cDNA的合成方法
【专利摘要】一种cDNA合成方法，其具有如下工序：吸附工序，在含有核糖核酸（RNA）的试样中混合含有离液物质的溶解液和核酸结合性固相载体，将RNA吸附于载体上；逆转录工序，将吸附于载体的RNA，在逆转录反应液中以吸附于载体的原样直接进行逆转录，合成cDNA；以及，溶出工序，将合成的cDNA溶出到溶出液中。
【专利说明】cDNA的合成方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种cDNA的合成方法。
【背景技术】
[0002]Boom等报告了使用二氧化硅粒子等核酸结合性固相载体和离液剂，从生物体材料更简便地提取核酸的方法(参照非专利文献I)。而包含Boom等方法在内的使用二氧化硅等核酸结合性固相载体和离液剂将核酸吸附在载体上而提取的方法，主要由以下3工序组成:(I)离液剂的存在下，使核酸吸附于核酸结合性固相载体的工序(吸附工序)、(2)为了除去非特异性结合的夹杂物和离液剂，通过清洗液将吸附核酸的载体清洗的工序(清洗工序)、以及(3)通过水或低盐浓度缓冲液将核酸从载体溶出的工序(溶出工序)。其中作为(2)的清洗液，溶解有离液剂且为了防止核酸从载体的溶出而一直以来使用水溶性有机溶剂，特别是以50~80%左右的比例含有乙醇的水或低盐浓度缓冲液。
[0003]但是，该水溶性有机溶剂在(3)的工序中残留时，由于在将提取液进行酶处理时阻碍酶反应，通常，在用含有乙醇的水溶液进行清洗之后，根据需要进行用100%乙醇、或者、挥发性更高的丙酮等清洗，然后，进行干燥将有机溶剂从体系中完全去除的操作。已知该干燥不仅需要时间，而且如果干燥时间不充分会导致乙醇的残留，干燥过度时，由于核酸干燥过度而固化，溶出变得困难，结果导致核酸回收量的降低、重现性降低。因此有机溶剂的使用，不仅很难估计其干燥的程度，而且由于乙醇、丙酮这样的有机溶剂具有易燃性和挥发性，特别是考虑操作的自动化时，存在起火等的危险性。
[0004]因此，开发了载体吸附核酸之后，(2)的清洗工序中，使用完全不含乙醇等有机溶剂的水或低盐浓度缓冲液清洗载体，(3)的溶出工序中，50~70°C下，通过用水或低盐浓度缓冲液将核酸溶出，提取核糖核酸(RNA)的方法(参照专利文献I)。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献I日本特开平11-146783号公开公报
[0008]非专利文献
[0009]非专利文献1J.Clin.Microb1l.，vol.28Νο.3，p.495-503 (1990)
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种能够效率良好地利用的cDNA的合成方法。
[0011]目前为止，Boom法中，将核酸吸附于载体，(2)的清洗工序中，用实际上不含乙醇等机溶剂的水或低盐浓度缓冲液清洗载体之后，(3)的溶出工序中，50~70°C下，通过用水或低盐浓度水溶液溶出核酸，将核糖核酸(RNA)分离(日本特开平11-146783号公开公报)。但是，本
【发明者】发现将用Boom法分离的RNA用于RT-PCR时，通过将吸附于载体的RNA，在不从载体游离的秦光下进行逆转录反应，从而能够将合成的cDNA直接溶出至PCR反应液中，可效率良好地进行之后的PCR反应，从而实现了本发明的完成。
[0012]本发明的一个实施方式是一种cDNA合成方法，其具有以下工序:吸附工序，在含有核糖核酸(RNA)的试样中，混合含有离液物质的溶解液和核酸结合性固相载体，将RNA吸附于所述载体上；逆转录工序，将吸附于所述载体的RNA，在逆转录反应液中在吸附于所述载体的情况下进行逆转录，合成cDNA ;溶出工序，将合成的所述cDNA溶出至溶出液中。可以在逆转录工序之前或之后进一步具有将吸附上述RNA的所述载体用不含有机溶剂的清洗液清洗的工序。上述逆转录反应液可以含有逆转录酶、dNTP、逆转录用引物。上述溶出液可以含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA扩增用引物。上述逆转录反应液和/或溶出液可以含有BSA。此外，上述逆转录工序中，优选在小于50°C的条件下将上述RNA逆转录。上述载体优选为磁性粒子。
[0013]本发明的另一实施方式是一种cDNA合成试剂盒，其含有:含4~7M的胍盐、O~5%的非离子性表面活性剂、O~0.2M的还原剂的中性溶解液，核酸结合性固相载体；含4~7M的胍盐、O~5%的非离子性表面活性剂的第I清洗液；由水或低盐浓度水溶液组成的第2清洗液；含有逆转录酶、dNTP以及逆转录用引物的逆转录反应液；含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA扩增用引物的DNA扩增液。
[0014]通过本发明，能够提供一种能够效率良好地利用的cDNA的合成方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是表示使用本发明的一个实施例中通过在载体上进行逆转录反应而合成的cDNA进行PCR反应的结果的图。
[0016]图2是表示本发明的一实施例中在载体上进行逆转录反应之后，省略清洗工序进行PCR反应的结果的图。
【具体实施方式】
[0017]实施方式和实施例没有特别说明的情况下，使用M.R.Green &J.Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual(4th edit1n), ColdSpring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012) ;F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, K.Struhl (Ed.), Current Protocols inMolecular B1logy, John Wiley & Sons Ltd.等的标准的实验指南集记载的方法或者将其修饰、改变的方法。此外，使用市售的试剂盒、测定装置时，没有特别说明的情况下，使用这些中所附的实验指南。
[0018]应予说明，通过本说明书的记载，本领域技术人员可明确本发明的目的、特征、优点及其构思，本领域技术人员从本说明书的记载容易将本发明再现。以下记载的发明的实施方式以及具体的实施例等，示出的是本发明的优选的实施方式，是为了例示或说明而示出的内容，本发明不受这些内容的限定。在本说明书公开的本发明的意图以及该范围内，基于本说明书的记载，可以做出各种改变及修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0019]cDNA合成用试剂
[0020]本发明中上述的cDNA合成方法具有以下工序:在含有RNA的试样中，混合含有离液物质的溶解液和核酸结合性固相载体，将RNA吸附于载体的吸附工序；将吸附于载体的RNA，在逆转录反应液中在吸附于载体的情况下进行逆转录，合成cDNA的逆转录工序；将合成的cDNA溶出至溶出液中的溶出工序。可以在逆转录工序之前进一步含有将吸附上述RNA的上述载体用清洗液清洗的工序。
[0021]提取RNA的试样，含有RNA则没有特别限制，可以是细胞，组织等的细胞块等的生物体试样、病毒、合成RNA、在临时分离的RNA中混入有杂质、夹杂物的试样等。
[0022]离液物质在水溶液中生成离液离子(离子半径大的I价阴离子)，具有增加疏水性分子的水溶性的作用，只要是对RNA向固相载体的吸附有作用的物质就没有特别限制。具体的可举出硫氰酸胍盐、胍盐酸盐、碘化钠、碘化钾、过氯酸钠等，这些物质中，优选蛋白质变性作用强的硫氰酸胍盐或胍盐酸盐。这些离液物质的使用浓度没有特别限制，因各物质而不同，例如，使用硫氰酸胍盐时，在3~5.5M的范围内，使用胍盐酸盐时，优选在5M以上使用。
[0023]溶解液含有这样的离液物质即可，没有特别限制，可以含有以细胞膜的破坏或者使细胞中含有的蛋白质变性为目的的表面活性剂。作为该表面活性剂，是通常用于从细胞等提取核酸的表面活性剂即可，没有特别限制，具体的可举出Triton-X等TRITON系表面活性剂、Tween20等Tween系表面活性剂这样的非离子性表面活性剂、N-月桂酰基肌氨酸钠(SDS)等阴离子性表面活性剂，特优选非离子性表面活性剂在0.1~2%的范围进行使用。进而，溶解液中优选含有2-巯基乙醇或者二硫苏糖醇等还原剂。溶解液可以是缓冲液，优选是pH6~8的中性。考虑这些情况，具体优选含有4~7M的胍盐、O~5%的非离子性表面活性剂、O~0.2M的还原剂等。
[0024]核酸结合性固相载体是具有在离液离子的存在下能够将核酸吸附即通过可逆的物理结合进行保持的亲水性表面的固体即可，没有特别限制。具体的，优选含有二氧化硅的物质，例如，二氧化硅 、玻璃、硅藻土或者将这些物质通过化学修饰实施表面处理的物质，更优选与磁性材料、超顺磁性金属氧化物等的复合物。通过化学修饰实施表面处理时，在不妨碍与核酸可逆性结合的范围可以带有适度的阳电荷。
[0025]此外，作为这些核酸结合性固相载体的形态，具体可举出粒子、过滤器、袋、盘、反应容器等，没有特别限制。这些形态中，考虑到吸附和溶出的效率，更优选粒子形态。此时的粒径没有特别的限制，可以是0.05~500 μ m，优选I~100 μ m，特别优选I~10 μ m。
[0026]清洗液优选实际上不含有乙醇、异丙醇等有机溶剂和离液物质的清洗液。该清洗液优选为水或低盐浓度水溶液，在低盐浓度水溶液的情况下，优选为缓冲液。低盐浓度水溶液的盐浓度，优选为10mM以下，更优选为50mM以下，最优选为15mM以下。此外，低盐浓度水溶液的下限没有特别限制，优选为0.1mM以上，进一步优选为ImM以上，最优选为1mM以上。此外，该溶液可以含有TritoruTweeruSDS等表面活性剂，pH没有特别限制。用于制备缓冲液的盐没有特别限制，优选使用Tris、Hepes、Pipes、磷酸等的盐。
[0027]进行多次清洗时，可以使用相同成分的清洗液，也可以使用不同成分的清洗液。例如，作为溶解后立即使用的清洗液，可以使用含有胍盐的溶液，该清洗液，特别优选含有4~7M的胍盐、O~5%的非离子性表面活性剂。
[0028]逆转录反应液含有逆转录酶、dNTP以及逆转录酶用引物(寡核苷酸)即可，没有特别限制。逆转录反应液中，作为反应抑制防止剂优选含有BSA (牛血清白蛋白)或明胶。溶剂优选为水，更优选为实际上不含有乙醇、异丙醇等有机溶剂和离液物质的溶剂。此外，为了配制成逆转录酶用缓冲液，优选含有适当浓度的盐。用于配制缓冲液的盐，只要不抑制酶反应即可，没有特别限制，优选使用Tris、Hepes、Pipes、磷酸等的盐。逆转录酶没有特别限制，例如，可使用源自禽成髓细胞瘤病毒(Avian Myeloblast Virus)、Ras相关病毒2型(Ras Associated Virus2 型)、莫洛尼小鼠白血病病毒(Mouse Molony Murine LeukemiaVirus)、人类免疫缺陷病毒I型(Human Immunodefficiency Virusl型)的逆转录酶等。
[0029]溶出液含有用于继续处理逆转录合成的cDNA的酶、底物、盐等的溶质。溶出液中，作为反应抑制防止剂优选含有BSA (牛血清白蛋白)或明胶。溶剂优选为水，更优选为实际上不含有乙醇、异丙醇等有机溶剂和离液物质的溶剂。
[0030]例如，逆转录反应之后，继续将cDNA用PCR扩增时，溶出液含有DNA聚合酶、dNTP、以及DNA聚合酶用引物(寡核苷酸)即可，没有特别限制。此外也可以含有TaqMan探针、Molecular Beacon、循环探针等实时PCR用探针、SYBR Green等嵌入剂用突光色素。此外，为了配制成DNA聚合酶用缓冲液，优选含有适当浓度的盐。用于配制成缓冲液的盐，只要不抑制酶反应即可，没有特别限制，优选使用Tris、Hepes、Pipes、磷酸等的盐。DNA聚合酶没有特别限制，例如，有Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶或者这些酶的修饰体等数量非常多的市售品。
[0031]将逆转录反应液、溶出液中含有的dNTP、盐的浓度，设置为对使用的反应适合的浓度即可，通常将dNTP设置为10~1000 μ Μ，优选为100~500 μ M ;将Mg2+设置为I~10mM,优选为5~1mM ;将Cl-设置为I~2000mM，优选为200~700mM较好，总离子浓度没有特别限制，可以是比50mM高的浓度，优选为比10mM高的浓度，更优选为比120mM高的浓度，进一步优选为比150mM高的浓度，进一步优选为比200mM高的浓度。上限优选为500mM以下，更优选为300mM以下，进一步优选为200mM以下。引物用寡核苷酸分别使用0.1~10 μ M，优选为0. 1~ΙμΜ。BSA或明胶的浓度在lmg/mL以下时，反应抑制防止效果较小，10mg/mL以上时，存在抑制逆转录反应获其后的酶反应的可能性，因此优选I~10mg/mL。使用明胶时，作为其来源可例示牛皮、猪皮、牛骨，没有特别限制。明胶难以溶解时，可以加温使其溶解。
[0032]cDNA合成方法
[0033]具体的可以按照以下合成cDNA。
[0034](吸附工序)
[0035]首先，将适量的溶解液放入Eppendorf微管、塑料管等符合目的的管中，将提取RNA的试样和核酸结合性固相载体混合，通过匀质机、涡旋混合器等将试样破碎，将RNA吸附在载体上。
[0036](清洗工序)
[0037]接下来，从管中除去溶解液，可以向吸附RNA的载体中直接添加逆转录反应液，但为了将非特异地吸附于载体的夹杂物除去，减少因溶液置换而从前一工序带入溶质，将盐浓度正确地调整，优选将吸附RNA的载体用适量的清洗液清洗。清洗次数没有特别限制，可以清洗I次~多次。多次清洗时，优选开始使用含有胍盐的清洗液，最后使用不含胍盐的清洗液。例如，作为含有胍盐的清洗液，可例示含有4~7M的胍盐、O~5%的非离子性表面活性剂的清洗液，作为不含胍盐的清洗液，可例示水或低盐浓度水溶液组成的清洗液。
[0038]本发明的cDNA合成方法中，清洗是指使结合有RNA的载体与清洗液接触，进行再分离，从载体将RNA以外的非特异性结合的物质除去的操作。具体的分离方法因使用的载体的形态而不同，载体是珠子等粒子形态时，可以使用离心分离、过滤分离以及柱操作等。
[0039](逆转录工序)
[0040]接下来，从管将清洗液除去，向吸附RNA的载体添加逆转录反应液，进行逆转录反应合成cDNA。由于逆转录反应液中含有逆转录酶、dNTP以及逆转录酶用引物，可以在RNA吸附在载体的情况下，直接用于逆转录反应。逆转录反应中，可以使用含有吸附RNA的载体的逆转录反应液的一部分或全部，使用一部分时，优选用调节逆转录酶用的缓冲液进行稀释。调节逆转录酶用的缓冲液可以使用与逆转录反应液相同成分的溶液，只要将盐浓度进行适当调节，则没有特别限制，逆转录酶、dNTP以及逆转录酶用引物可以分别进行添加，也可以不分别进行添加。通过本发明的方法，在该逆转录工序中，不具有除去载体的工序。即，通过将吸附于载体的RNA，不从载体游离的情况下进行逆转录反应，从而能够合成可效率良好地用于之后的反应的cDNA。因此，例如，逆转录反应优选在低温下进行，可以是小于50°C，优选为小于45°C，更优选为小于40°C，进一步优选为小于35°C。此外，温度的下限优选为20°C以上，更优选为25°C以上，进一步优选为30°C以上。
[0041](清洗工序)
[0042]该工序之后，从管将逆转录反应液除去，可以向吸附RNA的载体直接添加溶出液，但为了除去载体非特异性吸附的夹杂物，减少因置换溶液而从前一工序带入溶质，为了正确调整盐浓度，优选将吸附RNA的载体，用适量的清洗液清洗。清洗次数没有特别限制，可以清洗I次~数次。清洗液优选由水或低盐浓度水溶液组成的清洗液。
[0043](溶出工序)
[0044] 清洗后，将清洗液除去，加入适量的溶出液，通过涡旋混合器等进行混合，将载体上结合的cDNA从载体上游离。此时，为了促进cDNA溶出，可以将溶出液加热。加热温度没有特别限制，高于40°C即可，优选50°C以上，更优选60°C以上。加热温度的上限没有特别限制，优选为70°C以下，更优选为65°C以下，进一步优选为60°C以下，最优选为60°C。作为加热方法，可以添加预先加热的溶出液，也可以在将溶出液加入载体后加热。加热时间没有特别限制，优选30秒~10分钟左右。溶出后，通过将载体除去，能够将上清分离。这样合成的cDNA可效率良好地用于包括PCR的聚合酶反应等各种用途。
[0045]应予说明，通过清洗工序等，将载体和上清分离时，可通过离心等将载体沉淀并分离，但载体含有磁性体时，使用磁石等就能够简便地进行分离。
[0046]合成的cDNA的利用
[0047]例如，可通过在溶出液添加10分之I量的DNA聚合酶反应用缓冲液(10倍溶液)等而能够进行PCR反应，但优选溶出液的盐浓度预先针对酶反应被优化，含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA聚合酶用引物。这种情况下，可以将溶出液直接用于DNA聚合酶反应。此时，DNA聚合酶反应中，可以使用反应液的一部分或全部,使用一部分时,可用DNA调节聚合酶用缓冲液稀释。调节为DNA聚合酶用的缓冲液可以使用与溶出液具有相同成分的溶液，只要将盐浓度进行了合理的调节即可，没有特别限制，DNA聚合酶、dNTP以及DNA聚合酶用引物，可以分别进行添加，也可以不分别进行添加。
[0048]DNA聚合酶反应在适用于使用的DNA聚合酶的条件下进行即可。进而，在DNA聚合酶反应之后，扩增的cDNA可用于文库制作等各种用途。
[0049]cDNA合成试剂盒
[0050]本发明的cDNA合成试剂盒含有:(I)含有4~7M的胍盐、O~5%的非离子性表面活性剂以及O~0.2M的还原剂的中性溶解液；(2)核酸结合性固相载体；(3)含有4~7M的胍盐以及O~5%的非离子性表面活性剂的第I清洗液；(4)水或低盐浓度水溶液组成的第2清洗液；(5)含有逆转录酶以及dNTP的逆转录反应液；以及，(6)含有DNA聚合酶以及dNTP的DNA扩增液。通过本试剂盒，只要向逆转录反应液中添加对应于目的基因的逆转录用引物，向DNA扩增液添加DNA扩增用引物，就能够容易、效率良好地进行本发明的cDNA合成和接着的cDNA扩增。
[0051]此外，该试剂盒可以含有逆转录用引物和/或DNA扩增用引物。由此，能够得到针对特定基因的cDNA合成试剂盒。
[0052]应予说明，本试剂盒的溶解液、清洗液、溶出液等的构成要素是以DNA合成用试剂中记载的内容为准。
[0053]实施例
[0054]实验方法
[0055](I)吸附工序
[0056]向装在1.5mL 的 Eppendorf 微管(Eppendorf microcentrifuge tube)的血清样品(取自罹患流感A型的患者)150 μ L，添加350 μ L溶解液(5.5Μ硫氰酸胍盐、2%Triton_X100、0.15M2-巯基乙醇)，充分混合，将血液细胞溶解。该溶解液中添加磁性二氧化硅粒子(NPK-401，东洋纺织公司制)20 μ L，室温下用涡旋混合器(Vortex mixer)搅拌5分钟。然后，将微管设置于磁性支架(MGS-101，东洋纺织社)上收集磁性二氧化硅粒子，将上清除去。
[0057](2)清洗工序
[0058]接下来，将微管从磁性支架取出，加入350 μ L清洗液I (7Μ胍盐酸盐)，充分混合后，再次设置在磁性支架上，收集磁性二氧化硅粒子，将上清除去，清洗磁性珠。接下来，同样地用450 μ L清洗液II (5m M Tris盐酸缓冲液)清洗粒子，最后将上清除去。
[0059](3)逆转录工序
[0060]向除去上清而收集的粒子中添加20 μ L逆转录反应液，将粒子混悬。进而，将微管用管加热器40°C下加热10分钟，进行逆转录反应。然后，将微管设置在磁性支架上收集磁性二氧化硅粒子，将上清除去。
[0061](4)清洗工序
[0062]向该样品中添加450 μ L清洗液II，室温下通过涡旋混合器搅拌10秒钟后，将其设置在磁性支架上收集磁性二氧化硅粒子，将上清除去清洗粒子。
[0063](5)实施例1:向水的溶出和PCR反应
[0064]向(4)中除去上清而收集的粒子中添加20 μ L水，将粒子混悬，65°C加热2分钟，室温下通过涡旋混合器搅拌5秒钟后，将微管设置在磁性支架上收集磁性二氧化硅粒子，回收上清。
[0065]从上清中取4 μ L添加到PCR反应调制液16 μ L中，制作总计20 μ L的反应液。将该反应液安放于PCR装置(Roche制LightCycler-480)中，进行实时PCR反应，测定每个循环中的亮度。
[0066](6)实施例2:向PCR反应液的溶出和PCR反应
[0067]向(4)中除去上清而收集的粒子中添加20 μ LPCR反应液，将粒子混悬，65°C加热2分钟，室温下通过涡旋混合器搅拌5秒钟后，将微管设置在磁性支架上，回收上清。
[0068]将这样得到的20 μ LPCR反应液直接安置于PCR装置，进行实时PCR反应，测定每个循环中的亮度。
[0069](7)实施例3:以往的方法
[0070]向(2)中除去上清而收集的粒子添加20 μ L水，将粒子混悬，60°C加热5分钟，将微管设置在磁性支架上收集磁性二氧化硅粒子，回收上清。
[0071]从上清取出4 μ L添加到逆转录反应调整液16 μ L中，制作总计20 μ L的反应液。通过管加热器40°C加热10分钟进行逆转录反应。
[0072]从反应后的溶液取出4 μ L添加到PCR反应调制液16 μ L,制作总计20 μ L的反应液。将该反应液安置于PCR装置,进行实时PCR反应,测定每个循环中的亮度。
[0073][表 1]
[0074][表 1]
[0075]
【权利要求】
1.一种cDNA合成方法，其特征在于，包括以下工序: 吸附工序，在含有核糖核酸RNA的试样中混合含有离液物质的溶解液和核酸结合性固相载体，将RNA吸附于所述载体上， 逆转录工序，将吸附于所述载体的RNA在逆转录反应液中以吸附于所述载体的原样直接进行逆转录，合成cDNA，以及 溶出工序，将合成的所述cDNA溶出至溶出液中。
2.根据权利要求1所述的cDNA合成方法，其中，在逆转录工序之前，进一步包括将吸附有所述RNA的所述载体用清洗液清洗的工序。
3.根据权利要求1或2所述的cDNA合成方法，其中，在逆转录工序之后，进一步包括将吸附有所述RNA的所述载体用不含有机溶剂的清洗液清洗的工序。
4.根据权利要求1~3中的任一项所述的cDNA合成方法，其特征在于，所述逆转录反应液含有逆转录酶、dNTP、逆转录用引物。
5.根据权利要求1~4中的任一项所述的cDNA合成方法，其特征在于，所述溶出液含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA扩增用引物。
6.根据权利要 求1~5中的任一项所述的cDNA合成方法，其特征在于，所述逆转录反应液和/或溶出液含有BSA。
7.根据权利要求1~6中的任一项所述的cDNA合成方法，其特征在于，所述逆转录工序中，在小于50°C的条件下将所述RNA逆转录。
8.根据权利要求1~7中的任一项所述的cDNA合成方法，其特征在于，所述载体是磁性粒子。
9.一种cDNA合成试剂盒，其特征在于，含有: 含4~7M的胍盐、O~5%的非离子性表面活性剂和O~0.2M的还原剂的中性溶解液， 核酸结合性固相载体， 含4~7M的胍盐和O~5%的非离子性表面活性剂的第I清洗液， 由水或低盐浓度水溶液组成的第2清洗液， 含逆转录酶、dNTP以及逆转录用引物的逆转录反应液，以及 含DNA聚合酶、dNTP以及DNA扩增用引物的DNA扩增液。
【文档编号】C12N15/10GK104046613SQ201410089861
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2013年3月13日
【发明者】齐藤祐司, 高城富美男 申请人:精工爱普生株式会社