本发明主要涉及免疫学和医学领域。更具体地说，本发明涉及前列腺疾病的诊断以及在前列腺疾病的检测中可使用的生物样品中的生物标记物的鉴定。
背景技术：
：前列腺癌是最常被诊断的内脏癌，并且是男性中癌症死亡的第二个主要原因。根据国家癌症研究所的seer计划和疾病控制中心的国家卫生统计中心，2014年出现了233,000例前列腺癌(占所有新增癌症病例的14％)，死亡人数为29,480(占所有癌症死亡人数的5％)(参见，seer癌症统计资料页：前列腺癌，国家癌症研究所，贝塞斯达，md，http://seer.cancer.gov/statfacts/html/prost.html)。前列腺癌的常用筛查检查包括数字直肠检查(dre)和血液中前列腺特异性抗原(psa)的检测。dre是侵入性的和不精确的，并且psa检测结果的假阴性(即未检测到癌症)和假阳性(即不存在癌症的指征)的发生率是有据可查的。例如，以推荐的4.0ng/ml截留值进行的标准psa测试对癌症患者的敏感性为86％，但仅有33％特异性，在约67％的非癌症患者中产生假阳性(霍夫曼(hoffman)等人，bmcfampract.2002,3:19)。psa对前列腺癌的诊断价值也是有限的，因为它在良性和癌性状况之间缺乏特异性。在大部分良性前列腺增生(bph)和前列腺炎(25-86％)患者(gao等人，1997，prostate31：264-281)以及其他非恶性疾病中检测到psa水平升高，这明显限制了这种标记物的诊断特异性。例如，在bph中观察到血清psa在4ng/ml至10ng/ml之间的升高，并且甚至在前列腺炎，特别是急性前列腺炎中观察到更高的值。经dre或psa筛查阳性诊断后，确诊诊断检查包括经直肠超声、活检和经直肠磁共振成像(mri)活检。这些技术是侵入性的，并且导致该被检查受试者显著不适。通常需要用于诊断前列腺疾病的方便、可靠和准确的测试。优选地，这些测试可以具有辨别前列腺癌和非癌形式的前列腺疾病(例如，良性前列腺增生(bph))的能力。技术实现要素：本发明人已经鉴定了对检测前列腺疾病有效的生物标记物的组合。特别地，这些生物标记物组合可以能够辨别前列腺疾病的癌性和非癌性形式。因此，本发明涉及这些生物标记物组合和利用它们检测前列腺疾病的检查。因此，本发明至少涉及以下一系列的编号实施例，其中对实施例1的引用包括如下编号的实施例1a、1b和1c中的每一个：实施例1a:一种从前列腺癌(cap)中确定受试者是否患有良性前列腺增生(bph)的方法，包括：(a)通过以下方式产生用于辨别bph和前列腺癌的阈值：检测从具有bph的受试者群体和具有cap的受试者群体获得的一系列生物样品中的至少两种分析物，从而获得该系列的每个所述生物样品中的每个所述分析物的分析物水平；以允许辨别这些bph样品和cap样品的方式组合这些分析物水平；并且从组合的这些分析物水平中选择阈值并使用所述阈值作为辨别样品中的bph和cap的基础；和(b)检测来自受试者的生物样品中的所述至少两种分析物，从而获得该受试者的生物样品中每种所述分析物的分析物水平；和(c)对从该受试者的生物样品获得的单个或组合的分析物水平应用合适的算法和/或变换，从而生成用于与该阈值进行比较的患者分析物值；以及(d)通过比较该患者分析物值与该阈值来确定该受试者是否具有bph或cap，其中该至少两种分析物包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(gpc-1)并且选自以下分析物组合中的任一种：gpc-1和肝细胞生长因子(hgf)；gpc-1和表皮生长因子(egf)；gpc-1和纤溶酶原激活物抑制剂1(pai-1)；gpc-1和粒细胞集落刺激因子(g-csf)；gpc-1和人白细胞介素18(huil-18)；gpc-1和血小板衍生的生长因子ab.bb(pdgfab.bb)；gpc-1和血小板衍生的生长因子bb(pdgfbb)；gpc-1和可溶性cd40配体(scd40l)；gpc-1和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hugm-csf)；gpc-1和干扰素γ(ifnγ)；和gpc-1和卵泡抑素。实施例1b:一种确定受试者是否患有良性前列腺增生(bph)或前列腺癌(cap)的方法，包括：(a)通过以下方式产生用于辨别bph和前列腺癌的阈值：检测从具有bph的受试者群体和具有cap的受试者群体获得的一系列生物样品中的至少两种分析物，从而获得该系列的每个所述生物样品中的每个所述分析物的分析物水平；以允许辨别这些bph样品和cap样品的方式组合这些分析物水平；并且从组合的这些分析物水平中选择阈值并使用所述阈值作为辨别样品中的bph和cap的基础；和(b)检测来自受试者的生物样品中的所述至少两种分析物，从而获得该受试者的生物样品中每种所述分析物的分析物水平；和(c)对从该受试者的生物样品获得的单个或组合的分析物水平应用合适的算法和/或变换，从而生成用于与该阈值进行比较的患者分析物值；以及(d)通过比较该患者分析物值与该阈值来确定该受试者是否具有bph或cap，其中该至少两种分析物包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(gpc-1)并且选自以下分析物组合中的任一种：gpc-1和肝细胞生长因子(hgf)；gpc-1和表皮生长因子(egf)；gpc-1和纤溶酶原激活物抑制剂1(pai-1)；gpc-1和粒细胞集落刺激因子(g-csf)；gpc-1和人白细胞介素18(huil-18)；gpc-1和血小板衍生的生长因子ab.bb(pdgfab.bb)；gpc-1和血小板衍生的生长因子bb(pdgfbb)；gpc-1和可溶性cd40配体(scd40l)；gpc-1和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hugm-csf)；gpc-1和干扰素γ(ifnγ)；和gpc-1和卵泡抑素。实施例1c:一种产生用于辨别良性前列腺增生(bph)和前列腺癌(cap)的阈值的方法，包括：(a)检测从已知具有bph的受试者群体和已知具有cap的受试者群体获得的一系列生物样品中的至少两种分析物，从而获得该系列的每个所述生物样品中的每个所述分析物的分析物水平；(b)以允许辨别这些bph样品和cap样品的方式组合这些分析物水平；并且(c)从组合的这些分析物水平中选择阈值作为辨别bph和cap的基础；并且其中该至少两种分析物包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(gpc-1)并且选自以下分析物组合中的任一种：gpc-1和肝细胞生长因子(hgf)；gpc-1和表皮生长因子(egf)；gpc-1和纤溶酶原激活物抑制剂1(pai-1)；gpc-1和粒细胞集落刺激因子(g-csf)；gpc-1和人白细胞介素18(huil-18)；gpc-1和血小板衍生的生长因子ab.bb(pdgfab.bb)；gpc-1和血小板衍生的生长因子bb(pdgfbb)；gpc-1和可溶性cd40配体(scd40l)；gpc-1和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hugm-csf)；gpc-1和干扰素γ(ifnγ)；和gpc-1和卵泡抑素。实施例2：根据实施例1所述的方法，其中该至少两种分析物选自以下分析物组合中的任一种：gpc-1、hgf和pai-1；gpc-1、hgf和人成纤维细胞生长因子β(hufgfb)；gpc-1、hgf和egf；gpc-1、hgf和pdgfbb；gpc-1、hgf和卵泡抑素；gpc-1、hgf和g-csf；gpc-1、hgf和人白细胞介素8(huil-8)；gpc-1、hgf和可溶性cd40配体(scd40l)；gpc-1、hgf和人皮肤t细胞吸引细胞因子(ctack-也称为c-c基序配体27或ccl27)；gpc-1、hgf和pdgfab.bb；gpc-1、hgf和ifnγ；gpc-1、hgf和人单核细胞趋化和活化因子(humcp1/mcaf)；gpc-1、hgf和huil-18；gpc-1、hgf、hugm-csf；gpc-1、hgf和尿激酶纤溶酶原激活物(upa)；gpc-1、hgf和人黑素瘤生长刺激活性α(hugroa，也称为cxc基序配体1、cxcl1)；gpc-1、hgf和可溶性血管内皮生长因子受体(svegfr)；gpc-1、egf和卵泡抑素；gpc-1、egf和肿瘤坏死因子α(tnfα)；和gpc-1、g-csf和具有免疫球蛋白样和egf样结构域2(stie2)的可溶性酪氨酸激酶。实施例3：如实施例1或实施例2所述的方法，其中所述从该组合的分析物水平中选择阈值包括选择这些组合的分析物水平的子集。实施例4：根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中所述以允许辨别bph和cap样本的方式组合这些分析物水平包括按照以下公式以使bph和cap样品之间的辨别最大化的方式组合这些分析物水平的加权线性总和：s＝w1a1+w2a2…wnan其中s是加权和，w是最终的分析物权重，以及a是来自n个不同分析物的给定分析物的水平，或是在数值上或作为分析物值的比率给定的分析物的水平的变换。实施例5：如实施例4所述的方法，其中在数值上给定的分析物水平的所述变换包括使用指数函数、幂函数和/或根函数。实施例6：根据实施例4或实施例5所述的方法，其中获得最终分析物权重w包括生成被设置为1或者根据以下公式生成的初始分析物权重(w)：w＝max(m)/m，其中w＝{w1，...，wn}且m＝{中值(a1)，...中值(an)}；其中max(m)是获得的这些分析物水平的最大中值水平，并且m是包含针对每个所述分析物获得的中值分析物水平的矢量。实施例7：根据实施例6所述的方法，其中每个所述最终权重是使用用于在所述一系列生物样本中辨别bph和cap时进行优化的辨别函数来确定的。实施例8：根据实施例7所述的方法，其中所述辨别函数是以下中的任何一个或多个：(i)由roc分析产生的曲线下方的面积；(ii)真正正面率(tpr)和真正负面率(tnr)的组合；(iii)在限制的特异性范围内由roc分析产生的曲线下方的面积；(iv)在限制的敏感度范围内由roc分析产生的曲线下方的面积；实施例9：根据实施例7或实施例8所述的方法，其中，所述进行优化的辨别函数为nelder-mead(单纯形法)、随机法、梯度下降法、随机梯度下降法、遗传算法、粒子群法和/或强力法中的任意一种或多种。实施例10：根据实施例1至9中任一项所述的方法，其中应用于从受试者的生物样品获得的单个或组合的分析物水平的适合的算法和/或变换符合下式：s＝w1a1+w2a2…wnan其中s是加权和，w是最终的分析物权重，以及a是来自n个不同分析物的给定分析物的水平，或是在数值上或作为分析物值的比率给定分析物的水平的变换。实施例11：根据实施例1至10中任一项所述的方法，其中所述组合这些分析物水平使bph和cap样品之间的辨别最大化。实施例12：根据实施例1至11中任一项所述的方法，包括以下述方式从这些组合的分析物水平中选择该阈值：(i)降低bph和cap之间的错误分类率；和/或(ii)增加辨别bph与cap时的敏感度；和/或(iii)增加辨别bph和cap时的特异性。实施例13：如实施例12所述的方法，其中所述以降低bph和cap之间的错误分类率的方式从这些组合的分析物水平中选择该阈值包括选择合适的真阳性和/或真阴性率。实施例14：如实施例12或实施例13所述的方法，其中所述以降低bph和cap之间的错误分类率的方式从这些组合的分析物水平中选择该阈值使错误分类率最小化。实施例15：根据实施例12至14中任一项所述的方法，其中以降低bph与cap之间的错误分类率的方式从这些组合的分析物水平中选择该阈值包括通过识别真阳性率与真阴性率相交的点来最小化bph和cap之间的错误分类率。实施例16：根据实施例12所述的方法，其中以增加辨别bph和cap时的敏感度的方式从这些组合的分析物水平中选择该阈值包括使用加权求和nelder-mead优化程序来优化由roc分析产生的曲线下方的部分面积(pauc)，其中所述pauc表示在限制的(1-敏感度)范围内的roc下方的面积，该范围在值0和一个指定的值e(例如0.5)之间。实施例17：如实施例12或实施例16所述的方法，其中所述以增加辨别bph和cap时的敏感度的方式从这些组合的分析物水平中选择该阈值使所述敏感度最大化。实施例18：如实施例12或实施例16所述的方法，其中所述以增加辨别bph和cap时的特异性的方式从这些组合的分析物水平中选择该阈值使所述特异性最大化。实施例19：根据实施例12或实施例18所述的方法，其中以增加辨别bph和cap时的特异性的方式从这些组合的分析物水平中选择该阈值包括使用加权求和nelder-mead优化程序来优化由roc分析产生的曲线下方的部分面积(pauc)，其中所述pauc表示在限制的(1-特异性)范围内的roc下方的面积，该范围在值0和一个指定的值e(例如0.5)之间。实施例20：根据实施例12、16、17、18或19中任一项所述的方法，其中该至少两种分析物选自以下分析物组合中的任一种：gpc-1/egf/卵泡抑素；和gpc-1/egf/tnfα实施例21：根据实施例12、16、17、18或19中任一项所述的方法，其中该至少两种分析物选自以下分析物组合中的任一种：gpc-1/hgf；gpc-1/hgf/pai-1；gpc-1/hgf/hufgfb；gpc-1/hgf/egf；gpc-1/hgf/hupdfgbb；gpc-1/egf；gpc-1/pai-1；gpc-1/g-csf；和gpc-1/pdgfab.bb。实施例22：根据实施例1至19中任一项所述的方法，其中该至少两种分析物选自以下分析物组合中的任一种：gpc-1/hgf；gpc-1/pai-1；gpc-1/g-csf；gpc-1/egf；gpc-1/pdgfab.bb；gpc-1/hgf/fgfb；gpc-1/hgf/pai-1；gpc-1/hgf/egf；gpc-1/hgf/卵泡抑素；和gpc-1/hgf/g-csf。实施例23：根据实施例1至22中任一项所述的方法，其中该受试者先前已经接收到前列腺疾病的阳性指征。实施例24：根据实施例1至23中任一项的方法，其中所述受试者先前通过数字直肠检查(dre)和/或psa测试接收到前列腺疾病的阳性指征。实施例25：根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述检测受试者的生物样品中的至少两种分析物包括：(i)测量指示每个所述分析物水平的一个或多个荧光信号；(ii)获得样品中所述分析物的重量/体积的测量结果；(iii)测量指示每个所述分析物水平的吸光度信号；或(iv)使用选自下组的技术，该组由以下各项组成：质谱法、蛋白质阵列技术、高效液相色谱(hplc)、凝胶电泳、放射性标记及其任何组合。实施例26：根据实施例1至25中任一项所述的方法，其中所述获得该系列的生物样品和该受试者的生物样品中的分析物水平包括将每个所述样品与一抗和二抗群体接触，其中每个所述抗体群体对所述分析物中的一个具有结合特异性，并且所述一抗和二抗群体具有不同的结合特异性。实施例27：根据实施例26所述的方法，其中一抗和/或二抗群被标记。实施例28：根据实施例27所述的方法，其中所述标记选自下组，该组由以下各项组成：放射性标记、荧光标记、生物素-亲和素扩增系统、化学发光系统、微球体和胶体金。实施例29：根据实施例26至28中任一项所述的方法，其中通过选自下组的技术检测每个所述抗体群体与该分析物的结合，该组由以下各项组成：免疫荧光、放射性标记、免疫印迹、western印迹、酶联免疫吸附测定(elisa)、流式细胞术、免疫沉淀、免疫组织化学、生物膜测试、亲和环测试、抗体阵列光密度测试和化学发光。实施例30：根据实施例1至29中任一项所述的方法，其中该系列的生物样品和该受试者的生物样品各自是全血、血清、血浆、唾液、泪液、尿液或组织。实施例31：根据实施例1至30中任一项所述的方法，其中所述受试者、具有bph的所述受试者群体和具有cap的所述受试者群体是人类。实施例32：根据实施例1至31中任一项所述的方法，其中所述检测该系列的生物样品和/或该受试者的生物样品中的该至少两种分析物包括直接检测这些分析物。实施例33：根据实施例1至32中任一项所述的方法，其中所述检测该系列的生物样品和/或该受试者的生物样品中的该至少两种分析物包括检测编码这些分析物的核酸。实施例34：如实施例1至33中任一项所述的方法，其中所述检测来自该受试者的该生物样品中的所述至少两种分析物在体外或离体进行。定义如在本申请中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则未指定个数时以及“该”包括复数个。例如，短语“抗体”也包括多种抗体。如本文所使用的，术语“包含”是指“包括”。单词“包括”(例如“包含”和“包含”)的变化具有相应的变化的含义。因此，例如，一种生物标记物组合“包含”分析物a和分析物b可以仅由分析物a和分析物b组成，或者可以包括一种或多种另外的组分(例如，分析物c)。如本文所用，术语“前列腺疾病”是指该前列腺的疾病，包括但不限于：良性前列腺增生(bph)、前列腺上皮内瘤、前列腺炎、前列腺癌、前列腺腺癌、前列腺平滑肌肉瘤和前列腺横纹肌肉瘤。如本文所使用的，术语“生物样品”和“样品”涵盖从受试者获取的任何体液或组织，包括但不限于唾液样品、泪液样品、血液样品、血清样品、血浆样品、尿液样本或其子部分。如本文所用，术语“诊断”和“诊断”是指本领域普通技术人员可以估计并且甚至确定受试者是否患有给定的疾病或病症的方法。可以例如基于一个或多个诊断指标进行诊断，例如，如本文所述的生物标记物或生物标记物组合的检测，该检测水平指示疾病的存在、严重性或不存在。因此，术语“诊断”和“诊断”因此也包括鉴定发生前列腺癌的风险。如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用，除非另有说明，并且涵盖具有经济、社会或研究重要性的任何动物，包括牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类和啮齿动物物种。因此，“受试者”可以是哺乳动物，例如，人类或非人类哺乳动物。如本文所用，关于生物分子(例如，抗体)的术语“分离的”是不含天然存在的至少一些组分的生物分子。如本文所用，术语“抗体”和“抗体”包括igg(包括igg1、igg2、igg3和igg4)、iga(包括iga1和iga2)、igd、ige、igm和igy、完整的抗体，该完整的抗体包括单链完整抗体及其抗原结合片段。抗原结合抗体片段包括但不限于：fv、fab、fab'和f(ab')2、fd、单链fvs(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fvs(sdfv)和包含vl或vh结构域的片段。这些抗体可以来自任何动物来源或合适的生产宿主。包括单链抗体在内的抗原结合抗体片段可包含单独的一种或多种可变区或与下列的全部或部分组合的可变区：铰链区、ch1、ch2和ch3结构域。还包括一种或多种可变区与铰链区、ch1、ch2和ch3结构域的任何组合。抗体可以是与该生物分子特异性结合的单克隆的、多克隆的、嵌合的、多特异性的、人源化的或人单克隆的和多克隆的抗体。该抗体可以是双特异性抗体、单抗体、双抗体、三抗体、四抗体、纳米抗体、单结构域抗体、vhh结构域、人抗体、完全人源化抗体、部分人源化抗体、模拟抗体、非免疫球蛋白配体或亲和体。如本文所用，关于抗体、抗体变体、抗体衍生物、抗原结合片段等的术语“特异性结合”和“特异性结合”是指其优先于其他非靶分子结合给定靶分子的能力。例如，如果该抗体、抗体变体、抗体衍生物或抗原结合片段(“分子a”)能够“特异性结合”或“特异性结合”给定的靶分子(“分子b”)，则分子a具有辨别分子b和任何其他数量的潜在替代结合伴侣的能力。因此，当分子a暴露于多种不同的但同样可接近的分子作为潜在的结合配伴侣时，分子a将选择性地结合分子b，并且其他潜在的结合伴侣将基本上保持未被分子a结合。通常，分子a优先结合分子b的频率比其他潜在的结合伴侣频率高至少10倍，优选50倍、更优选100倍、最优选高于100倍。分子a能够以弱的但可检测的水平结合不是分子b的分子。这通常被称为背景结合，并且容易从分子b特异性结合中辨别，例如通过使用适当的对照。如本文所用，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。这样的递送系统包括允许反应试剂(例如在适当的容器中的标签、参考样品、支持材料等)和/或支持材料(例如，缓冲液、用于执行测定的书面说明等)从一个位置到另一个位置的储存、运输或递送的系统。例如，试剂盒可以包括一个或多个包含相关反应试剂和/或支持材料的外壳，例如盒子。应该理解的是，当涉及数值范围时，本文使用的术语“在...之间”涵盖该范围的每个端点处的数值。例如，长度在10个残基和20个残基之间的多肽包括长度为10个残基的多肽和长度为20个残基的多肽。本文对现有技术文件的任何描述或者本文来源于或基于那些文件的陈述不是承认这些文件或衍生的陈述是相关领域的公知常识的一部分。出于描述的目的，除非另有说明，否则本文提到的所有文献都通过引用整体并入本文。具体实施方式开发用于前列腺疾病诊断的可靠的、方便且准确的检查仍然是一个重要目标，特别是在治疗干预成功率最高的早期阶段。然而，最初的筛查程序(例如dre和psa检测)常常提供不确定/不确定的诊断结果，并且不能有效辨别癌性和非癌性前列腺疾病。本发明提供指示前列腺疾病的生物标记物组合。特别地，这些生物标记物组合可以能够辨别给定受试者中的非癌症前列腺疾病(例如bph)和前列腺癌。基于一个或多个诊断测试(例如dre、psa测试)，该受试者可能先前已被确定为具有一种形式的前列腺疾病，或怀疑患有一种形式的前列腺疾病。因此，这些生物标记物组合可以在各种方法和测定方式中使用为诊断受试者中前列腺癌或bph的存在或不存在和/或为辨别bph患者与前列腺癌患者。前列腺疾病本发明提供指示前列腺疾病的生物标记物组合。这些方法涉及如本文所述的一种或多种生物标记物组合的检测。根据这些方法诊断的前列腺疾病可以包括但不限于：良性前列腺增生(bph)、前列腺上皮内瘤、前列腺炎、前列腺癌、前列腺腺癌、前列腺平滑肌肉瘤和前列腺横纹肌肉瘤。在某些实施例中，这些方法提供辨别完全或显著不含癌性前列腺疾病的“正常”患者和患有前列腺癌的受试者的能力。这些正常患者可能患有非癌性前列腺疾病，例如bph、前列腺上皮内瘤变(pin)或前列腺炎。本领域普通技术人员非常清楚用于分类不同前列腺疾病的标准临床测试和参数(参见，例如，“《2015年度前列腺疾病报告》(2015annualreportonprostatediseases)”,哈佛健康出版社(哈佛医学院)，2015；其全部内容通过交叉引用并入本文)。本披露中考虑的各种前列腺疾病具有与本领域普遍接受的特征和分类标准一致的特征和分类标准。例如，如本文所考虑的良性前列腺增生(bph)可以被理解为是指该前列腺的临床扩大，在一些情况下，该前列腺的临床扩大导致下尿路症状，该下尿路症状包括但不限于：具有增加的残留尿量的尿频、尿潴留和刺激性或阻塞的尿排泄模式。前列腺炎可以被理解为是指与前列腺炎症有关的病症，包括慢性非细菌性前列腺炎和急性或慢性细菌性前列腺炎，并且通常与尿急和/或尿频的症状有关。前列腺上皮内瘤变(pin)可以被理解为涵盖pin的各种形式和/或程度，该pin包括但不限于：高级别前列腺上皮内瘤和低级别前列腺上皮内瘤。pin可以被认为是癌前状态，在该癌前状态中一些前列腺细胞已经开始看起来和/或行为异常。这些异常细胞可以定位在，例如，排列在腺泡和导管上的上皮细胞中，而排列本身可以保持完整。在患有前列腺癌的受试者中，该前列腺细胞无限期地分裂引起异常生长(例如肿瘤)。这些异常生长可能是无痛和无症状的。可替代地，这些异常生长可能导致身体不适和/或其他局部症状，包括流体阻塞或出血。另外地或可替代地，这些异常生长可能导致全身症状，该全身症状包括由正常身体功能破坏引起的全身症状。在一些实施例中，前列腺癌的这些症状可以包括排便习惯或膀胱功能的改变。这些前列腺癌细胞可能是良性的或转移性的。如本领域普通技术人员已知的，根据该疾病的进展，可以将前列腺癌分为几个阶段。作为非限制性实例，可以使用ajcctnm分阶段系统、whitmore-jewett系统和/或d'amico风险分类将前列腺癌进展分成阶段。本领域普通技术人员熟悉这样的分类系统及其特征和用途。一种本领域的普通技术人员已知的也称为“格里森分级系统”的适合的前列腺癌分级系统。这个系统为组织样品中的癌症的两个最大区域中的每一个区域分配等级，该组织样品从患有前列腺癌的受试者获得。这些等级从1到5,1是低度恶性，5是高度恶性。转移常见于4级或5级，但很少发生于，例如，3级肿瘤。然后将这两个等级相加以产生格里森评分。2-4分被认为是低级别；5-7分被认为是中级别；以及8-10分被认为是高级别。低格里森评分的肿瘤通常可以以足够慢的速度生长以在患者的一生中不对患者构成重大威胁。如本领域技术人员所知，前列腺癌可具有不同等级的区域，在这种情况下，可以将单个等级分配给构成大部分前列腺癌的两个区域。这两个等级被添加以产生格里森得分/总和，并且通常第一个分配的数字是在该肿瘤中最常见的等级。例如，如果格里森得分/总和写成“3+4”，则意味着大部分肿瘤是3级，而更少是4级，格里森得分/总和为7。作为非限制性实例，根据本发明的这些方法，3+4以上的格里森评分/总和可以指示前列腺癌。用于前列腺疾病的生物标记物根据本发明的这些方法，可以通过检测本文鉴定的一种或多种生物标记物来诊断前列腺疾病。如本文所设想的生物标记物可以是分析物。如本文所考虑的分析物将被赋予给本领域普通技术人员普通和常规的含义，并且不限于可被检测和定量的生物样品(例如，血液、脑脊髓液、尿液、泪液、淋巴液、唾液、组织液、汗液等)中的物质或化学成分。非限制性实例包括细胞因子和趋化因子，以及细胞表面受体和其可溶形式。根据本发明检测的生物标记物的组合可以包含2、3、4、5或多于5个单独的生物标记物或由2、3、4、5或多于5个单独的生物标记物组成。因此，根据本发明的生物标记物的组合可以包含gpc-1和至少一种另外的生物标记物、gpc-1和至少两种另外的生物标记物，或者gpc-1和至少三种另外的生物标记物。一种或多种另外的生物标记物可以是分析物。在一些实施例中，可以测量受试者的生物样品中的至少两种生物标记物的组合，并将该生物标记物的组合用作推导前列腺疾病阳性或阴性诊断的基础。至少两种生物标记物的组合可以包含gpc-1。该前列腺疾病可能是前列腺癌或bph。作为非限制性实例，至少两种生物标记物的组合可以选自下表1中列出的那些。表1：两种生物标记物的组合生物标记物#1生物标记物#2gpc-1hgfgpc-1egfgpc-1pai-1gpc-1g-csfgpc-1huil-18gpc-1pdgfab.bbgpc-1pdgfbbgpc-1scd40lgpc-1hugm-csfgpc-1ifnγgpc-1卵泡抑素在一些实施例中，可以测量受试者的生物样品中的至少三种生物标记物的组合，并将该生物标记物的组合用作推导前列腺疾病阳性或阴性诊断的基础。至少三种生物标记物的组合可以包含gpc-1。该前列腺疾病可能是前列腺癌或bph。作为非限制性实例，至少三种生物标志物的组合可以选自下表2中列出的那些。表2：三种生物标记物的组合生物标记物的检测和定量可以使用本领域普通技术人员已知的任何合适的方法在生物样品中检测根据本发明的生物标记物或生物标记物的组合。在一些实施例中，定量生物标记物或这些生物标记物的组合以推导出样品中生物标记物或生物标记物的组合的特定水平。一种或多种生物标记物的水平可以根据本文提供的方法进行分析以提供诊断。检测给定生物样品中的一种或多种生物标记物可以提供能够测量的输出，从而提供对存在的一种或多种生物标记物的水平进行定量的方法。可以使用输出信号的测量来生成指示每体积的生物样品的生物标记物的净重量(例如，pg/ml；μg/ml；ng/ml等)的数字。仅作为非限制性实例，该一种或多种生物标记物的检测可最终导致指示样品中一种或多种生物标记物水平的一个或多个荧光信号。根据本发明的方法，这些荧光信号可以直接用于进行诊断确定，或者为了相同的目的可替代地被转换成不同的输出(例如，如上面段落中所述的每个体积的重量)。可以使用本领域已知的合适方法检测和定量根据本发明的生物标记物，该方法包括，例如，蛋白质组学技术和利用编码这些生物标记物的核酸的技术。合适的蛋白质组学技术的非限制性实例包括质谱法、蛋白质阵列技术(例如，蛋白质芯片)、凝胶电泳和依赖于对一种或多种生物标记物具有特异性的抗体的其他方法，该其他方法包括免疫荧光、放射性标记、免疫组织化学、免疫沉淀、蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定(elisa)、荧光细胞分选(facs)、免疫印迹、化学发光和/或用于用抗体检测蛋白质的其他已知技术。依赖于核酸检测的合适技术的非限制性实例包括检测dna、rna(例如mrna)、cdna等的那些，例如基于pcr的技术(例如定量实时pcr；sybr-绿染料染色)、uv光谱测定、杂交测定(例如狭缝印迹杂交)和微阵列。对根据本发明的生物标记物具有结合特异性的抗体(包括单克隆抗体和多克隆抗体)容易获得并且可以从各种商业来源(例如，西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)、圣克鲁斯生物技术(santacruzbiotechnology)、艾碧康(abcam)、亚诺法(abnova)等)购买。另外地或可替代地，可以使用本领域的标准方法来生产对根据本发明的生物标记物具有结合特异性的抗体。生产能够产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的技术在本领域是公知的。非限制性实例包括杂交瘤方法(参见，科勒(kohler)和米尔斯坦(milstein)，(1975)《自然》(nature)，256：495-497；科林根(coligan)等人，《分子生物学方法》(methodsinmolecularbiology)(胡马纳出版社1992)中的2.5.1-2.6.7节；以及哈洛(harlow)和莱恩(lane)抗体：《实验室手册》(alaboratorymanual),726页(冷泉港出版1988(coldspringharborpub.1988)),用于生产人单克隆抗体的ebv-杂交瘤方法(参见，科尔(cole),等人1985,在单克隆抗体和癌症治疗中,alanr.liss,inc.,第77-96页),人类b细胞杂交瘤技术(参见，kozbor等人1983,《今日免疫学》(immunologytoday)4:72),和三源杂交瘤技术。在一些实施例中，使用酶联免疫吸附测定(elisa)实现生物样品(例如，体液或组织样品)中生物标记物的检测/定量。例如，elisa可以基于色度测定、化学发光和/或荧光测定。在本发明方法中适用的elisa可以使用任何合适的捕获试剂和可检测试剂，该捕获试剂和可检测试剂包括抗体及其衍生物、蛋白质配体等。作为非限制性实例，在直接elisa中，感兴趣的生物标记物可以通过直接吸附到测定板上或通过使用附着于板表面的捕获抗体来固定化。然后可以使用结合酶的一抗(直接检测)或一组匹配的未标记的一抗和结合的二抗(间接检测)进行抗原的检测。间接检测方法可以使用具有对一抗具有结合特异性的检测的标记的二抗。捕获抗体(如果使用的话)和/或一抗可以来源于不同的宿主物种。在一些实施例中，elisa是竞争性elisa、夹心elisa、细胞内elisa或elispot(酶联免疫斑点测定)。制备和实施elisa的方法是本领域普通技术人员所熟知的。程序性的提示例如elisa板的选择和包被、使用合适的抗体或探针、使用封闭缓冲液和洗涤缓冲液、检测步骤的细节(例如放射性或荧光标签、酶底物等)在该领域是完善的和常规的(例如，参见“《免疫测定手册》(theimmunoassayhandbook).配体结合的理论和应用，elisa和相关技术”，怀尔德(wild)，d.(ed)，第4版，2013，爱思维尔(elsevier))。在其他实施例中，使用蛋白质印迹法实现生物样品(例如，体液或组织样品)中生物标记物的检测/定量。蛋白质印迹法是本领域普通技术人员所熟知的(参见例如哈洛(harlow)和莱恩(lane).活化.《实验手册》(alaboratorymanual).冷泉港(coldspringharbor)，纽约：冷泉港实验室出版社，1999；博尔德(bold)和马奥尼(mahoney)，《分析生物化学》(analyticalbiochemistry)257，185-192，1997)。简言之，可以使用对给定生物标记物具有结合亲和力的抗体通过凝胶电泳来定量基于大小分离的蛋白质混合物中的生物标记物。由，例如，硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(pvdf)制成的膜可以放置在包含来自生物样品的蛋白质混合物的凝胶的旁边，并施加电流以诱导蛋白质从凝胶迁移至膜。然后可以使该膜与对感兴趣生物标记物具有特异性的抗体接触，并使用二抗和/或检测试剂显现。在其他实施例中，使用多重蛋白质测定法(例如，平面测定法或基于微珠的测定法)来实现生物样品(例如，体液或组织样品)中的多种生物标记物的检测/量化。在本说明书的实例部分中描述了许多商购可得的多重蛋白质测定方式(例如bio-rad、luminex、emdmillipore)，以及合适的多重蛋白质测定法的非限制性实例。在其他实施例中，通过流式细胞术实现生物样品(例如，体液或组织样品)中一种或多种生物标记物的检测/量化，该流式细胞术是用于对悬浮在流体流中的目标实体(例如，细胞和蛋白质)进行计数、检查和分类的技术。它允许流经光学/电子检测装置的实体的物理和/或化学特征(例如，一种或多种靶生物标记物定量)的同时多参数分析。在其他实施例中，生物样品(例如体液或组织样品)中的一种或多种生物标记物的检测/定量通过免疫组织化学或免疫细胞化学实现，该免疫组织化学或免疫细胞化学是通过使用对组织或细胞中的抗原具有结合特异性的抗体或蛋白质结合剂将组织或细胞中的蛋白质定位的过程。可以通过用产生颜色(例如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)或荧光(例如异硫氰酸荧光素(fitc)或藻红蛋白(pe))的标签来标记抗体/试剂以实现可视化。本领域普通技术人员将认识到，用于检测根据本发明的一种或多种生物标记物或编码它们的核酸的特定方法是不需要创造性投入的常规选择的问题。生物标记物的分析与诊断根据本发明的方法，给定生物标记物或给定生物标记物的组合的检测和定量可用于诊断前列腺疾病。通常，这些方法涉及分析给定生物样品或一系列生物样品中的该靶向生物标记物以得到样品中一种或多种生物标记物的定量测量。合适的一种或多种生物标记物包括但不限于表1和表2中提及的那些生物标记物和生物标记物组合。仅作为非限制性实例，该定量测量可以是由设计用于检测和定量该一种或多种生物标记物的测定法产生的荧光信号或吸光度信号的形式。另外地或可替代地，该定量测量可以以该一种或多种样品中的该一种或多种生物标记物的重量/体积测量值的形式提供。在一些实施例中，本发明的这些方法可以包括与已知患有本文所述的前列腺疾病的患者群体中的生物标记物水平的比较。例如，一种或多种生物标记物的水平可以从获自具有第一前列腺疾病的患者的一系列生物样品和来自具有第二前列腺疾病的患者的一系列生物样品中确定。第一种前列腺疾病可以是非癌性前列腺疾病，例如，bph、pin或前列腺炎。第二种前列腺疾病可以是包括其形式的前列腺癌，例如前列腺癌、前列腺平滑肌肉瘤和前列腺横纹肌肉瘤中的任何一种或多种。该前列腺癌的特征在于最低格里森级别或得分/总和(例如至少6(例如3+3、4+2或2+4)；至少7(例如3+4或4+3、5+2)或至少8(例如4+4、5+3；或3+5)。在每个单个群体的样品中观察到的一种或多种生物标记物的水平可以被集体分析以确定阈值，该阈值可以被用作提供癌症或非癌症前列腺疾病的诊断的基础。例如，确认或怀疑患有前列腺疾病的患者的生物样品可以被分析，并确定根据本发明的一种或多种靶生物标记物的水平。患者样本中的一种或多种生物标记物的水平与从患者群体产生的一个或多个阈值的比较可以用作诊断癌性或非癌性前列腺疾病的基础。因此，在一些实施例中，本发明的这些方法包括诊断给定患者是否患有非癌性前列腺疾病或癌性前列腺疾病。例如，由dre和/或psa测试的结果，患者可能先前已被证实患有或可能怀疑患有前列腺疾病。在这种情况下，对患者确定前列腺疾病是否癌变是有利的，因为根据本文所述的这些方法，非癌性前列腺疾病的诊断避免了对前列腺活检的需要。没有任何特别的限制，根据本发明的诊断方法可以包括辨别受试者是否具有特定形式的前列腺疾病。该方法可以包括从预先确定患有前列腺疾病a的第一组患者获得第一系列生物样本，并且从预先确定不患有前列腺疾病a的第二组患者获得第二系列生物样本。第二组患者可能患有不同的前列腺疾病(例如前列腺疾病b)，或者不患任何前列腺疾病(前列腺疾病-)。可以通过检测第一和第二系列生物样品中的一个、两个、三个、四个、五个或多于五个生物标记物来产生用于辨别第一和第二患者组的阈值，从而获得每个系列的每个生物样品中的每个生物标记物的生物标记物水平。这些分析物水平可以以允许辨别来自第一和第二组患者的样品的方式组合。可以以合适的方式从组合的分析物水平中选择阈值，例如以下方法中的任何一种或多种：降低第一和第二组患者之间的错误分类率；增加或最大化辨别第一组和第二组患者的敏感性；和/或增加或最大化辨别第一组和第二组患者的特异性。该阈值可以用作辨别给定候选样品中存在和不存在前列腺疾病a的基础。因此，可以获得来自与前列腺疾病a有关的状态是未确定的受试者的生物样品以及用作产生以与第一和第二患者组相同的方式测量的阈值的基础的相同的一种或多种生物标记物，以获得患者生物标记物值。然后可将源自定量生物标记物水平的该患者生物标记物值与用于确定前列腺疾病a的阈值比较。从该受试者的生物样品获得的单个或组合生物标记物水平的合适的算法和/或变换可以用于生成该患者生物标记物值以与该阈值进行比较。在一些实施例中，用于推导该阈值和/或该患者生物标记物值的一个或多个参数被加权。在一些实施例中，如果该患者生物标记物值小于该阈值，则该患者接收到前列腺疾病a的阴性诊断。在一些实施例中，如果该患者生物标记物值大于该阈值，则该患者接收到前列腺疾病a的阴性诊断。在一些实施例中，如果该患者生物标记物值小于该阈值，则该患者接收到前列腺疾病a的阳性诊断。在一些实施例中，如果该患者生物标记物值大于该阈值，则该患者接收到前列腺疾病a的阳性诊断。在一些实施例中，前列腺疾病a是非癌性前列腺疾病(例如bph、pin或前列腺炎)。在一些实施例中，前列腺疾病a是前列腺癌、前列腺腺癌、前列腺平滑肌肉瘤和/或前列腺横纹肌肉瘤。在本申请的这些实例中描述了进行这些分析的合适的和非限制性的方法。这种方法的一个非限制性实例是受试者工作特征(roc)曲线分析。通常，该roc分析可能涉及将每个测试患者的分类与基于适当参考标准的“真实”分类进行比较。以这种方式对多个患者进行分类可以允许推导出敏感性和特异性的量度。敏感性通常是所有真正阳性患者中正确诊断患者的比例，特异性是所有真正阴性患者中正确诊断病例的比例。通常，依据为确定阳性诊断而选择的该阈值、敏感性和特异性之间可能存在权衡低阈值一般可以具有高敏感度但相对低的特异性。相反，高阈值一般可以具有低敏感度但相对高的特异性。roc曲线可以通过水平地颠倒敏感度对特异性的图来产生。得到的颠倒水平轴是该假阳性部分，其等于从1减去的特异性。该roc曲线下方的面积(auc)可以解释为整个可能的特异性范围内的平均敏感度，或者在整个可能的敏感度范围内的平均特异性。该auc代表整体准确度量度，也代表覆盖所有可能解释临界值的准确度量度。尽管涵盖了对该整个roc曲线进行分析的方法，但也可以将这些方法扩展到对部分区域的统计分析(部分auc分析)。在部分auc分析中沿该水平轴或垂直轴选择合适范围可能至少部分取决于临床目的。在高精度地检测给定的前列腺疾病的存在是重要的临床环境中，可以使用对应于高敏感度的相对较高的假阳性部分的范围。可替代地，在排除给定前列腺疾病很重要的临床环境中，可以使用等同于高特异性的相对较低的假阳性部分的范围。受试者、样品和对照根据本发明的这些方法分析的样品来源于一个或一系列的受试者。本文提及的受试者或患者涵盖具有经济、社会或研究重要性的任何动物，包括牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类和啮齿动物物种。受试者或患者可以是哺乳动物，例如，人类或非人类哺乳动物。如本文所述的受试者和患者可能患有前列腺疾病，也可能不患前列腺疾病，可能患有或可能不患有癌性前列腺疾病，或可能患有或不患有非癌性前列腺疾病。根据本发明的方法使用的样品可以是适合于本领域技术人员进行分析的形式。合适的样品包括各种体液例如血液、血浆、血清、精液、尿液、泪液、脑脊髓液、淋巴液、唾液、组织液、汗液等。该尿液可以在按摩前列腺后获得。该样品可以是组织样品，例如该组织的活组织检查，或从该组织中刮取的表面样本。该组织可能来自前列腺。在另一个实施例中，该样品可以通过形成由组织制成的细胞悬液来制备。在一些实施例中，本发明的这些方法可以涉及使用对照样品。对照样品是取自没有前列腺疾病的个体的任何相应样品(组织样品、血液、血浆、血清、精液、泪液或尿液)。在某些实施例中，该对照样品可以包含编码根据本发明的生物标记物的核酸材料或由该核酸材料组成。在一些实施例中，该对照样品可以包括标准样品。该标准样品可以在被认为是对照水平的水平下提供生物标记物的参考量。例如，可以制备标准样品以模拟来自一个或多个受试者的一个或多个样品中的本文所述的生物标记物的量或水平(例如，来自多个样品的量或水平的平均值)，该受试者可能具有或可能不具有前列腺疾病。在一些实施例中，可以使用对照数据。当用作参考时，对照数据可以包括数据的汇编，例如可以包含在提供被认为是对照水平的生物标记物的量或水平的表格、图表，图表(例如，数据库或标准曲线)中。这样的数据可以编辑，例如，通过获得来自一个或多个可能具有或可能不具有前列腺疾病的受试者的一个或多个样品中的生物标记物的量或水平(例如来自多个样品的量或水平的平均值)。试剂盒本文还设想了用于执行本发明的方法的试剂盒。这些试剂盒可以包含适合于检测本文所述的一种或多种生物标记物的试剂，包括但不限于表1和表2中提及的那些生物标记物和生物标记物组合。作为非限制性实例，这些试剂盒可包含能够特异性结合本文所述的一种或一系列生物标记物的一种或一系列抗体。另外地或可替代地，这些试剂盒可以包含用于制备和/或进行能够对本文所述的一种或多种生物标记物定量的试验的试剂和/或组分(例如，用于进行elisa、流式细胞术、蛋白质印迹法、免疫组织化学、凝胶电泳(适用于蛋白质和/或核酸分离)和/或定量pcr的试剂)。另外地或可替代地，这些试剂盒可以包括用于从患者获得和/或处理如本文所述的生物样品的设备。本领域的普通技术人员可以理解的是，在不背离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施例中公开的本发明进行许多变化和/或修改。因此，本实施例在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。实例现在将参考具体实例来描述本发明，其不应被解释为以任何方式进行限制。实例1：在良性前列腺增生(bph)和前列腺癌(cap)患者中分析物的表达。使用bioradbioplex多分析物阵列系统在来自正常患者(第一组)，患有良性前列腺增生的患者(bph，第二组)和患有前列腺癌的患者(cap，第三组)的血浆样品中研究了82种分析物的表达。使用由山羊多克隆抗gpc-1捕获抗体和mil-38抗gpc-1单克隆检测抗体组成的夹心elisa来测定可溶性gpc-1的水平。1.材料和方法1.1患者收集298名患者的血浆样品用于多分析物分析。分析来自三组中的每一组的样品：正常(98名患者)、良性前列腺增生[bph，100名患者]和前列腺癌[cap，100名患者]患者类别定义如下：第一组-正常-包括男性50岁及以上，包括那些接受α-受体阻滞剂治疗、患有在至少1周和至多1年诊断的正常dre和正常psa、在前3个月内除dre以外无任何下尿路(如内窥镜检查)的操作以及患有如下定义的psa的患者：-年龄在50至60岁之间，psa<2ng/ml-高于60岁，psa<3ng/ml，通常这样的患者将会咨询输精管切除术、支架或结石手术或勃起功能障碍。-排除任何在前3个月内经历了除dre以外的下尿路操作的第1组患者被排除。任何没有dre结果的第1组或不在认可的时间范围内的dre患者被排除。任何没有psa结果或psa未在认可的时间范围内的第1组患者被排除。任何无bph症状的第一组患者从第1组排除，但可以考虑纳入第2组(bph)。第2组-良性前列腺增生(bph)-包括男性50岁及以上，包括那些接受α-受体阻滞剂治疗、患有至少4周至多1年病理证实良性前列腺增生的患者。另外，如果psa是在年龄校正的正常范围内且该psa测试至少在1周至最多12个月内进行，则包括具有临床bph(包括下尿路症状(luts))的50岁以上的男性。正常psa被定义为年龄在50和60之间psa<2ng/ml和在60岁以上psa<3ng/ml。-排除第2组中任何患有pin或非典型性的患者都被排除。第3组-前列腺癌(cap)-包括男性50岁及以上，包括那些接受α-受体阻滞剂治疗，至少1周活检后证实的前列腺癌患者和格里森得分至少7(如格里森3+4或格里森4+3)的患者。-排除经过部分或根治性前列腺切除术或其他治疗手段(如hifu或近距离放射治疗)的第3组(前列腺癌或cap)中的任何患者被排除。任何接受5α-还原酶抑制剂(5ari)治疗的第3组患者被排除，除非从最后一剂非那甾胺起至少有2天的清除，以及从最后一剂度他雄胺起至少30周的清除。除非在最后一次给药后1个月内有最低限度的清除，否则接受锯棕榈治疗的第3组中的任何患者都被排除。任何接受雄激素阻断治疗(adt)或任何实验试剂治疗的第3组中的患者被排除。所有组的排除标准如下：-任何不符合纳入标准的患者都被排除。-任何除了基底或鳞状皮肤癌以外的具有除了前列腺癌病史的患者被排除。1.2样品采集取自患者的全血样品进行离心以分离在-20℃储存的血浆组分。样品从收集站运出，然后解冻，分装并储存在-80℃。1.3多分析物阵列将患者血浆样品在冰上解冻，然后转移到1.5ml离心管中。这些样品20000g在4℃下离心10分钟。将中间部分转移(避开任何沉淀或脂质层)到0.22μm离心过滤装置上，并且11,000g在4℃下离心直到完成。然后将这些样品等分到微量滴定板上，以便它们可以被处理用于bio-plex读数。将这些平板保存在-80℃下，直到按照bio-plex试剂盒说明,他们可以在澳大利亚蛋白质组分析设施上进行处理和运行。使用bioplex200分析仪根据制造商的说明和如布林(breen)等人(参见布林(breen)等人，2015《细胞活素》(cytokine)71,188-198)所述分析样品。该bio-plex200系统(bio-rad)是基于流式细胞仪原理的适用性分析仪。该系统能够在一个微孔板上使用小样品量复用(同时测量)多达100个分析物。bio-plex检测使用微珠设计，每个微珠都有不同的颜色代码(光谱地址)，以允许辨别各个分析。珠粒用不同比例的两种荧光染料染色，因此被分为100个独特的珠粒区域(xmap技术)。从biorad获得的四个试剂盒进行这个分析：bio-plexprotm人类细胞因子21-重测定，cat#mf0-005kmiibio-plexprotm人类细胞因子27-重测定，cat#m50-0kcaf0ybio-plexprotm人癌症生物标记物组1,16-重，cat#171-ac500mbio-plexprotm人癌症生物标记物组2,18-重，cat#171-ac600m每个试剂盒中包含的这些细胞因子和生长因子如下：27-重:il-1β、il-1受体拮抗剂、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12(p70)、il-13、il-15、il-17、基本fgf、趋化因子、g-csf、gm-csf、ifn-γ、ip-10、mcp-1(mcaf)、mip-1α、mip-1β、pdgf-bb,rantes、tnf-α和vegf。21-重:il-1α、il-2rα、il-3、il-12(p70)、il-16、il-18、ctack、gro-α、hgf、ifn-α2、lif、mcp-3、m-csf、mif、mig、β-ngf、scf、scgf-β、sdf-1α、tnf-β和trail；16-重(癌症小组1)：segfr、fgf-碱性、卵泡抑素、g-csf、hgf、sher-2/neu、il-6rα、瘦素、骨桥蛋白、pecam-1、pdgf-ab/bb、催乳素、scf、stie-2、svegfr-1、svegfr-2；18-重(癌症小组2)：血管生成素-2、scd40l、egf、内皮糖蛋白、sfasl、hb-egf、igfbp-1、l-6、il-8、il-18、pai-1、plgf、tgf-α、tnf-α、μpa、vegf-a、vegf-c、vegf-d。1.4michecktmgpc-1elisa该michecktmelisa是96孔板中的标准夹心elisa形式。它使用多克隆抗gpc-1捕获抗体(lsbio，cat#ls-c313545)和mil-38单克隆抗体进行检测。该检测运行2小时，并与所有常用的自动化elisa系统兼容。使用血清和血浆的该原型michecktm检测的成功的内部验证已经完成。结果如下：-线性：在10pg/ml至1.5ng/ml的工作浓度范围内证实了分析线性。-敏感度：计算的重组gpc-1的检测限(lod)和定量限(loq)分别为约3.4pg/ml和7.2pg/ml。-人血清和血浆样品检测：在2至128倍的稀释范围内进行评估。在4倍和128倍稀释的血清/血浆之间(平均稀释10到20倍)观察到良好的线性检测。gpc-1的平均内插值为5.4ng/ml，在各种稀释液中有3.8％的cv-精确：从在分析的工作范围内分析的gpc-1的3个浓度(1.0/0.5/0.25ng/ml)中计算平均cv。表3：michecktmelisa对血清和血浆的批内和批间性能。批内批间n＝33cv(％)4.32.31.5数据分析对于bioplex分析，样品在96孔微量滴定板的每一列中按照连续的内部编号系统在向下方向上等分。确定荧光值并用于分析。roc分析(auc)使用r统计软件包来确定roc分析(罗宾(robin)等人，2011，《bmc生物信息学》(bmcbioinformatics)，12，第77页)。加权模型开发了一种算法来寻找辨别良性和前列腺癌样本的分析物表达的最佳组合。这个模型使用来自n个不同分析物(a)的表达式的加权和(s)如下：s＝w1a1+w2a2…wnan使用通用优化程序、该r分析程序中的nelder-mead算法来确定权重w1至wn。该程序针对s的值的roc分析的最大auc进行了优化，以分配良性或pc状态。每个重量的初始值通过取每种分析物的中值表达值与这些分析物的最大中值的比率来确定：w＝max(m)/m其中w＝{w1，...，wn}且m＝{中值(a1)，...中值(an)}；这个模型被用于优化两种和三种分析物组合的s(参见，佩佩(pepe)等人，2003，《生物识别技术》(biometrics)，59：133)。部分auc优化采用了一种替代方法，其中应用加权和nelder-mead优化程序来优化部分auc。pauc代表roc在受限(1-特异性)范围内的面积，并且通常这个范围在0和e之间，其中e必须被指定。这里e被设定为0.5。当两个auc相等时，比另一个roc更早地上升的roc将具有更高的特异性。优化pauc而不是该全auc对具有较高特异性的测试进行优化。这种方法使用如针对rocauc分析所述的r分析程序用来生成n分析物的加权总和。2.结果2.1分析gpc-1分析使用该michecktmelisa检测在正常、bph和cap患者中测定可溶性gpc-1水平(表4)。在cap患者样品中gpc-1水平低于正常或bph样品。表4第1组(正常)/第2组(bph)和第3组(cap)的gpc-1elisa结果。gpc-1水平进行对数变换以实现正常的数据分布。为辨别bph和cap组的michecktmelisa的敏感度和特异性在不同的分界点确定(表5)。该对数gpc-1水平在1.95的切点处给出了0.585的最大auc以及分别为0.51(51％)和0.66(61％)的敏感度和特异性。该数据的第二个独立分析产生了0.61的auc和0.57/0.57的敏感度/特异性。不同固定特异性处的敏感度在特异性为90％时为20％，特异性为85％时为29％，特异性为80％时为33％，特异性为75％时为35％。表5：在不同切点处用于辨别bph和cap样品的对数变换的gpc-1值的敏感度和特异性。*与几率相比请注意，表示为“0.30”的敏感度或特异性值相当于30％。多个分析物分析对具有高特异性的前列腺癌检测没有满足需求，以补充psa测试的高敏感度(～80％)因此确定了最大化特异性的切点。该高特异性的最佳切点确定为1.85，其中敏感性为0.3(30％)，特异性为0.81(81％)。诊断检测的特异性和敏感度可以通过测量多个分析物而不是单个分析物来提高。因此，在区分bph和cap患者中包括具有gpc-1水平的其他分析物的效果被确定。为了使bph和cap患者之间的差异最大化，评估了使用具有不同权重的分析物组合的加权总和优化程序。总共82种不同的分析物与gpc-1结合进行测试以优化组合的性能。进行了优化的加权总和的确定。使用加权总和建立截断阈值，由此使受试者工作曲线(roc)的曲线下面积(auc)最大化为最小化错误分类率。该敏感度和特异性在这个最大auc值下确定。这个分析独立进行三次。-gpc-1和另一个分析物gpc-1和另外一种分析物的auc优化分析结果被总结在如下表6中。示出了三种分析物中特定组合出现的频率。以下分析物组合被鉴定：表6gpc-1和另一种分析物的auc优化分析。统一分析物其他分析物频率(3)gpc-1hgf3egf3pai-13g-csf3pdgfab.bb3pdgfbb2huil-181scd40l1hugm-csf1huifnγ1卵泡抑素1结果显示，通过适当的加权和分析物组合，可以实现改进的auc/敏感度和特异性结果。前11种组合的auc值全部从单独地gpc-1的0.585的auc得到改善。这些组合的auc在0.629(gpc-1/hugm-csf，分析2)至最大值0.71(gpc-1/hgf，分析3)之间的范围内改善。敏感度和/或特异性也显示了比单独地gpc-1的改进。例如，与单独地gpc-1(分析2，表7)的0.51和0.66相比，gpc-1/hgf组合的敏感度和特异性分别为0.64和0.72。-gpc-1和两个分析物分析使用gpc-1和另外两种分析物重复该优化分析。表7显示了优化分析的结果。向gpc-1中加入两种分析物导致比gpc-1或gpc-1+1分析物的auc、敏感度和/或特异性的进一步改善(表8)。表8：将两种分析物加入到gpc-1中。分析物auc敏感度特异性gpc-10.5850.510.62gpc-1/hgf0.7030.640.72gpc-1/hgf/fgfb0.7350.600.85gpc-1/egf0.6630.4040.88gpc-1/egf/hgf0.7310.600.81以下gpc-1加两种分析物组合在分析中被鉴定为最佳表现组合(表9)。表9：优选的gpc-1加两种分析物组合。-pauc优化auc优化分析的结果表明与作为分析物之一的gpc-1相比，使用gpc-1加上一种或两种分析物可以改善第2组bph和第3组cap的辨别。鉴定gpc-1和一种或两种分析物的最优组合的目的是最大化辨别bph和cap患者组的特异性。校正的优化方法被开发，其中应用加权和nelder-mead优化程序来优化部分auc。pauc代表roc在受限(1-特异性)范围内的面积，并且通常这个范围在0和e之间，其中e必须被指定。这里e被设定为0.5。当两个auc相等时，比另一个roc更早地上升的roc将具有更高的特异性。优化pauc而不是该全auc对具有较高特异性的测试进行优化。将部分auc优化程序应用于gpc-1+一种(表10)和gpc-1+两种分析物方法中(表11)。确定了90％、85％、80％和75％固定特异性的灵敏度。结果显示为“分析4”，表7。gpc-1加一种另外的分析物的部分auc优化程序被执行。如auc优化所观察到的，除了gpc-1之外，掺入一种分析物改善bph与cap的辨别(表7和表12)存在于gpc-1+1分析物组合中的被鉴定的前5种分析物如下：表10：gpc-1加上部分auc优化中使用的一种分析物组合。统一分析物其他分析物gpc-1hgfpai-1g-csfpdgfab.bbhuil-9除了huil-9之外，所有这些分析物与使用前面描述的auc加权和优化程序所鉴定的那些分析物是相同的。使用gpc-1加两种额外的分析物进行该pauc优化。表现最佳的gpc-1加两种分析物组合如下：表11：gpc-1加上部分auc优化中使用的两种分析物组合。统一分析物第二分析物第三分析物gpc-1hgfhufgfb、pai-1、egfegf卵泡抑素、hgf、tnfα在给定的固定特异性下，添加第三分析物提高了灵敏度(表12)。表12：gpc-1和gpc-1分析物组合的auc和固定特异性下的敏感度衍生自pauc优化。-辨别bph和cap的最佳表现组合该4个独立分析的结果(3个auc优化和1个pauc优化)表明，以下组合出现最频繁并且提供了最好的辨别(表13)。表13：具有最高频率和最佳辨别能力的组合。注释：sens/spec表示具有最高敏感性的敏感性与特异性组合注释：sens/spec表示具有最高特异性的敏感性与特异性组合通过交叉引用并入本发明要求2015年7月22日提交并以minomicinternationalltd的名义提交的题为“用于前列腺疾病的生物标记物组合(biomarkercombinationsforprostatedisease)”的澳大利亚临时专利申请号2015902919的优先权，其全部内容通过交叉引用并入本文。当前第1页12