST188-CFTR1Q3_11c1、GST188-CFTR1ci7_114 和 GST188_CFTR1443_1457 融合蛋白。构建方法为I)合成两端具有BamH I和TAA-Sal I限制酶粘性末端(正链5’ -GATCCTAAG-3’ ；负链5’ -TCGACTTAG-3’ )的 8 肽或 15 肽的 DNA 正负链片段。各肽段对应的编码DNA片段(正链)分别如下Pl :5，-ggatacagacagcgcctggaattg-3，；P2-1 :5，-ggaagaatc atagcttcctatgac-3，；P2-2 :5， -gcttcctatgacccggataacaag-3，；P3 :5， -ccctccgacagggtgaagctctttccccaccggaactcaagcaag-3> ；2)将三个融合蛋白的DNA正负链片段分别两两配对退火后重组插入pXXGST_l质粒;3)连接液转化大肠杆菌BL21菌株、热诱导表达、收集细菌总蛋白；方法和条件与实施例1中2 (2)- (3)相同。(2)蛋白印迹分析I)将诱导表达的各自含 GST188-CFTR2 ト 34、GST188-CFTR1c|hic1、GST188-CFTR1c|h14 和GST188-CFTR1443_1457单表位肽融合蛋白的细菌总蛋白样品，分别同时走15% SDS-PAGE,结果如图3A所示；然后进行电转移印到硝酸纤维素膜上；2)印迹膜用PBS洗涤四次后用5%脱脂奶粉封闭过夜；3)用PBS充分洗涤后在8 IOmL反应液中加入30 y L —抗CFTR-3P抗血清，室温反应2h ；4)用PBS充分洗涤后加入5 ii L ニ抗羊抗兔IgG/HRP( 1:2000稀释)，室温反应Ih ；
5)用PBS洗涤后进行ECL化学发光显色，显色结果如图3B所示。由图3可见，兔CFTR-3P免疫血清中均可检测到抗P1、P2A、P2B和P3抗原性肽的抗体，表明运用CFTR-3P蛋白能够制备出灵敏性显著提高的多克隆抗体。提示兔CFTR-3P免疫血清经Protein A柱纯化后可用作CFTR定量检测方法的ー抗。本具体实施方式
中的pSY621质粒、pXXGST-1质粒、大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，均由上海市计划生育科学研究所保藏；MM13-4单抗和CF3单抗购自美国Abcam公司；氨卞青霉素(Amp)、限制性内切酶BamH1、EcoR1、Sal I和T4DNA连接酶购自日本 TaKaRa Biotechnology 公司；预染蛋白质低分子量标准、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠ニ抗和羊抗兔ニ抗(IgG/HRP)、邻苯ニ胺(OPD)和硝酸纤维素膜分别购自上海生エ或捷瑞生物工程技术服务有限公司；雄性新西兰白兔购自上海生旺实验动物养殖有限公司；弗氏完全和不完全佐剂购自美国Sigma公司；两端分别为EcoR I和Sal I粘性末端的CFTR-3P蛋白完整编码基因，以及用于验证兔抗CFTR-3P抗血清中各嵌入表位肽抗体 的表位短肽(CFTR27_34、CFTRlcl3_n°、CFTR1OT_114和CFTR1443_1457 )编码DNA正负链片段，均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
权利要求
1.一种CFTR重组蛋白，其特征在于，具有如SEQ No.l所示的氨基酸序列。
2.一种编码如权利要求1所述CFTR重组蛋白的基因，其特征在于，其碱基序列如SEQNo. 2所示。
3.一种含有如权利要求2所述基因的重组载体。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，原始载体为PSY621。
5.一种含有如权利要求2所述基因的转化子。
6.如权利要求5所述的转化子，其特征在于，受体细胞为大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的转化子，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21菌株。
8.如权利要求1所述CFTR重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括 (1)人工合成如权利要求2所述的基因； (2)在所述基因的两端引入酶切位点； (3)通过所述酶切位点将所述基因接入载体，获得重组载体； (4)将所述重组载体转化宿主细胞，构建重组工程菌，诱导培养后对获得的总蛋白进行分离纯化，获得所述CFTR重组蛋白。
9.一种CFTR多克隆抗体，其特征在于，利用如权利要求1所述的CFTR重组蛋白制成。
10.如权利要求8所述的CFTR多克隆抗体在制备CFTR定量检测免疫试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种CFTR重组蛋白，具有如SEQ No.1所示的氨基酸序列。本发明还公开了一种所述CFTR重组蛋白的制备方法、一种编码所述CFTR重组蛋白的基因以及含有所述基因的重组载体或转化子、一种利用所述CFTR重组蛋白制成的CFTR多克隆抗体以及所述CFTR多克隆抗体在制备CFTR定量检测免疫试剂盒中的应用。与现有技术相比，本发明的CFTR重组蛋白具有多个抗原表位，利用该蛋白获得的CFTR多克隆抗体，显著提高了靶分子的检测灵敏度；本发明采用原核生物表达所述CFTR重组蛋白，成本低，蛋白的表达量和纯度均较高。
文档编号G01N33/68GK103044537SQ20121053864
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者倪崖, 李坤, 徐万祥, 唐海平, 陈爱君, 石其贤, 孙志达 申请人:浙江省医学科学院