专利名称：德国小蠊kdr突变等位基因检测试剂盒及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种德国小蠊kdr突变等位基因检测试剂盒及其专用引物。
背景技术：
德国小蠊(Blattella germanica)是常见的室内害虫之一，能够携带细菌、病毒、 寄生虫卵等，导致多种疾病的传播，同时德国小蠊分泌物或死亡虫体能导致机体过敏。化学防制因实施方便、见效较快而得到广泛应用。在各类化学杀虫剂中，拟除虫菊酯因具有高效、快速、低潴留及低毒等优点而被广泛用于农业害虫和卫生害虫的防制，但不久就发现多种昆虫对这类杀虫剂产生了抗性。德国小蠊由于广泛使用相对单一的化学药物防制，用药频繁，生活世代又较短，其抗药性问题日渐突出，引起广泛关注。研究表明德国小蠊对氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯等均产生了不同程度抗性。抗性的产生严重地影响到媒介德国小蠊的防治。而抗性检测和监测是预防抗性发生和发展的前提，是抗性治理工作的基础。目前，蚊类抗药性的检测方法，一直沿用1970世界卫生组织推荐的生物测定法， 测出害虫对药剂的敏感毒力(LD-p)基线和LD5tl或LC5tl值。再从测试地区采集同种害虫种群，采用与测定敏感品系相同的生测方法和控制条件，得出待测种群的LD-p线和LD5tl或 LC50 {t,以待测种群与敏感种品系的LD5tl或LC5tl值之间的比值(即抗性倍数)来表示抗性水平。但该方法对所获得资料有严格的统计要求，必须严格控制试验条件，需反复多次试验， 而且在实践中亦显示出较明显的局限性。传统的生物测定法比较繁琐，从虫源、饲养到测定难于做到真正的标准化，而且由LD-p线求出的LD5tl或LC5tl值的重复性和精确性较低，当群体抗性较低和抗性种群多样时很难准确测定，因此测得的抗性水平往往具有滞后性，不适合早期抗性检测，不利于制定相应的防治对策。鉴于目前许多抗性对策依赖于抗性的早期检测，因此抗性监测与检测技术的研究尤显重要。随着抗性监测和检测目的的多元化，抗性监测手段和方法也朝着多元化方向发展。害虫抗药性分子检测技术是基于对害虫抗药性机制了解的基础上建立起来的，即利用分子生物学技术检测杀虫剂作用靶标的抗性位点或解毒代谢酶基因的增强表达。基于可操作性、实用性和经济等方面的原因，目前几乎所有的抗性检测研究都集中于靶标抗性方面，即检测靶标基因的突变。对德国小蠊抗性机理的研究表明，电压控制的钠离子通道是拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶点，钠离子通道的神经敏感性降低而引起的抗性，称为击倒抗性 (knockdownresistance, kdr)，德国小蠊钠离子通道 II S4-II S6 结构域的 L993F(第 993 氨基酸Leu —(突变为)？&，第四79核苷酸G—(突变为)C)突变是导致kdr机制的分子基础。Kdr型抗性机理的分子水平的研究推动了害虫药性的分子生物学检测技术的发展。 kdr基因特异性等位基因聚合酶链反应(PASA)技术就是其中一种比较简单易行和准确的方法。分别在一端设计两条野生型或突变型引物，突变型引物的突变碱基设计在引物的3 ‘ 端，另一端设计一条共同引物。利用Taq酶缺乏3' v5'外切酶活性的特点，在以突变型引物扩增正常DNA模板时，在其3'端就形成了错配，延伸反应就会因磷酸酯键难于形成而不能进行，也就得不到特异长度的条带，从而表明模板DNA无此突变；如果PCR结果能得到特异长度扩增条带，表明模板DNA上具有与引物3'碱基相对应的突变。若将野生型和突变型引物分别用于同一 DNA模板的扩增，即可根据扩增片段的凝胶电泳直接诊断出有无某种基因突变。与限制性内切酶片段长度多态性分析技术(RFLP)和单链构型多态性分析技术 (SSCP)等其它分子生物学检测方法相比，PASA技术省去了任何形式的DNA探针分子杂交或限制性内切酶酶切，也不需要标记引物。与传统的生物测定相比，PASA技术能区分表现型相同而基因型不同的杂合子和敏感纯合子，因而能检测很低的抗性基因频率，为抗性早期治理提供理论指导。但是，目前还没有成型的针对德国小蠊的kdr突变等位基因检测方法和试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测德国小蠊中kdr基因突变位点的引物。本发明提供的引物，由引物组A和引物组B组成所述引物组A包括引物2和引物3，所述引物2和所述引物3的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物组B包括引物2和引物4，所述引物2和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列4。所述引物组A还包括引物1，所述引物组B还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1。所述引物组A和所述引物组B为独立包装；所述引物组A中所述引物1、引物2和引物3的质量比为(3-5) (5-7) (8-10), 所述引物组A中所述引物1、引物2和引物3的质量比具体为3 7 10 ；所述引物组B中所述引物1、引物2和引物4的质量比为(3-5) (5-7) (8-10), 所述引物组B中所述引物1、引物2和引物4的质量比具体为3 7 10 ；所述突变位点为L993F。本发明的第二个目的是提供一种制备检测德国小蠊中kdr基因突变位点的PCR试剂。本发明提供的试剂，由试剂A和试剂B组成；所述试剂A由所述引物组A和PCR缓冲液组成；所述试剂B由所述引物组B和PCR缓冲液组成；所述各引物组中各引物在对应的所述PCR试剂中的浓度均为所述引物1的终浓度为0. 12-0. 2uM,所述引物1的终浓度具体为0. 12uM ；所述引物2的终浓度为0. 28-0. 2uM, 所述引物2的终浓度具体为0. 28uM ；所述引物3、4终浓度均为0. 32-0. 4uM，所述引物3、引物4的终浓度均具体为0. 4uM。所述突变位点为L993F。PCR缓冲液为试剂T，购自宝生物工程有限公司，产品号DR011。
本发明的第三个目的是提供一种制备检测德国小蠊中kdr基因突变位点的试剂的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)分别将所述的引物中的所述引物组A和所述引物组B进行独立包装，得到独立包装引物组A和独立包装引物组B ；2)再将步骤1)得到的独立包装引物组A和步骤1)得到的独立包装引物组B进行包装，得到试剂；所述突变位点为L993F。由所述方法制备得到的试剂也是本发明保护的范围。本发明的第四个目的是提供一种检测德国小蠊中kdr基因突变位点的试剂盒。本发明提供的试剂盒，为如下1)或2)1)所示的试剂盒由试剂盒A和试剂盒B组成；所述试剂盒A为含有所述PCR试剂中的试剂A的试剂盒；所述试剂盒B为含有所述PCR试剂中的试剂B的试剂盒；2)所示的试剂盒为含有所述的试剂的试剂盒；所述突变位点为L993F。所述引物或所述试剂或所述试剂盒在检测德国小蠊中kdr基因突变位点、检测德国小蠊抗药性或制备检测德国小蠊抗药性产品中的应用；所述突变位点为L993F，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、Es-生物丙烯菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。本发明的第五个目的是提供一种检测待测德国小蠊中kdr基因突变位点的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用所述的引物或所述试剂或所述试剂盒中的所述引物组A中的所述引物2和所述引物3作为引物对A和用所述引物组B中的所述引物2、所述引物4作为引物对B分别对待测德国小蠊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测各组引物扩增得到的产物，若所述引物对B扩增得到大小为139bp产物2，则所述待测德国小蠊的kdr基因的突变位点为L993F ；所述139bp产物2的核苷酸序列为序列表中的序列8。本发明的第六个目的是提供一种检测待测德国小蠊中kdr基因型的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用所述的引物或所述试剂或所述试剂盒中的所述引物组A中的所述引物2和所述引物3作为引物对A和用所述引物组B中的所述引物2、所述引物4作为引物对B分别对待测德国小镰进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测各组引物扩增得到的产物，若所述引物对B扩增得到大小为139bp产物2，且所述引物对A未扩增得到大小为 139bp产物1，则所述待测德国小镰的kdr基因为含有突变位点L993F的纯合型基因；若所述引物对B扩增得到大小为139bp产物2，且所述引物对A扩增得到大小为 139bp产物1，则所述待测德国小镰的kdr基因为含有突变位点L993F的杂合型基因；若所述引物对B未扩增得到大小为139bp产物2，且所述引物对A扩增得到大小为 139bp产物1，则所述待测德国小镰的kdr基因为不含突变位点L993F的纯合型基因；
所述139bp产物1的核苷酸序列为序列表中的序列7所述139bp产物2的核苷酸序列为序列表中的序列8 ；所述PCR扩增中，以待测德国小镰的基因组DNA为模板；所述PCR扩增的退火温度为62-65°C，所述PCR扩增的退火温度具体为65°C ；所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。以上PCR扩增中，所述引物组A或B中的引物1和引物2进行PCR扩增，得到扩增大小为275bp产物；所述275bp产物的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；该产物可以用来检测PCR反应体系是否正确，如果有275bp产物，说明该体系正确。本发明的实验证明，本发明提供的了一种快捷、简便、灵敏的德国小蠊kdr突变等位基因检测试剂盒，用来掌握德国小蠊与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的kdr等位基因的状况。本发明的kdr突变等位基因检测试剂盒针对德国小蠊kdr等位基因的基因型，分别设计了 2组特异性引物，经过一定的配比合成，可以检测德国小蠊的kdr基因型。采用本发明的kdr突变等位基因检测试剂盒，只需提取单只德国小蠊的DNA，因此对待测德国小蠊的数量没有特殊的要求，另外还无需德国小蠊的饲养场所和设施，也不需要投入长时间的人力物力来观察。独立1人2小时内即可完成50份样本的检验，被检样本能够准确、有效、直接地检测出点突变，能够鉴定个体基因型。判断kdr相关的基因型为研究德国小镰对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性奠定基础。
图1为特异性等位基因PCR法方法检测德国小镰Kdr基因型
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、德国小镰kdr突变等位基因检测一、PCR 扩增1、引物的设计 针对德国小蠊钠离子通道的基因序列kdr (未突变，Accession number U73583. 1)设计特异性引物CD1 5，-GATATGCCGAGATGGAACTTTACG-3，(序列 1，下游引物)CD2 5，-AATATCCCTGACCAACCTGTGAA-3，(序列 2，上游引物)CD3 5，-CCACTGTCGTCATTGGAAACTTG-3，(序列 3，下游引物)根据kdr 的突变体 kdr L993F 型突变基因(Accession number :U73584. 1)设计的特异性引物CD1 5，-GATATGCCGAGATGGAACTTTACG-3，(序列 1，下游引物)CD2 :5，-AATATCCCTGACCAACCTGTGAA-3，(序列 2，上游引物)CD4 5 ‘-CCACTGT CGT CAT TGG AAA CTT C-3，(序列 4，下游引物)2、基因组DNA获得分别提取野外捕获的编号为1-3的德国小蠊的基因组DNA，备用，得到编号为1_3的待测样本的DNA。3、待测样本的DNA的PCR扩增(扩增体系如表1)(1)分别取12uL试剂T(宝生物工程有限公司，产品号DR011，具体组成见表2)加入到2个PCR管中，标记为管A (试剂A)和管B (试剂B)。(2)在管A中加入2uL试剂P1，在管B中加入2uL试剂P2。(3)取 9uLddH20 至管 A 和管 B 中。(多个样本检测时，根据以上的配比，分A和B管将试剂混合后分装，效果更好)(4)每种待测样品的DNA分别取2uL加入到管A和管B中。(5)将以上的管A和管B盖好后，放入PCR仪中，按以下条件设置反应条件(为了使试剂混勻，稍微离心效果更好)。表1为PCR扩增体系
试剂T 试剂P CMH2O 模板(DNA)
A管 12uL 2uLP! 9uL 2uL
B管 12uL 2uL P2 9uL 2uL
Bggggga^wwwwww .................................................................................................................................................................................. 表2为T试剂的配方
mssmmsmsmsummmmmm^mxmx^mifmifmifmmmmm...................................................................布 0. 28uM
成如下
TaKaRa Taq dNTP Mixture
Taq Buffer 色素Marker
比重增加物稳定剂
所述试剂P1为针对德国小蠊未突变基因特异性引物混合物，组成如下
1.25U/25UL 2xconc.;各 0.4mM 2xconc.; 3mMMg2+ Tartrazine/Xylene Cyanol FF
CDl :5’ -GATATGCCGAGATGGAACTTTACG-3’ CD2 5' -AATATCCCTGACCAACCTGTGAA-3' CD3 5' -CCACTGTCGTCATTGGAAACTTG-3'
所有引物溶解稀释成10uM，CDl的终浓度具体为0. 12uM ；CD2的终浓度具体为 ⑶3的终浓度具体为0. 4uM。
P1 由CD1，CD2和CD3混合而成，配制体积比例为CD1 CD2 CD3 = 3 7 10 (CDl，CD2和CD3在试剂Pl中的质量比为3 7 10)。
所述试剂P2为针对德国小蠊kdr L993F型突变基因设计的特异性引物混合物，组
CDl :5’ -GATATGCCGAGATGGAACTTTACG-3’ CD2 5' -AATATCCCTGACCAACCTGTGAA-3‘
CD4 :5’ -CCACTGTCGTCATTGGAAACTTC-3’所有引物溶解稀释成10uM，引物终浓度为⑶1的终浓度具体为0. 12uM ；⑶2的终浓度具体为0. 28uM ；⑶3的终浓度具体为0. 4uM。P2 由⑶1，⑶2和⑶4混合而成，配制体积比例为⑶1 ⑶2 ⑶4 = 3 7 10(⑶1，⑶2和⑶4在试剂Pl中的质量比为 3 7 10)。。所述ddH20为灭菌蒸馏水。3、PCR扩增条件
权利要求
1.一种检测德国小蠊中kdr基因突变位点的引物，由引物组A和引物组B组成 所述引物组A包括引物2和引物3，所述引物2和所述引物3的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物组B包括引物2和引物4，所述引物2和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列4。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述引物组A还包括引物1，所述引物组B还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1。
3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于 所述引物组A和所述引物组B为独立包装；所述引物组A中所述引物1、引物2和引物3的质量比为(3-5) (5-7) (10_8)，所述引物组A中所述引物1、引物2和引物3的质量比具体为3 7 10 ；所述引物组B中所述引物1、引物2和引物4的质量比为(3-5) (5-7) (10_8)，所述引物组B中所述引物1、引物2和引物4的质量比具体为3 7 10 ； 所述突变位点为L993F。
4.一种制备检测德国小蠊中kdr基因突变位点的PCR试剂，由试剂A和试剂B组成； 所述试剂A由所述引物组A和PCR缓冲液组成；所述试剂B由所述引物组B和PCR缓冲液组成；所述各引物组中各引物在对应的所述PCR试剂中的浓度均为所述引物1的终浓度为 0. 12-0. 2uM，所述引物1的终浓度具体为0. 12uM ；所述引物2的终浓度为0. 28-0. 2uM，所述引物2的终浓度具体为0. 28uM ；所述引物3、4终浓度均为0. 32-0. 4uM，所述引物3、引物4 的终浓度均具体为0. 4uM ； 所述突变位点为L993F。
5.一种制备检测德国小蠊中kdr基因突变位点的试剂的方法，包括如下步骤1)分别将权利要求1或2所述的引物中的所述引物组A和所述引物组B进行独立包装，得到独立包装引物组A和独立包装引物组B ；2)再将步骤1)得到的独立包装引物组A和步骤1)得到的独立包装引物组B进行包装，得到试剂；所述突变位点为L993F。
6.由权利要求5所述方法制备得到的试剂。
7.—种检测德国小蠊中kdr基因突变位点的试剂盒，为如下1)或2)1)所示的试剂盒由试剂盒A和试剂盒B组成；所述试剂盒A为含有权利要求4所述PCR试剂中的试剂A的试剂盒； 所述试剂盒B为含有权利要求4所述PCR试剂中的试剂B的试剂盒；2)所示的试剂盒为含有权利要求6所述的试剂的试剂盒； 所述突变位点为L993F。
8.权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒在检测德国小蠊中kdr基因突变位点、检测德国小蠊抗药性或制备检测德国小蠊抗药性产品中的应用；所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、Es-生物丙烯菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。
9.一种检测待测德国小蠊中kdr基因突变位点的方法，包括如下步骤用权利要求1-3中任一所述的引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒中的所述引物组A中的所述引物2和所述引物3作为引物对A和用所述引物组B中的所述引物2、所述引物4作为引物对B分别对待测德国小蠊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； 检测各组引物扩增得到的产物，若所述引物对B扩增得到大小为139bp产物2，则所述待测德国小蠊的kdr基因的突变位点为L993F ；所述139bp产物2的核苷酸序列为序列表中的序列8。
10.一种检测待测德国小蠊中kdr基因型的方法，包括如下步骤用权利要求1-3中任一所述的引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒中的所述引物组A中的所述引物2和所述引物3作为引物对A和用所述引物组B中的所述引物2、所述引物4作为引物对B分别对待测德国小镰进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； 检测各组引物扩增得到的产物，若所述引物对B扩增得到大小为139bp产物2，且所述引物对A未扩增得到大小为 139bp产物1，则所述待测德国小镰的kdr基因为含有突变位点L993F的纯合型基因；若所述引物对B扩增得到大小为139bp产物2，且所述引物对A扩增得到大小为139bp 产物1，则所述待测德国小镰的kdr基因为含有突变位点L993F的杂合型基因；若所述引物对B未扩增得到大小为139bp产物2，且所述引物对A扩增得到大小为 139bp产物1，则所述待测德国小镰的kdr基因为不含突变位点L993F的纯合型基因； 所述139bp产物1的核苷酸序列为序列表中的序列6 所述139bp产物2的核苷酸序列为序列表中的序列7 ； 所述PCR扩增中，以待测德国小镰的基因组DNA为模板； 所述PCR扩增的退火温度为62-65°C，所述PCR扩增的退火温度具体为65°C ； 所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
全文摘要
本发明公开了一种德国小蠊kdr突变等位基因检测试剂盒及其专用引物。本发明提供了检测德国小蠊中kdr基因突变位点的引物，由引物组A和引物组B组成所述引物组A包括引物2和引物3组成，所述引物组B包括引物2和引物4组成；本发明的实验证明，本发明提供的了一种快捷、简便、灵敏的德国小蠊抗药性检测试剂盒，用来掌握德国小蠊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性状况。
文档编号C12N15/11GK102251040SQ20111020249
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月19日 优先权日2011年7月19日
发明者刘美德, 张映梅, 李春晓, 汪中明, 董言德, 赵彤言, 邢丹, 郭晓霞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所