专利名称：制备(-)-薄荷醇及类似化合物的方法
技术领域：
本发明涉及生产(-)-薄荷醇及类似化合物的方法。
如上已讨论过的，外消旋薄荷醇含有4对立体异构体薄荷醇。从该异构体混合物中分离出(-)-薄荷醇，可用结晶、冻干或蒸馏的化学方法进行。
麝香草酚氢化可形成8个薄荷醇异构体，然后可将这些异构体酯化，通过对(-)-酯经微生物酶的选择性氢化作用，可得到(-)-薄荷醇。关于使用酶从外消旋混合物中溶解出薄荷醇(或作为自由酶，或作为整个细胞体系的部分)，已被广泛研究。
已确定有多种细菌、真菌和酵母具有使酯水解的作用。在“Biotechnol.Gen.Engineer.Rev.6271-320 by Y Mikami(1988)”中已有报道，提出微生物能水解乙酸酯，细菌和真菌也能水解乙酸异酯。
在Takasago Perfumery Co Ltd.的专利(美国专利3,607,651；1971年9月21日)中，要求保护下列具有一个羧基水解酶的生物体青霉菌、胶霉、木霉素、白地霉(Geotrichum)、曲霉、茁霉、镰刀霉、Absida、小克银汉霉、根霉、放射毛霉、Chlamydomucor、毛霉菌、赤霉菌、链霉菌和杆状菌。这些霉菌均显示出对(-)酯及(-)-异酯的水解作用。然后将形成的这两种薄荷醇异构体用精馏、结晶、层析法分离。
在一些实施例中所得的产率是用Absidia明痂锈菌(hyalospora)，在24小时内(-)-乙酸酯的转化率为47.5％；从乙酸酯混合物(5.8％(±)-新薄荷醇、30.4％(±)异薄荷醇；63.8％(±)-薄荷醇及其它物质)中，用Trichoderma viride，在24小时内得到28.8％(-)-薄荷醇和17.4％(-)-异薄荷醇；用枯草芽胞杆菌黑色变种，48小时后从(±)乙酸酯得到50.3％。
已经开发了一种新的用假单胞菌sp.NOF-5进行立体选择性地水解(±)-薄荷醇单氯乙酸酯方法，假单胞菌sp.NOF-5看来可重新分类为Alginomonasnonfermentans NOF-5。这种生物体显示出将(±)-异乙酸酯水解为(-)-异薄荷醇的作用，并可非立体专有选择性水解新异乙酸酯(再参见美国专利No 3,607,651)。
研究最广泛的脂肪酶是假丝酵母cylindracea(其已被重新分类为假丝酵母玫瑰属)。已经研究了从薄荷醇混合物酯化形成的酯中分离(-)-薄荷醇，(薄荷醇混合物是用Haarmann-Reimer法得到的)，薄荷醇混合物由55％(±)-薄荷醇、-29％(±)-新薄荷醇、14％(±)-口异薄荷醇和2％(±)-新异薄荷醇组成。这些薄荷醇异构体用C.玫瑰属脂肪酶(脂肪酶MY，Meito SangyoLtd生产)的选择顺序是(-)-薄荷醇(100％)、(-)-异薄荷醇(48％)、(-)-新异薄荷醇(35％)，(-)-新薄荷醇(3.3％)、(+)-薄荷醇(2％)、(+)-新异薄荷醇(0.6％)，及(+)-新薄荷醇(＜0.1％)。(-)-薄荷醇和(-)-异薄荷醇酯先转化，转化率为35％，之后，(-)-新薄荷醇、(+)-薄荷醇和(+)-异薄荷醇酯被消耗。因此，不可能从其它异构体中分离出(-)-薄荷醇。曾尝试用脂肪酶催化酯合成，两步反应得到富含(-)-薄荷醇的混合物，然后进行脂肪酶催化酯溶剂拆分，得到(-)-薄荷醇。此方法不能完全消除(-)-异薄荷醇，对于工业规模来说，其纯度也不够。(参见Bioflavour’87，C Triantaphylides等，(1988)Walter drGruter & Co.Berlin 531-542)。
当(-)-薄荷醇包含在混有(+)-薄荷醇和其它立体异构体、异薄荷醇、新薄荷醇和新异薄荷醇的混合物中时，上述微生物和酶均不能高度选择性地与(-)-薄荷醇反应。
PCT/IB 01/01008公开了一种从式III化合物8个立体异构体的外消旋混合物中分离所需的立体异构体单体的方法，其方法是将外消旋混合物置于适当的有机溶剂中，加入酯化剂和一种可立体选择性地酯化所需的立体异构体羟基的立体选择性酶，在足够的时间内，将所需的立体异构体按所需的百分比例转化为式IV化合物，得到首次反应产物，其中包括式IV化合物、该有机溶剂、未转化的式III化合物立体异构体、超量的酯化剂和反应副产物。然后从首次反应产物中分离式IV化合物。
本发明是上述方法的改进方法或修饰方法。
包括以下步骤(1)将起始物与酯化剂及一种立体定向酶反应，该立体定向酶是一种假单胞菌脂肪酶，该酶可立体选择性地酯化所需(-)立体异构体的羟基，经足够时间，将所需的立体异构体按所需的百分比例转化为所需的(-)酯化化合物(羟基转化为基团-O-C(O)-R4，其中R4是烷基或芳基或氢)，得到首次反应产物，首次反应产物中包括所需的(-)酯化化合物、有机溶剂、未转化的立体异构体(即薄荷醇(+)立体异构体、异薄荷醇、新薄荷醇和新异薄荷醇(+)和(-)立体异构体，或其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代的等同化合物)、过量的酯化剂和反应副产物；和(2)从首次反应产物中分离所需的(-)酯化化合物。
步骤(2)优选包括以下分步骤(2)(a)从酶中分离首次反应产物；
(2)(b)除去有机溶剂、超量的酯化剂及反应副产物，得到二次反应产物；及(2)(c)从二次反应产物中分离所需的(-)酯化化合物，得到含未转化的立体异构体的第三次反应产物。
本发明的方法在步骤(1)之前，优选包括以下步骤(1)将式III化合物8个立体异构体的外消旋混合物进行蒸馏步骤， 其中R1代表异丙醇基、异丙基或异丙烯基，从薄荷醇或其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代的它的等同物(±)混合物中，分离出至少一部分包括有异薄荷醇、新薄荷醇和新异薄荷醇或它们的等同物(其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代)的(±)混合物中的一种或多种物质，得到步骤(1)起始物。
本发明的方法还包括一个优选步骤，步骤(3)(3)将任何未转化的所需的(-)立体异构体、第三次反应产物中其它未转化的立体异构体和步骤(1)中所得的式III化合物六个其它立体异构体外消旋化，得到含接近热力学平衡的8个立体异构体的混合物的第四次反应产物，并将此第四次反应产物循环进行步骤(1)。
本发明的方法还包括一个优选步骤，步骤(4)(4)水解所需的(-)酯化的化合物，得到所需的(-)立体异构体。
在本发明的方法中，当所需的(-)立体异构体或所需的(-)酯化的化合物有一个异丙醇基或异丙烯基时，在步骤(4)之前或之后，可对该所需的(-)酯化化合物或所需的(-)立体异构体进行一个还原步骤，以转化该异丙醇或异丙烯基成为异丙基。
式III化合物六个其它立体异构体可以循环使用。
该方法特别用于从(±)-薄荷醇以及它的其它六个立体异构体混合物中分离(-)-薄荷醇。(-)薄荷醇和(+)-薄荷醇，以及薄荷醇的六个立体异构体的结构和(-)-乙酸酯结构见
图1说明。
立体定向酶优选Amano AK脂肪酶，由“Amano of Japan”提供。
所用酶可以是游离的，或固定在适当载体上，载体可以是硅藻土。
本发明方法中步骤(1)和(2)所用的条件与公开在PCT/IB 01/01008方法中步骤(1)和(2)的条件基本相同。
例如，步骤(1)可在一种适当的有机溶剂中进行。适当的有机溶剂指常规用于酶催化酯化反应所用的溶剂，包括异辛烷、正庚烷、癸烷、甲基环己烷、叔丁基甲基醚、二甲苯、煤油(C5-C6石蜡，四碘酚酞60/115)，(C7-C8石蜡，四碘酚酞94/125)、戊烷、环己烷、己烷、苯、丁醇、甲苯、异丙醇、乳酸乙酯和丙酮。
优选的溶剂是叔丁基甲基醚、环己烷、己烷、庚烷和异辛烷，最优选的是正庚烷。
所用有机溶剂的量的范围，相对于起始物是0％～80％的有机溶剂比100％～20％的起始物，优选范围是5％～80％的有机溶剂比95％～20％的起始物(体积比)。
同样，酯化剂可以是任何适当的酯化剂，如乙酸乙烯酯、乙酸丁酯、辛酸、乙酸异丙烯酯、丁酸乙烯酯、乳酸乙酯和乙酸乙酯，优选的酯化剂是乙酸乙烯酯。
酯化剂与所需的(-)立体异构体的摩尔比是0.5∶1～5∶1，当用乙酸乙烯酯作为酯化剂时，优选的酯化剂与所需的(-)立体异构体的摩尔比范围是1∶1～2∶1。
所用酶的优选量是1g/L～60g/L反应混合物，反应混合物包括起始物、适当的有机溶剂和酯化剂。
分离步骤优选在20℃～100℃，含20℃和100℃，常压或高压下进行。当所用酶是Amario AK时，优选的反应温度约为40℃。
分离反应进行足够时间，足以使所需的百分含量的所需的(-)立体异构体转化为所需的(-)酯化化合物。通常优选时间是，使尽可能多的所需的(-)立体异构体转化为所需的(-)酯化化合物，而存在于起始物中的其它立体异构体不发生酯化反应。
当反应以分批模式进行时，反应时间优选约24小时或24小时以下。
下一步骤，本发明的方法的步骤(2)(a)，是从酶分离首次反应产物，使酶可循环使用。这可采用离心或过滤方法实现。
本发明方法的一个主要优点是，在分离步骤可以循环使用酶多次，使得本方法经济实用。
在一个连续反应系统中，其中将酶保留在反应器中时，可不需循环使用酶。将前述起始物、有机溶剂和酯化剂送入反应器中，其中所需的(-)立体异构体被酯化为所需的(-)酯化化合物，形成首次反应产物。反应器中的首次反应产物通常以与入口处送入量相似的量出料。通过使用膜，酶可以保留在反应器中，或固定在载体材料上，或用交联方式固定。
本发明方法的下一步骤，步骤(2)(b)是除去有机溶剂、过量的酯化剂和所有副产物，得到包括所需的(-)酯化的化合物和其它未转化的立体异构体的二次反应产物。这可通过蒸馏方法来进行，使有机溶剂，如正庚烷和超量的酯化剂，如乙酸乙烯酯在蒸馏塔顶部以单一气流蒸出，并循环至适当的储存罐内留作以后再用。
本发明方法的下一步骤，步骤(2)(c)是从二次反应产物中分离所需的(-)酯化化合物，留下含未转化的立体异构体的第三次反应产物。这种分离可用蒸馏方法进行。
当所需的(-)酯化化合物中无异丙基时，在此阶段，或在以下所述的酯基水解阶段之后，所述的基团可通过还原方法转化为异丙基。这样可生成酯的所需的立体异构体，或在水解后产生所需的薄荷醇立体异构体。
下一步骤，本发明的方法步骤(3)是使第三次反应产物中的或在步骤(1)后得到的未转化的立体异构体外消旋化，得到含全部8个立体异构体混合物的第四次反应产物，并循环本方法的分离步骤。
外消旋化可在催化剂存在下，有氢气或无氢气存在下、有溶剂或无溶剂存在下，在常压或加压下进行。
此步骤可在有溶剂或无溶剂存在下进行。如用溶剂，可用任何常规用于催化氢化的溶剂，最典型的溶剂是用烃或苛性碱水溶液。
所用催化剂可以是任何通常用于均相催化氢化的催化剂，如Pd(OAc)2和Ru(PPh3)3Cl2，或用于不均相催化氢化的催化剂，如载体钯、铂、铑、钌、镊、海绵镊和2CuO.Cr2O3，或一种固体氧化物，如硅藻土、CuO、CrO3、CoO、SlO2、Al2O3、Ba(OH)2、MnO、Al(iOPr)3、LnO2、ZrO和沸石。优选的催化剂是镊催化剂。
反应可在80℃～300℃之间任何温度进行，优选的反应温度是180℃～220℃。
氢气压力可以是低于50巴的任何氢气压，优选压力为5～35巴(5和35巴包括在内)。
催化剂的装入量是0.01～20％，优选装入量是0.05～5％。
在此步骤结束时，将催化剂除去或使其去活性，并除去任何存在的溶剂。
下一步骤，本发明方法的步骤(4)是水解所需的(-)酯化化合物，成为所需的(-)立体异构体。反应可在碱存在下进行，碱可以是低级脂肪醇的盐，如甲醇钠或乙醇钠，可以是一种金属氢氧化物，如KOH、NaOH或Mg(OH)2，或者是胺类碱，如NH4OH。
反应可在常规用于水解的溶剂中进行，如低级脂肪醇或水。可以用混合溶剂进行。
反应温度可以是所选溶剂的沸点以下的任何温度或是在进行反应的压力下混合物的回流温度。
作为最终步骤，所需的(-)立体异构体可纯化到所需的纯度，如可用蒸馏或结晶的方法。
如上所示，起始物应包括(a)40～100m/m％的(-)-薄荷醇和(+)-薄荷醇混合物；(b)小于等于30m/m％的(-)-异薄荷醇和(+)-异薄荷醇混合物；(c)小于等于20m/m％的(-)-新薄荷醇和(+)-新薄荷醇混合物；(d)小于等于10m/m％的(-)-新异薄荷醇和(+)-新异薄荷醇混合物；或一种等同的(±)混合物，其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代。
应注意，在(+)和(-)异构体混合物中，(+)和(-)异构体不需等量存在。换言之，例如在40～100m/m％的(-)-薄荷醇和(+)-薄荷醇混合物中，(-)-薄荷醇和(+)-薄荷醇不需等量存在。
优选的起始物成分是(a)约80m/m％的(-)-薄荷醇和(+)-薄荷醇混合物；(b)约10m/m％的(-)-异薄荷醇和(+)-异薄荷醇混合物；(c)约6m/m％的(-)-新薄荷醇和(+)-新薄荷醇混合物；(d)约4m/m％的(-)-新异薄荷醇和(+)-新异薄荷醇混合物；或一种等同的(±)混合物，其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代。
得到起始物的方法如，步骤(1)，即一种蒸馏步骤，从(±)薄荷醇混合物或其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代的等同物中，分出至少一部分异薄荷醇、新薄荷醇和新异薄荷醇，或其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代的等同物的混合物中的一种或多种。
在150毫巴压力下，用蒸馏方法可从薄荷醇和异薄荷醇中分离出新薄荷醇和新异薄荷醇，再沸器和回流蒸汽的典型温度是150℃和120℃。底部蒸汽主要包括薄荷醇和异薄荷醇，或可直接送去进行分离，或在相似条件下进一步蒸馏，使其在分离前薄荷醇含量提高。实验工作为从(±)薄荷醇等中分离(-)薄荷醇而用本发明的方法进行的相应的各种实验，结果如下。实施例1从Amano Pharmaceutical Company(Japan)得到Lyophilised AmanoAK(假单胞菌荧光脂肪酶)。将底物浓度为5、10、20和40％(m/v)的(±)-薄荷醇分别加入玻璃反应容器中。乙酸乙烯酯以与(-)-薄荷醇2∶1摩尔比加入。加入庚烷作为溶剂至反应物体积为5ml。将反应容器置于50℃硅油浴中温热，并在搅拌加热板(stirring hot plate)上搅拌。除另有说明，每批时间为24小时。然后将反应混合物离心，以从酶中分离出产物。用GC(气相色谱)分析上清液(％ m/m分析)。在上述所用浓度的薄荷醇中，100％、86％、84％和78％的(-)-薄荷醇被分别转化为(-)-乙酸酯。将酶用庚烷冲洗后再循环使用，每次循环后，加入新的底物((±)-薄荷醇，乙酸乙烯酯和庚烷)。
可以看出，使用Amano AK酶，使(±)-薄荷醇很好地转化为所需的(-)-薄荷醇立体异构体。
每个反应在“Multireactors”反应器中进行，总量为15g～20g。典型的实验程序是将庚烷(10.52g)、合成(-)-薄荷醇(ex Aldrich，4.49g)和乙酸乙烯酯(2.65mL)加入反应器中。当温度达到约25℃时，加入酶(首次循环游离Amano AK，337.5mg)，然后在搅拌下将反应器加热至40℃。8小时和24小时后取样，用GC进行定性分析，得到转化数据。在用(+)-薄荷醇混合物情况下，样品分析采用手性GC方法，测定超量的光学异构体。
转化率及超量(ee)的光学异构体汇总如下
实施例9在35℃，用42.6％ m/v(+)-薄荷醇(2.3M)、乙酸乙烯酯(以乙酸乙烯酯与(-)-薄荷醇1∶1的摩尔比)和Amano AK酶进行分批反应(330mL)，用庚烷作为溶剂。23小时后，从反应物中滤出样品，用GC做气相色谱(％m/m测定)，并进行手性分析。结果显示转化率为25％，形成的超量(-)-乙酸酯为96.3％。
权利要求
1.一种分离所需的(-)立体异构体的方法，该(-)立体异构体选自(-)-薄荷醇或一种其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代的等同的(-)化合物，所用的起始物包括(a)40～100m/m％的(-)-薄荷醇和(+)-薄荷醇混合物；(b)小于等于30m/m％的(-)-异薄荷醇和(+)-异薄荷醇混合物；(c)小于等于20m/m％的(-)-新薄荷醇和(+)-新薄荷醇混合物；(d)小于等于10m/m％的(-)-新异薄荷醇和(+)-新异薄荷醇混合物，或一种其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代的等同的(±)混合物，包括以下步骤(1)将起始物与酯化剂及一种立体定向酶反应，该立体定向酶是一种假单胞菌脂肪酶，该酶可立体选择性地酯化所需(-)立体异构体的羟基，经足够时间，将所需的(-)立体异构体按所需的百分比例转化为所需的(-)酯化化合物，其中，羟基被转化为基团-O-C(O)-R4，其中R4是烷基或芳基或氢，得到首次反应产物，该首次反应产物中包括所需的(-)酯化化合物、有机溶剂、未转化的立体异构体、过量的酯化剂和反应副产物；和(2)从首次反应产物中分离所需的(-)酯化化合物。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)包括以下分步骤(2)(a)从酶中分离首次反应产物；(2)(b)除去有机溶剂、过量的酯化剂及反应副产物，得到二次反应产物；及(2)(c)从二次反应产物中分离所需的(-)酯化化合物，得到含未转化的立体异构体的第三次反应产物。
3.根据权利要求1或2的方法，在步骤(1)之前，包括以下步骤(1)将式III化合物8个立体异构体的外消旋混合物进行蒸馏步骤， 其中R1代表异丙醇基、异丙基或异丙烯基，从薄荷醇或其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代的其等同物(±)混合物中，分离出至少一部分包括有异薄荷醇、新薄荷醇和新异薄荷醇或其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代的它们的等同物(±)混合物中的一种或多种物质，得到步骤(1)起始物。
4.根据权利要求3的方法，在步骤(2)之后包括以下步骤(3)将任何未转化的所需的(-)立体异构体、第三次反应产物中其它未转化的立体异构体和步骤(1)中所得的式III化合物的六个其它立体异构体外消旋化，得到含接近热力学平衡的8个立体异构体的混合物的第四次反应产物，并将此第四次反应产物循环到步骤(1)。
5.根据权利要求4的方法，在步骤(3)之后包括以下步骤(4)水解所需的(-)酯化的化合物，得到所需的(-)立体异构体。
6.根据权利要求5的方法，其中当所需的(-)立体异构体或所需的(-)酯化的化合物有一个异丙醇基或异丙烯基时，在步骤(4)之前或之后，对该所需的(-)酯化化合物或所需的(-)立体异构体进行一个还原步骤，以转化该异丙醇或异丙烯基成为异丙基。
7.根据权利要求1～6中任一权利要求所述的方法，其中步骤(1)的起始物包括(a)约80m/m％的(-)-薄荷醇和(+)-薄荷醇混合物；(b)约10m/m％的(-)-异薄荷醇和(+)-异薄荷醇混合物；(c)约6m/m％的(-)-新薄荷醇和(+)-新薄荷醇混合物；(d)约4m/m％的(-)-新异薄荷醇和(+)-新异薄荷醇混合物；或一种其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代的等同物(±)混合物。
8.根据权利要求1～7中任一权利要求所述的方法，其中步骤(1)的酶是Amano AK脂肪酶。
9.根据权利要求1～8中任一权利要求所述的方法，其中步骤(1)是用适当的有机溶剂进行的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(1)所用溶剂选自叔丁基甲基醚、环已烷、己烷、庚烷和异辛烷。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(1)所用溶剂是正庚烷。
12.根据权利要求1～11中任一权利要求所述的方法，其中步骤(1)所用的酯化剂选自乙酸乙烯酯、乙酸丁酯、辛酸、乙酸异丙烯酯、丁酸乙烯酯、乳酸乙酯和乙酸乙酯。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(1)所用的酯化剂是乙酸乙烯酯。
全文摘要
一种分离所需的(－)立体异构体的方法，该(－)立体异构体选自(－)－薄荷醇或一种其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代的等同(－)化合物，所用的起始物包括40～100m/m％的(－)－薄荷醇和(+)－薄荷醇混合物；小于等于30m/m％的(－)－异薄荷醇和(+)－异薄荷醇混合物；小于等于20m/m％的(－)－新薄荷醇和(+)－新薄荷醇混合物；小于等于10m/m％的(－)－新异薄荷醇和(+)－新异薄荷醇混合物，或一种其中异丙基被异丙醇或异丙烯基取代的相当的(±)混合物，包括以下步骤将起始物与酯化剂及一种立体定向酶反应，该立体定向酶是一种假单胞菌脂肪酶，该酶可立体选择性地酯化所需(－)立体异构体的羟基，经足够时间，将所需的(－)立体异构体按所需的百分比例转化为所需的(－)酯化化合物(羟基转化为基团－O－C(O)－R
文档编号C12P41/00GK1471584SQ01817941
公开日2004年1月28日 申请日期2001年11月1日 优先权日2000年11月2日
发明者珍妮弗·安·查普林, 尼尔·斯托肯斯特罗姆·加德纳, 罗宾·库马·米特拉, 克利斯托弗·约翰·帕金森, 马德里埃·波特韦格, 布塔纳·安德鲁·姆伯尼斯瓦, 梅拉尼·戴瑞尔·伊万斯－迪克森, 迪恩·布拉迪, 斯特凡妮斯·弗朗索瓦·马雷, 沙瓦尼·雷迪, 安德鲁 姆伯尼斯瓦, 戴瑞尔 伊万斯-迪克森, 雷迪, 埃 波特韦格, 妮斯 弗朗索瓦 马雷, 布拉迪, 库马 米特拉, 托弗 约翰 帕金森, 斯托肯斯特罗姆 加德纳, 珍妮弗 安 查普林 申请人:Csir