专利名称：一种双壳贝类线粒体coi基因扩增引物的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种贝类线粒体细胞色素c氧化酶亚基I (cytochrome c oxidase subimit I ；COI)基因序列扩增引物的筛选方法，特别是涉及一种双壳贝类线粒体COI基因序列扩增引物的筛选方法。
背景技术：
双壳纲(Biavalvia)贝类隶属于软体动物(Mollusca)，是一种在世界范围内均有分布，数量仅次于腹足类，经济种类多，具有很高商业价值的的贝类类群。双壳贝类包含牡蛎，扇贝，蛤蜊，蚶，珠母贝等在水产养殖及捕捞上具有重要价值的种类。然而双壳贝类很多种类形态可塑性很大，近源种之间形态差异细微，故相当大一部分双壳贝类种间关系一直存在争议，国内外学者始终没有统一的看法。例如菲律宾蛤仔R. . philippinarum由于贝壳形态、壳表颜色、壳表花纹等变化很大，早期分类学家将其定为dentivulata、indica, violascens> japoniaca> semidecussata> bifurcata 禾口 philippinarum 等 7 ^^禾中。胃￠15 内，菲律宾蛤仔往往被定名为与其形态相近的姊妹种杂色蛤仔(Ruditapes variegata)。由于双壳贝类作为分类依据的形状不稳定，明确的量化特征少，基于形态的分类很不可靠，所以开发一种能够快速可靠的分类工具对于渔业管理和水产养殖等具有重要意义。近年来，利用DNA序列对物种进行分类鉴定已成为一种高效的方法，其中线粒体 COI基因由于具有突变速率适中，单亲遗传等特点成为物种鉴定的理想基因。此基因片段已在许多生物类群特别是动物界的分类及进化研究中得到了成功的应用。并且，COI基因已成为鉴定物种和发现新种的新兴技术一DNA条形码(DNA barcoding)技术在动物类群中的标准基因。因此，COI基因对比分析是双壳贝类物种的快速鉴定最为理想的手段。然而贝类COI序列的变异速率明显高于动物的其他类群，软体动物不同物种，即使是近源种甚至种内不同群体之间的COI序列变异都很大，这就导致了 R)lmer等人于1994 年设计的COI通用引物LC01490和HC02198在这一动物类群中的扩增效率极低下。缺少扩增效率高的引物已经严重阻碍了这种分子标记应用于双壳贝类的分子鉴定研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种双壳贝类线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，它能满足现有技术的上述需求。一种双壳贝类线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是a、登陆美国国立生物技术信息中心，下载双壳贝类的线粒体全序列；b、将下载的序列用BioEdit软件比对分析，确定序列两端保守区域；c、在确定的保守区域用引物设计软件ft~imer Premier 5设计多对引物并合成；d、提取双壳贝类DNA，然后将合成的引物在相应反应体系下进行PCR扩增；e、进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出扩增效率高的一组步移鸡尾引物，此组步移鸡尾引物由三条正向引物和三条反向引物组成，其正向引物为BZ-I :TGT AAA ACG ACG GCC NAM NWM HCA YWff RGA YRT、BZ_2 :TGT AM ACG ACG GCC AGT TTC MCA TM RGA YGT HG 禾口 BZ-3 TGT AAA ACG ACG GCC AGM NWT HCA Yffff RGA YRT HGG DAS，反向引物为 ZF-1 :CAG GAA ACA GCT ATG ACY TCff GGR TGN CCA MR MY CA、BF_2 :CAG GM ACA GCT ATG ACY TCff GGR TGN CCR AAR AA 禾P BF-3 :CAG GAA ACA GCT ATH ACY TCD GGR TGN CCR AA0本发明根据包括双壳贝类在内的贝类物种COI序列变异度高和COI通用扩增引物在此动物类群中扩增效率低的特性，通过反复试验筛选出双壳贝类COI基因的特异性扩增引物。采用本发明的双壳贝类线粒体COI基因扩增引物，可以有效的扩增出双壳贝类不同物种的COI序列，对基于COI序列的双壳贝类物种分类鉴定和质资源保护、养殖业发展及渔业资源管理等都具有极其重要的意义。
具体实施例方式本发明的双壳贝类线粒体COI基因扩增引物的筛选方法采用以下步骤a、登陆美国国立生物技术信息中心，下载双壳贝类的线粒体全序列；b、将下载的序列用BioEdit 软件比对分析，确定序列两端保守区域；C、在确定的保守区域用引物设计软件I^rimer Premier 5设计多对引物并合成；d、提取DNA，然后分别用合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应；e、进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出扩增效率高的一组步移鸡尾引物 (step-moving cocktail primer)，此组步移鸡尾引物由三条正向引物和三条反向引物组成，其正向引物为 BZ-I TGT AAA ACG ACG GCC NAM NWM HCA Yffff RGA YRT、BZ-2 :TGT AAA ACG ACG GCC AGT TTC MCA TAA RGA YGT HG 禾口 BZ-3 :TGT AAA ACG ACG GCC AGM NWT HCA Yffff RGA YRT HGG DAS，反向引物为 ZF-1 :CAG GAA ACA GCT ATG ACY TCff GGR TGN CCA AAR AAY CA、BF-2 :CAG GAA ACA GCT ATG ACY TCff GGR TGN CCR AAR AA 禾口 BF-3 :CAG GAA ACA GCT ATH ACY TCD GGR TGN CCR AA。下面结合实施例对本发明作进一步说明1.样品采集于2003年至2010年从中国南北沿海共采集2 种双壳贝类个体观7 个。2.线粒体全序列下载登陆美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)，下载Genbank已有的；34条双壳贝类线粒体全序列。3.确定COI序列保守序列用序列处理软件BioEdit (http://www.mbio. ncsu. edu/BioEdit/bioedit. html)对上述序列进行多重比对分析，确定出COI 5，端较保守的区域。4.弓 Li殳if 弓 Li殳Premier 5 (http //www. premierbiosoft. com/primerdesign/index. html)在保守区域设计引物，设计引物时保证扩增目标片段不小于500bp，并尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现。设计出的6组引物由上海生工生物技术有限公司合成。5. DNA提取用苯酚氯仿法对所采集的全部样品进行DNA提取。6.PCR扩增在10μ 1 PCR反应体系中用合成的6组引物分别对这287个双壳贝类样品进行PCR扩增，该体系包括IOOng模板DNA，0. 25U Taq聚合酶(Takara)，1 XPCR缓冲液，0. 2mM dNTPs，1.5mMMgcl2，引物各 1 μ Μ。PCR 扩增条件为94°C 预变性 3min，94°C变性lmin，42-56°C退火Imin (不同引物组退火温度不同)，72°C延伸lmin，共35个循环，最后 72°C 延伸 5min。7.引物筛选产物用质量百分浓度为-1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出扩增效率最高的一组引物，该组引物为步移鸡尾引物(正向引物ΒΖ-1、ΒΖ-2和BZ-3，反向引物BF-l、BF-2和BF-3)，其扩增的产物片段长度为658bp，239个个体具明亮条带。其扩增效率约为83%，远大于R)lmer等人设计的COI通用扩增引物在双壳贝类中的扩增效率 (60%左右)。用 ABI PRISM 3130 测序仪(Applied Biosystems)双向测序。序列用 BioEdit 软件拼接后，与NCBI上下载的双壳贝类COI序列进行多重比对分析，确定所得序列为目的片段，即双壳贝类线粒体COI基因序列片段。
权利要求
1.一种双壳贝类线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是a、登陆美国国立生物技术信息中心，下载双壳贝类的线粒体全序列；b、将下载的序列用BioEdit软件比对分析， 确定序列两端保守区域；c、在确定的保守区域用引物设计软件ft~imer Premier 5设计多对引物并合成；d、提取双壳贝类DNA，然后将合成的引物在相应反应体系下进行PCR扩增； e、进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出扩增效率高的一组步移鸡尾引物，此组步移鸡尾引物由三条正向引物和三条反向引物组成，其正向引物为BZ-I =TGT AAA ACG ACG GCC NAM NWM HCA Yffff RGA YRT、BZ-2 :TGT AAA ACG ACG GCC AGT TTC MCA TAA RGA YGT HG 禾口 BZ-3 :TGT AM ACG ACG GCC AGM NWT HCA Yffff RGA YRT HGG DAS，反向引物为 ZF-1 :CAG GM ACA GCT ATG ACY TCff GGR TGN CCA MR MY CA、BF_2 :CAG GM ACA GCT ATG ACY TCff GGR TGN CCR AAR AA 禾P BF-3 :CAG GAA ACA GCT ATH ACY TCD GGR TGN CCR AA0
2.如权利要求1所述的双壳贝类线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是所述的双壳贝类的线粒体全序列为34条，下载于美国国立生物技术信息中心。
3.如权利要求1所述的双壳线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是所述的双壳贝类样品为2003年至2010年从中国南北沿海采集的2 种双壳贝类个体287个。
4.如权利要求1所述的双壳贝类线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是所述的反应条件体系为IOOng模板DNA，0. 25U Taq聚合酶，1 XPCR缓冲液，0. 2mM dNTPs, 1. 5mM Mgcl2,引物各 1 μ Μ。
5.如权利要求1所述的双壳贝类线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是所述的PCR扩增条件为941预变性；31^11，941变性lmin，42_56°C退火lmin，72°C延伸lmin，共 ；35个循环，最后72°C延伸5min。
6.如权利要求1所述的双壳贝类线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是所述的琼脂糖凝胶电泳检测所用的琼脂糖质量百分浓度为-1. 5%。
全文摘要
一种双壳贝类线粒体COI基因序列扩增引物的筛选方法，其特征是a、登陆美国国立生物技术信息中心，下载双壳贝类的线粒体全序列；b、将下载的序列用BioEdit比对分析，确定其保守区域；c、在保守区域内用Primer Premier 5设计多对引物并合成；d、提取双壳贝类DNA，将合成的引物在相应反应体系下进行PCR扩增；e、进行电泳检测，筛选出扩增效率高的一组步移鸡尾引物，此组步移鸡尾引物由三条正向引物和三条反向引物组成。采用本发明的双壳贝类线粒体COI引物，可以有效的扩增出双壳贝类不同物种的目的片段，对基于COI序列的双壳贝类物种分类鉴定和质资源保护、养殖业发展及渔业资源管理等都具有极其重要的意义。
文档编号C12N15/10GK102199597SQ20111006359
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者孔令锋, 李琪, 陈军 申请人:中国海洋大学