具有超薄封闭二氧化硅层的磁性粒子及其制造和使用方法

专利名称：具有超薄封闭二氧化硅层的磁性粒子及其制造和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种涂有二氧化硅(Si02)的磁性粒子，其中，硅酸盐层封 闭、致密，且具有厚度极薄的特点，其厚度仅在几纳米范围内(由此，下文 也称其为"二氧化硅纳米层")。此外，本发明还涉及一种制备这种含硅酸盐 磁性粒子的改良方法，与现有技术相比，这种方法可以获得具有封闭硅酸盐 层的产品，从而使纯度大幅提高。通过这种新方法还能避免磁铁矿表面不受 控制地形成硅酸盐聚集体，从而有利于下文将要说明的特性和生物用途。此 外，这种新方法还可在分级离心基础上减少纳米固体颗粒。本发明的磁性粒 子具有最佳磁化性能和悬浮性能，并且能非常有利地脱离塑料表面。这种涂 有二氧化硅的高纯度磁性粒子优选用于从细胞样品或组织样品中分离核酸， 其中，这种样品基质分离借助于磁场而实现。这种粒子特别适用于对核酸(大 多源于生物体样品)自动提纯，以便通过各种扩增方法对其进行分析。
背景技术：
最近一段时间以来，分子诊断学变得越来越重要。分子诊断学已进入了 对疾病的临床诊断阶段。这包括分子标记测量，这种测量可改善疾病诊断、 早期查明、治疗过程中的病症监控、疾病预后和药物疗效或副作用的预测(包 括检测传染病病原体，检测基因组突变，依据给定的或在病情发展过程中取 得的遗传样品预测药物的疗效和副作用，发现正在扩散的肿瘤细胞以及疾病 易感体质风险因数的鉴定等)。目前，兽医学、环境分析学和食品检测领域 也应用到了分子诊断学的方法。更进一步的应用为病理/细胞学研究院或法律 问题调查中展开的研究。基因诊断学目前也应用于保健领域(例如对库存血 进行是否含有传染病病原体的检验)，立法者计划通过法律手段对这种检验 加以规范。临床分子诊断学所用的方法(例如杂交技术或扩增技术，如PCR (Polymerase Chain Reaction, 聚合酶链反应)、TMA ( Transcription Mediated Amplification,转录介导的扩增)、LCR ( Ligase Chain Reaction,连接酶链反 应)、bDNA ( branched DNA,分支DNA)或NASBA- (Nucleic Acid Sequence Based Amplification,基于核酸序列的扩增))在基础性科学研究领域中也属 于常规方法。
实施分子诊断学分析的前提通常是从待分析样品中分离出DNA或 RNA。虽然存在允许核酸分离和检测反应同时进行的分析方法(例如基于 bDNA的试验)，^旦作为分子诊断学中应用最广泛的生物分子方法，PCR由 于会受外因影响而几乎总是要求预先对核酸进行提纯。
传统的核酸制备方法以液-液萃取为基础。例如从组织样品中苯酚-氯仿
萃取DNA。但巨大的工作量和部分情况下需要使用剧毒物质的条件，使这
类方法在近年来远不如基于固相的方法受欢迎。
使用基于固相的核酸萃取方法时，无论具体问题是什么，样品制备属于
分析过程，其大致可分为四个基本步骤1.调整固相；2.使分析物与固相 进行选择性结合或特异结合，去除多余的样品基质；3.从固相中洗去有可能 存在的杂质；4.对提纯后浓缩的分析物进行洗脱。
在核酸的选择性和可逆性结合方面利用了核酸早已为人所知的特性，在 高离液盐或其他高盐(即高浓度离液盐或其他高浓度盐)条件下，将核酸特 异性地与含二氧化硅的吸附材料(例如玻璃粉[Proc. Natl. Acad. USA 76 (1979) 615-619, Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387]、硅藻土 diamatomeenerde [Methods Enzymol. 65 (1979) 176-182]或天然硅石[J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503， EP 0 389 063 Bl])结合。随后借助一种含有水溶性有机溶剂的緩冲 剂(通常为低级脂肪醇)从吸附剂中洗去杂质，对基质进行干燥，并用蒸馏 水或所谓的低盐緩冲剂(即低离子强度的缓冲剂)对所吸附的核酸进行洗脱。
在价格低廉的全自动核酸分离方面，使用超顺磁吸附材料的方法的作用 越来越大。
最简单的实施例(WO 01/46404)是在对为^^支术用途(例如电子照相调 色剂)而商业化制备的磁性粒子不采取进一步改性措施的情况下就将其直接 用于核酸制备。
这种大规模生产的产品虽然满足了几个最重要的先决条件，例如一定的 核酸吸附率和磁化率，但在另一方面，这些通过商业途径可购得的产品并未 满足某些对于取得高灵敏及可再现结果而言不可或缺的重要边界条件。举例 而言，在病毒诊断(例如HCV或HIV)领域非常重要的一点是，从血清或 血浆中萃取定量的病毒核酸(即接近100%的产率)，以便从中推导出确的 血清/血浆病毒浓度，并据此决定所需采用的治疗方法。磁性粒子的纯度在光 学分析中也起着决定性作用。正是由于磁性粒子大多仍呈微孔状，因而从粒 子内部扩散出来的铁原子会使溶液变色，从而对透射测量和反射测量造成严
重影响。
因此，目前有大量描述生物用途磁性粒子研发情况的文献，尤其是手动 核酸分离和自动核酸分离方面的研发情况。
其中，表面具有大密度SiOH基团的磁性粒子具有很重要的作用。因为 SiOH基团可与核酸进行可逆结合。二氧化硅改性磁性粒子也是本发明的主题。
为能取得高灵敏、定量及可再现结果，这种磁性粒子除磁化性和核酸结 合能力外还须符合一系列其他边界条件，下文将对这些边界条件进行详细说明。
粒度和粒度分布
事实表明，由Fe304 (磁铁矿)构成、主粒度范围约为0.1 pm至1 (im
的电子照相调色剂用磁性粒子(例如可从Fa. Lanxess公司购得的名为 BayoxideE的产品)具有近乎理想的粒度条件。因为通过这种粒度可实现对 于生物用途而言重要的"悬浮稳定性"的重要边界条件。这种悬浮稳定性必 须满足的条件是摇匀后几分钟(例如10至15分钟)内(核酸的吸附阶段) 不出现明显的沉淀现象，而施加磁场后，为尽可能缩短分析时间，带有核酸 的》兹性粒子必须在短短的几分钟(例如1至5分钟)内完全分离。
就这一方面而言，可使用的Fe304 (磁铁矿)磁性粒子上仍然存在的缺 陷是还含有少量纳米范围内的极细的磁性粒子。
这种会因其较大表面而结合大量核酸的非期望副产品在磁场中无法在 短短的几分钟内分离，因而(正是在核酸的定量测定方面)可能会导致这部 分核酸所含信息的丟失。
除产量损失外，这还会导致出现浑浊的黄褐色上清液，这种黄褐色上清 液不仅会给产品销售带来不利影响，也会对洗脱液的光度分析造成一定影 响。
因此，如果能针对此处所述的生物用途对这部分"纳米^t性粒子"进4亍 分离，是非常有利的。 硅酸盐含量
如上文所述，几种大规才莫生产的石兹性粒子(例如Fa. Lanxess公司的 BayoxideE系列)在未经过专门的二氧化硅后处理的情况下仍具有一定的核 酸结合能力，这是因为这类磁性粒子在大批量生产下，在表面也具有少量 SiOH基团。这类产品由于核酸吸附量较低而相应需要相对较高的磁性粒子 量，这会加大小体积样品的处理难度。
此外，这类产品具有相对于此处所述用途而言不利的容器壁(例如进行 核酸提纯时通常所需用到的微量滴定板上的玻璃或塑料壁)润湿特性。因此， 悬浮液中残留有大量未改性的相对疏水的磁性粒子，这些磁性粒子吸附在微 量滴定板壁上，从而影响移液精度，并造成产量损失。
在此情况下，具有大密度SiOH表面基团的粒子的特性非常有利，这种 粒子由于其所具有的亲水性可以非常有利地从塑料壁(例如上述微量滴定 板)上滚落。
因此，在很多用于核酸分离的磁性粒子研发产品中，二氧化硅含量相对 于磁铁矿含量更为重要。如WO 01/71732中所述，在存在》兹性粒子的情况下 对活性硅土化合物(例如四乙氧基硅烷(TEOS))进行水解可得到二氧化硅 粒子，这些二氧化硅粒子可被所夹杂的;兹铁矿;兹化。由于表面的SiOH基团 密度很大，因此，这种粒子虽然具有良好的核酸结合能力和有利的微量滴定 板壁润湿特性，但在另一方面，由于磁铁矿含量减少，粒子的磁性也相应地 被大幅削弱。此外，通过这种方式制成的磁性二氧化硅粒子具有较为不利的 形态特性，例如其粒度和粒度分布非常不均匀，其中需要指出的是，大体积 的非球形粒子在自动移液过程中可能会引起堵塞。
可萃取成分
用磁性粒子法分离出来的核酸通常还需接受进一步的处理，例如PCR
(Polymerase Chain Reaction, 聚合酶链反应)、TMA ( Transcription Mediated Amplification,转录介导的扩增)、LCR ( Ligase Chain Reaction,连4妄酶纟连反 应)、或NASBA- (Nucleic Acid Sequence Based Amplification,基于才t西臾序歹寸 的扩增)。此处涉及的是高灵敏的酶控方法，会被各种例如具有酶阻断剂作 用的杂质和铁化合物影响。
因此，用于核酸提纯的磁性粒子必须满足特别的纯度要求。如果使用大 头见模生产的氧化铁(例如Fa. Lanxess公司的Bayoxide),带来的问题就是不 可忽视的，因为磁铁矿粒子具有一定的孔隙度和表面粗糙度。因此，杂质可 能在氧化铁制备过程和随后的二氧化硅处理过程中嵌入微孔内，这些杂质在 接下来的过程中不是起到酶阻断剂的作用，就是由于自身颜色而对光度分析 造成干扰。

发明内容
从可购得的磁性粒子出发，本发明的目的是制备一种具有大密度SiOH 表面基团和致密的封闭硅酸盐表面层的二氧化硅改性磁性粒子。通过二氧化 硅改性，初始产品的形态和极好的磁性都不会受到较大影响。二氧化硅涂层 也会给塑料表面的润湿特性带来有利影响。此外，二氧化硅改性磁性粒子在 可萃取杂质方面经过了 一定程度的优化，使得磁铁矿的芯内不会渗出杂质和
铁化合物，从而避免生物检测反应和光度分析受到干扰。 现有技术
WO 03/058649从Fa. Lanxess公司的磁性粒子Bayoxide E出发，说明了 一种用水玻璃溶液(例如Fa. Cognis公司的水玻璃HK 30 )在粒子表面沉积 二氧化硅的方法。通过对Bayoxide E/水玻璃溶液的pH值进行逐步稀释，即 等同于将pH值从强碱性(pH 11.5)逐步转移到中性(pH 7),就可在磁性 粒子表面进行柔和的二氧化硅沉积。如WO 03/058649 +所述，如果通过添 加酸来使pH值下降(WO 98/31840)，酸滴入点上的水玻璃就会不受控制地 转变成二氧化硅(Si02),磁性粒子积聚在二氧化硅的结构中，从而使得上 文所述的在磁性粒子表面进行的可控二氧化硅沉积无法实现。尽管如此，通 过WO 03/058649中所说明的"成批处理法"仍无法完全避免表面上形成极 小的二氧化硅聚集体。
也就是说，WO 03/058649中所述的二氧化硅改性磁性粒子虽然在表面 结构和核酸结合能力方面显示出了良好特性，但在对相关悬浮液进行长期性 能检验时(几个星期)，观察到了非常不利的黄褐色上清液。在通常都会使 用表面活性剂的生物化—验中，只需较短时间就能观察到这种效果。除水玻璃 成分外，通过分析法还能从这部分有色上清液中检测出痕量的4失化合物和极 细的磁铁矿粒子。显然，这些杂质是从二氧化硅表面嵌入多孔的磁性粒子结 构内，并从此处开始随时间推移逐步向外扩散。此外，这些观察结果还表明
了 ，通过WO 03/058649中所说明的成批处理法无法制备完全封闭或分布均 匀的硅酸盐层，因而也无法避免铁化合物的渗出。
具体实施例方式
为能除去上文所述的可萃: 又干扰成分，本发明实施了下文将要加以说明 的方法优化措施，其中，本发明的改进之处可通过与WO 03/058649中所述 方法的比较而得到体现。在下文将要说明的试验中，使用的并不是WO 03/058649中所用的Bayoxide E 8707 (不再是标准产品)，而是非常相似的型 号Bayoxide E 8706。两种情况下涉及的都是由于生产原因而含有少量Si的 Fe304磁铁矿，其中，型号8707的Fe/Si含量为99.1/0.9, Bayoxide E 8706 为99.4/0.4。本发明的方法的重要之处在于表面特性，主要是Fe304磁铁矿的 pH值。pH值为6.5的Bayoxide E 8707具有弱酸性表面，而本发明所用的型 号Bayoxide E 8706所测出的pH值为中性，根据不同批次，甚至测出了弱减^ 性值(pH7.5)。本发明令人惊讶地发现，即便是这种弱碱性表面特性也能诱 发水玻璃-二氧化硅分离。 一般情况下是通过添加酸来从强石成性水玻璃溶液 中分离出二氧化硅。
在进行比较试验的过程中，本发明令人惊讶地发现，如果用一种连续处 理法(例如膜法)来代替WO 03/058649中所述的pH值逐步降低法，就能 在可萃取成分方面取得明显有所改善的结果。其中，使用"错流微滤"，通 过一个小时的反应时间可对水玻璃/磁性粒子悬浮液实现提纯，下文将在实例 中对此进4亍详细说明。如M .穆尔德(M. Mulder )在《膜技术基本原理》(Basic Principles of Membrane Technology )中所说明的那样，"错流微滤，，是一种已 知的在低超压情况下进行的分离或提纯方法。这种方法在体积恒定(即通过 输入相同体积流量的淡水来置换含有杂质的渗透物体积流量)的情况下实 施。与生物学中已知的渗析法不同，微滤过程中，根据孔隙的具体直径，不 仅可分离出低分子盐，还能分离出颗粒状杂质。这种连续提纯处理一直进行 到排出的渗透物纯度与所输入淡水的纯度相当为止，大约需持续12至15小 时。
在用ESCA进行表面分析表征时，本发明令人惊讶地发现，通过这种方 式制成的二氧化硅改性磁性粒子在二氧化硅表面方面具有一种新型的(即超
薄的)二氧化硅结构，这种二氧化硅结构可以改善提纯效果，提高纯度。这 种二氧化硅纳米层的特点在于一个均匀分布在整个粒子表面上的、厚度不超 过5nm的硅酸盐层。此外，通过本发明的方法还能实现2nm的层厚，非常 有利的情况下也能实现0.5 nm至0.2 nm的层厚。经过这种涂层处理的粒子 所具有的表面涂层的特征(例如)在于，其可避免铁离子渗入周围溶液中。
下文将在实例3中对二氧化硅层厚为0.2 nm的磁性粒子的制备方法进行 说明。
此外，本发明的方法的特征还在于一个致密的封闭硅酸盐层，这个硅酸 盐层也可改善纯度和上清液中可观察到的沾污效应。与WO 03/058649中所 说明的方法相比，使用本发明的方法制成的具有二氧化硅涂层的磁性粒子的 纯度有了明显改善。因此，制成和洗净后，上清液不会再出现看得见的变色 现象(参见实例2和3 )。借助于致密的封闭二氧化硅层可避免看得见或看不 见的杂质(例如铁离子)渗出，这些杂质会对生物试验的扩增方法或光学分 析造成干扰(参见实例4和5 )。
除此之外，本发明还令人惊讶地发现，在上文所述的膜滤法中通过緩慢 的持续稀释将pH值降到中性值，可近乎完全地避免磁铁矿表面形成硅酸盐 聚集体，或者说，与WO 03/058649中所说明的"成批处理法"相比，借此 可进一步大幅减少形成在磁铁矿表面的硅酸盐聚集体。这种定义明确的硅纳 米层会对下文将要说明的特性和生物用途产生有利影响。
此外，本发明还发现，如果在膜法之后实施分级离心法(可对緩慢沉淀 下来的氧化铁粒子进行分离)，就可实现以获得纯净的上清液为目的的附加 性产品优化。
通过这种方式制成的悬浮液形式的样品符合了所有的标准，例如与初始 产品完全相同的磁化性、稳定不变的形态、良好的核酸结合能力、可从微量 滴定板壁上滚落的有利特性、突出的悬浮稳定性(即在短短的几分钟内在上 清液中未出现明显杂质的情况下在磁场中顺利分离出磁性粒子)。
"涂有二氧化硅的磁性粒子，，这一表述包括涂有二氧化硅纳未层的磁铁矿芯。
"致密的封闭二氧化硅层，，这一表述包括厚度在5 nm以内的均匀均质的 单分子至多分子二氧化硅层，层厚优选为2 nm，特别优选为0.5 nm至0.2 nm。 这个封闭的二氧化硅层可避免铁化合物和铁离子渗入涂有二氧化硅的磁性 粒子的周围环境中。
"改良的制备方法，，这一表述包括一个借助微滤或超滤单元而实现的、 既易于实施又很彻底的清洗过程，这个清洗过程可使涂有二氧化硅的磁性粒 子具有极高的纯度。使用这种方法时， 一开始硅酸盐纳米层会沉淀在粒子表 面，随后，反应液会以可控方式得到持续性的緩慢稀释，从而其pH值降到 中性，借此可在磁铁矿表面形成一个极其均勻、致密的封闭型均质硅酸盐层。 此外还可避免形成具有干扰作用的硅酸盐聚集体，或者i兌，可显著减少具有 干扰作用的硅酸盐聚集体。
"借助离心技术减少纳米微粒成分"这一表述包括离心技术或简单的重 力技术的应用。其中，有用成分发生沉淀，而非期望的纳米微粒成分则可与 上清液一起去除。借助超速离心法确定粒度分布后，可借助减少了的微粒状 成分对这种效应进行检测。离心技术是对约3000 g的初始悬浮液进行离心分 离15分钟，去除上清液后加入同等量的水或缓沖剂，进行再悬浮，并将这 些步骤重复多次(最多可达10次)。采用重力技术时，只需等待较长时间而 不采用离心分离，直至大部分粒子沉淀在容器底部为止，随后再置换掉水性 上清液。
"最佳磁化性能"这一表述包括本发明的粒子的下述特性，即具有尽可 能大的磁铁矿含量，因此，从外部向反应容器上施加磁场时，本发明的粒子 可在短短的几分钟(例如1至5分钟)内在提純过程中与样品基质完全分离。 这一点主要是针对下述情况而言，即在自动移液设备上实施的自动方法所用 的提纯时间尽可能短，以及将磁场强度有限的价格尽可能低廉的磁体用作硬 件成分。"悬浮性能"这一表述包括本发明的粒子的下述特性，即在提纯阶段，本发明的粒子基于最佳粒度分布而在摇勻后的几分钟(例如10至15分钟) 内(核酸的吸附阶段)不出现明显的沉淀现象。"脱离塑料表面的最佳脱离性能"这一表述包括本发明的粒子的下述特 性，即本发明的粒子基于亲水的表面特性而与生物提純过程所用的塑料物品之间具有很小的亲合性。所用的塑料物品包括聚苯乙烯、聚乙烯容器和聚丙 烯容器以及由类似塑料制成的任意形状和任意尺寸的微量滴定板。其中，本发明的磁性粒子的特殊二氧化硅层与这些塑料表面之间存在排斥性的相互 作用，因此，涂层磁性粒子会从这些表面上滚落，而不与之发生较大的相互 作用，这种较大的相互作用最终会在核酸的生物提纯过程中导致产量损失。"分离，，这一表述包括使用上述涂有二氧化硅的磁性粒子对生物样品进 行核酸提纯，主要分成以下几个单个步骤a) 用裂解緩沖液将样品溶解在反应容器内，经培养后加入特定而言含 有高离液盐、优选含有高摩尔浓度的异硫氰酸胍的结合緩冲液b) 加入涂有硅酸盐的^兹性粒子c) 在能使核酸结合到磁性粒子上的温度下进行培养d) 通过施加磁场从待反应物中去除未结合成分，石兹场使磁性粒子与周 围液体分离e) 多次添加清洗緩冲液，在粒子发生磁化以将不确定的结合分子从核 酸中清除后，再去除清洗緩冲液f) 在核酸与磁性粒子分离的情况下加入洗脱緩冲液g) 重新施加磁场后将分离带有核酸的洗脱液"自动提纯，，这一表述包括这种方法的实施方案，即全部或^5l在几个分步骤中取消操作人员的手动操作，自动提纯主要在以下几个步骤中实施用 专用缓沖剂溶解生物组织样品、添加磁性粒子、在一定的温度条件下进行培 养、去除未吸附的样品成分、清洗步骤、在一定的温度条件下从粒子上洗脱 已结合的核酸、从粒子悬浮液中分离出洗脱液。"核酸"这一表述包括寡聚和聚合核糖核苷酸或链长超过10个单体单元 的2'-脱氧核糖核香酸。核酸中的单体单元通过相邻羊体单元的3'-和5'-羟基 之间的磷酸二酯键而连接起来， 一个杂环碱基通过糖苷键结合在碳水化合物成分的l'-原子上。核酸可通过形成分子间氢^:而构成双^随和三链分子。"核酸"也指蛋白质/核酸复合物和带有合成核苷酸的核酸，例如吗啉或 PNA ( peptide nucleic acid， 肽核酸)。
"生物组织样品，，这一表述包括含核酸的生物材料，例如全血、血清或血浆(特别是含病毒的血清或血浆，其中尤指感染了 HIV和HCV的血清样品)、"血沉棕黄层"(即血液中的白细胞成分)、排泄物、腹水、涂片、唾液、 器官抽出物、活组织检查、组织切片(尤指用含福尔马林的固定剂嵌在石蜡 中的各种固定程度不一的组织切片)、分泌物、液体、胆汁、淋巴液、小便、 大便、精液、细胞和细胞培养物。"生物组织样品，，也可以是来自于生化处 理过程、随后需加以提纯的核酸。"通过各种扩增方法进行检测"这一表述包括借助各种分子生物技术(特别是PCR、转录介导的扩增(TMA)、 LCA或NASBA)复制已提纯的核酸 和在此之后进行的或同步进行的扩增产物检测。"通过各种扩增方法进行检 测"也指用信号扩增法(例如bDNA)进行的检测，即不通过核酸扩增而实 现的检测。PCR检测可特别通过借助荧光技术的动态方法在"实时"条件下 进行,或在传统的琼脂糖凝胶上进行。"实时"PCR可在使用相应校准器的 情况下对核酸进行非常有效的定量测定。其中，对于临床灵敏度而言关键且 起限制作用(避免假阴性结果)的是核酸的有效提纯，即将核酸有效地结合 到磁性粒子上，并在PCR相容条件下可逆地将其释放。本发明的另 一主题是用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含以下各组 成部分(a) 用于溶解样品的试剂(b) 含二氧化硅的磁性粒子或含二氧化硅的磁性粒子的悬浮液(c) 清洗緩冲液(d) 洗脱缓沖液有关试剂盒的各组成部分的用途和用法，参见上文中的实施方案和下文 中的实例。也可以不同于此的其他形式对试剂盒的单个或多个组成部分进行 使用。通过本发明可在使用专门制备的涂二氧化硅^^性粒子的基础上，借助相 应的扩增技术对生物组织样品的提纯物进行特别有效的、自动的定量核酸检测。本发明借此为核酸诊断学作出了重要贡献。 实例下面涉及的是实施上述方法的详细报告。这些实例给出了适用于待提纯 核酸的精确反应条件，但可依据待提纯核酸对各项参数(例如磁性粒子量、 培养和清洗温度、培养和清洗时间、裂解緩冲液浓度、清洗緩冲液浓度和洗脱緩冲液浓度)进行修改。实例一用Bayoxide E 8706和水玻璃37/40通过逐步降低pH值制备涂 有硅酸盐的磁铁矿粒子(与WO 03/058649 Al中公开的方法相同)反应部分在带有KPG搅拌器的6 1三颈烧瓶内加入4000 g的水玻璃溶液37/40 (Cognis有限公司)。 一边搅拌一边在10分钟内加入2000 g的Bayoxide 8706 (Bayer股份公司)。随后在室温下再搅拌一个小时。 处理搅拌器关闭后，涂有二氧化硅的》兹铁矿粒子沉淀下来。必要时可通过施 加磁场使这个过程加速进行。等待一个小时后抽出上清液。加入4i水，撹 拌约10分钟。再次将上清液抽出。这个清洗过程还需重复至少四次，直至 最终的洗水达到7.5-7.0的pH值为止。二氧化硅磁性粒子的特性Zeta电位 -50.2根据ESCA的二氧化硅含量 7.0原子％ Si纯度在室温下静置10天后，上清液变成了黄/褐色。实例二用Bayoxide E 8706和水玻璃37/40，通过"错流微滤"连续降 低pH值来制备涂有硅酸盐的高纯度磁铁矿粒子。重复实例一中所述的反应部分，但不是以逐步或成批的方式，而是借助 Fa. PAIX公司的带有0.2 |im Supor⑧膜盒的微滤单元"Centramate "来进行 处理。为此，用泵通过软管将磁性粒子悬浮液抽出，并将其引导到膜盒上，倒 掉渗透物，但将滞留物重新导入反应容器内。在粒子悬浮液中再次加入与渗 透物等量的悬浮液。经过12小时的过滤后，渗透物在pH值和电导率方面均达到了原水的品 质，提纯过程至此结束。最终产品的特性Zeta电位-41mVSi含量 根据ESCA为4.9原子％ Si。初始产品Bayoxide 8706的二 氧化硅含量2.4原子。/。Si。据此，2.5原子％ Si的差量通过用水玻璃实施的二氧化硅处理后沉淀在 粒子表面。由此产生的二氧化硅层厚为0.4nm。纯度经超滤提纯的粒子悬浮液在室温下静置好几个月后，其上清液也 未出现变色现象。实例三用BavoxideE 8706和水玻璃37/40通过"错流微滤"连续降低pH值， 随后实施分级离心法，以制备涂有硅酸盐的高纯度磁铁矿粒子，用离心器(Eppendorf 5810)对3225 g的实例二中所述的最终产品进行 7分钟的离心分离。当产品的主要部分(> 98%)沉淀下来后，将深褐色上 清液倒掉。将沉淀物重新放入水中，并对其进行离心分离，将其与有色上清液分离。 这个分级离心过程还需重复8次，直至得到无色的上清液为止。 最终产品(第九份离心产物)的特性 Zeta电位-35 mVSi含量 3.0% Si。 0.6原子％的差量通过用水玻璃实施的二氧化硅
处理后沉淀在粒子表面。由此产生的二氧化硅层厚为0.2 nm。纯度通过这种方法制成的磁性粒子悬浮液的上清液在放置好几个月后 仍完全保持无色。这种产品品质主要在磁性分离方面具有很高的价值。因此，施加;兹体后， 在不超过20秒的时间内就可观察到绝对纯净的上清液。实例四对来自于涂二氧化硅》兹性粒子的悬浮液的水性上清液进行光学测量这个试验采用的是两份批号分别为H正13266 (源于本发明的方法的实 例二和实例三)和HIE12106R2 (源于WO 03/058649 A1中公开的方法，基 于Bayoxide E 8707 )的涂二氧化硅》兹性粒子的水性上清液，用Nanodrop公 司的分光计测定的其吸收光谱在221 -750 nm范围内(参见

图1 )。从这些光谙中得出的水体光语用作参考。还将另 一份水体光i普用作对照 样品(零线)。从光谱中可以看出，批号为HIE 13266的涂二氧化硅^t性粒子的水性上 清液具有与水相似的吸收性能。而批号为HIE 12106R2的上清液的吸收曲线 则显示出了明显不同的更强的吸收性能(范围约在500 nm )。从中可以看出，与通过依次进行多次清洗或通过逐步降低pH值(另见 WO 03/058649 Al )而制成的HIE 12106R2粒子相比，本发明的新型制备方 法(即在^f敫滤单元中连续清洗(粒子HIE 13266))可以改善沾污效应或减少 渗入上清液中的铁化合物。粒子HIE 12106R2的这种沾污效应体现在上清液 放置一段时间后所发生的可见变色现象和强度有所增大的吸收特性上。此外 还可看出，通过本发明的方法实现的上清液中的这种有所改善的沾污效应表 明粒子上有封闭的二氧化硅层。实例五涂有二氧化硅的磁性粒子的水性上清液在RT-PCR时的特性在磁化条件下对两份不同的涂二氧化硅磁性粒子(批号HIE 13266和 HIE 12106R2)的水性上清液进行^f企测。批号为HIE 13266的粒子用本发明 的制备方法通过在微滤单元内连续清洗而制成(参见实例二和实例三)。批 号为HIE 12106R2的粒子通过依次进行的多次清洗而制成(参见WO 03/058649 Al ，基于Bayoxide E 8707 )。随后对两份上清液进行定量RT-PCR:在Stratagene公司的MX4000上进行所谓的定量RT ( Reverse Transcription,反转录)-PCR。其中，在三份20 pi的预混试剂中分别加入两 种粒子的5 pl上清液和5 iil对照用水。预混试剂中含有下列成分400 nM 引物A、 400 nM引物B、 10 ng MCF-7 RNA( Ambion )、 Taqman引物200 nM、 一份緩冲剂A、 5 mM MgCl2; 1.2 mM dNTP、 8 U RNase抑制剂、20 U MuLV 反转录酶、1.25 U Taq Gold (均来自Applied Biosystems公司)。PCR方案为 45。C时30分钟，95。C时10分钟，96。C时15秒钟内45个循环，63。C时60 秒钟，72'C时30秒4f。将配制品放入96孔微量滴定板(Stratagene ),锁紧96孔微量滴定板后 将其放入分析器内。分析器启动后，在信号曲线的扩增指数范围内选定一个
基值(荧光强度)的情况下为每份样品分配一个特有的Ct值(使选定基值与 扩增曲线相交的循环数)。从图2中可以看出，粒子H正13266的上清液的扩增曲线与作为样品的 水的扩增曲线相似。而从图2的右边可看到，HIE 12106R2上清液的扩增曲 线约偏移了三个Ct值，这表明，RT-PCR的效率受到了干扰或不利影响。
权利要求
1.一种涂有二氧化硅的磁性粒子，其特征在于，所述涂有二氧化硅的磁性粒子具有一个最大层厚为5nm的含有硅酸盐的封闭表面涂层。
2. 根据权利要求1所述的涂有二氧化硅的磁性粒子，其中，硅酸盐的 最大层厚为2 nm。
3. 根据权利要求1所述的涂有二氧化硅的磁性粒子，其中，硅酸盐的 最大层厚为0.5 nm。
4. 根据权利要求1至3所述的涂有二氧化硅的磁性粒子，其中，磁性 材料为氧化铁或》兹铁矿。
5. 根据权利要求4所述的涂有二氧化硅的磁性粒子，其特征在于， 粒度分布介于0.1 和1 fim之间。
6. —种制备4艮据权利要求1至5所述的粒子的方法，其特征在于， 先通过铁粒子表面特性诱发硅酸盐从水玻璃或硅溶胶中分离出来，并沉积在磁铁矿粒子上，随后通过緩慢、持续的稀释将pH值降到中性pH值， 对所述表面进行整平和密封。
7. —种通过使用根据权利要求1至5所述的磁性粒子来对生物组织样 品进行核酸提纯的方法。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于， 所述核酸涉及的是RNA或DNA。
9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于， 涉及的是HCV或HIV的RNA。
10. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于， 涉及的是来自于固定组织样品的RNA或DNA。
全文摘要
本发明涉及一种涂有二氧化硅(SiO₂)的磁性粒子，其中，二氧化硅层封闭、致密，且具有厚度极薄的特点，其厚度仅在几纳米范围内(下文也称其为“二氧化硅纳米层”)。此外，本发明还涉及一种制备这种含二氧化硅磁性粒子的改良方法，与现有技术相比，通过这种方法不仅能获得具有封闭二氧化硅层的产品，还能大幅提高纯度。通过这种新方法还能避免磁铁矿表面不受控制地形成硅酸盐聚集体，从而对下文将要说明的特性和生物用途产生有利影响。此外，这种新方法还可在分级离心基础上减少纳米固体颗粒。本发明的磁性粒子具有最佳磁化性能和悬浮性能，并且能非常有利地脱离塑料表面。这种涂有二氧化硅的高纯度磁性粒子优选用于从细胞样品或组织样品中分离核酸，其中，这种样品基质分离借助于磁场而实现。这种粒子特别适用于核酸(大多源于生物体样品)的自动提纯，以便通过各种扩增方法对其进行检测。
文档编号H01F1/12GK101213619SQ200680020971
公开日2008年7月2日 申请日期2006年6月13日 优先权日2005年6月23日
发明者卡尔海因茨·希尔登布兰德, 吉多·亨尼格 申请人:西门子医疗系统诊断股份有限公司