专利名称：一对检测弓形虫dna的引物及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一对能检测弓形虫DNA的寡核苷酸引物及其制备，属生物化学试剂制备的技术领域。
弓形虫是一种广泛存在于人和动物体内的、致弓形虫病的寄生原虫，能使多种脏器和组织受损。孕妇患弓形虫病，可造成胎儿畸形、神经系统发育障碍或死亡。在约5%的爱滋病例中，弓形虫病是人免疫缺陷病毒感染的首要指征。弓形虫病是全球性人畜共患病，全世界约有5亿人感染此病。快速检测弓形虫感染成为医学界普遍关注的研究课题。已有的检测弓形虫感染的方法是在被测样品中加入一对能检测弓形虫DNA的引物，通过多聚酶链反应(PCR)进行，因扩增，从而快速而准确地检测出被测样品是否受到弓形虫的感染。如BurgJL等人在题为′用PCR直接而灵敏地检测致病原虫，弓形虫(Directandsensitivedetectionofapathogenicprotozoan，Toxoplasmagondii，bypolymerasechainreaction.J.Clin.，Microbial，1989，27(8)，1787-1792)′一文中提及他们制备的一对能检测弓形虫DNA的引物，用于PCR，经3.5-6小时体外扩增，扩增产物经点杂交，再经放射自显影17小时，最终可测出1个弓形虫虫体的裂解液。又如，SavvaD等人在题为′用PCR检测弓形虫(PolymerasechainreactionfordetectionofToxoplasmagondii.J.Med.，Micvobial，1990，32(1)，25-31)′一文中提及他们制备的一对能检测弓形虫DNA的引物，用于PCR，经体外扩增2.5小时，扩增产物经电泳检测，可测出10pg弓形虫DNA，若对扩增产物进行Southern印迹分析和放射自显影，最终可测出0.5pg弓形虫DNA。以上二种弓形虫感染检测方法的缺点是费时多，至少需2～3天才能得到结果。
本发明的目的是提供一对能快速检测弓形虫DNA的寡核苷酸引物及其制备。
图1是美国AppliedBiosystems公司出品的381ADNA合成仪的外形示意图，其中1～10是试剂并，11是电源插头，12是电源开关，13是控制面板，14是键盘，15是显示屏，16是机壳，17是散热孔，18是反应柱，19是引物收集管，20是主程序按钮。
本发明人对弓形虫特异DNA片段的诊断基因的DNA顺序进行了分析，该DNA顺序为，1GTAGCATCATTTCACCAATCprimer1#▲21CCCCTTTGAGTCAGCTAGGGAlu
41GATTTGCAAGGGCAAGTGTC61CTCGGCCCACTCTGCCGCAC81ATGTTGTCAGAAAAACGCTT101TCGTTATGGAGTTCTGACGG121AGGCCATGACATCCATCTCC141ACGTTCGCGCGCCTTGTTCT161GTTTCTAGTGGAGTCGCTTT181CGCCTCGTCCTCTGTGTACCprimer2#201CCTCTCGATTTTTCATCGTT
221TCGCGCGCCCGTTCCCCGTC241GCACATCTGCTC其中A、G、C和T分别表示脱氧嘌呤核苷酸残基、脱氧鸟嘌呤核苷酸残基、脱氧胞嘧啶核苷酸残基和脱氧胸腺嘧啶核苷酸残基。参照上列DNA顺序，自行设计并用DNA合成仪制备了若干对寡核苷酸引物，通过大量实验，从弓形虫DNA检测特异性、灵敏度和快速性三个方面，对上列诸对寡核苷酸引物进行全面的考察和鉴定，从中选出性能最佳的一对，其引物顺序为，引物1＃5′GTAGCATCATTTCACCAAT 3 ′ 19mer引物2#5′ GTACACAGAGGACGAGGCGA 3′ 20mer与上述弓形虫特异DNA片段的诊断基因的DNA顺序对比可知，引物1＃和2＃的顺序分别位于该基因的核苷酸1～19和180～199的互补链。
本发明涉及的一对能检测弓形虫DNA的寡核苷酸引物是利用美国AppliedBiosystems公司出品的381A型DNA合成仪制备的，对照图1，制备步骤可说明如下1.接通电源。把电源插头11插入交流市电插孔，381A型DNA合成仪内的微机因得到供电而工作。
2.装注原料。把作为原料的试剂脱氧腺苷二异丙基亚磷酰胺、脱氧鸟苷二异丙基亚磷酰胺、脱氧胞苷二异丙基亚磷酰胺、脱氧胸苷二异丙基亚磷酰胺、TCA(三氯醋酸)、I2(碘)、四唑、DMAP(二甲基氨基吡啶)、乙酸酐和乙腈分别注入，并注满试剂并1～10。试剂并1～10的容量均为25毫升。上列10种试剂均为美国AppliedBiosystems公司的产品。
3.键入引物顺序。利用控制面板13上的主程序按钮20和键盘14，键入需制备引物的顺序。键入的顺序显示于显示屏15。制备引物1＃时，键入该引物的顺序，即5′GTAGCATCATTTCACCAAT3′;制备引物2＃时，键入该引物的顺序，即5′GTACACAGAGGACGAGGCGA3′。
4.键入反应时间。利用控制面板13上的主程序按钮20和键盘14，键入需制备引物的反应时间。键入的反应时间(分钟数)显示于显示屏15。每制备1微摩尔数(μmol)的引物1＃或引物2＃，键入反应时间应为228分，合3.8小时。
5.接通工作电源，按一下电源开关12，381A型DNA合成仪内的引物合成部分得到供电，在机内微机的控制下，使原料在反应柱18中自动合成所需的引物，引物合成部分工作时会发热，热量通过位于机壳16两侧的散热孔17散出。
6.收集成品。在反应柱18中合成的所需引物(成品)经橡皮管引出，滴入专用来收集成品的引物收集管19。
由于经以上6个步骤只能制备一个引物，所以一对能检测弓形虫DNA的寡核苷酸引物需要分2次制备。
与已有技术相比，本发明涉及的一对能检测弓形虫DNA的寡核苷酸引物，用于检测弓形虫感染时，PCR扩增耗时较少，仅需2.7小时，加上其他操作，能在1天内测出结果。而使用已有的引物对检测弓形虫感染时，至少需2～3天才能测出结果。所以，本发明涉及的一对引物能灵敏而快速地检验出弓形虫感染。
本发明为生物化学试剂制备领域提供了一种能制备一对检测弓形虫DNA的寡核苷酸引物的方法。该对引物可用于人畜弓形虫病早期诊断、治疗和预防，也可用于孕妇产前检查，防止产生先天性弓形虫病，还可用于艾滋病患者并发感染弓形虫病的诊断，对优生优育和人畜弓形虫病的防治具有重要的意义，所以，本发明在医学、农业及畜牧业方面有广泛的应用前景。
权利要求
1.一种用DNA合成仪制备一对能快速检测弓形虫DNA的寡核苷酸引物的方法，制备步骤包括设计引物顺序、接通电源、装注原料、键入引物顺序、键入反应时间、接通工作电源和收集成品7步，其特征在于在键入引物顺序步骤中键入的引物顺序为在设计引物顺序步骤中找到的引物1#或引物2#的引物顺序，即5′GTAGCATCATTT CACCAAT3′19mer或5′GTACACAGAGGACGAGGCGA3′20mer，一对引物分2次合成，每次合成一个引物，引物1#和引物2#的引物顺序分别为5′GTAGCATCATTTCACCAAT3′19mer和5′GTACACAGAGGACGAGGCGA3′20mer，分别位于顺序为1 (GTAGCATCAT TTCACCAATC)/(primer 1#)Δ21 CCCCTTTGAG TCAGCTAGGGAJul41 GATTTGCAAG GGCAAGTGTC61 CTCGGCCCAC TCTGCCGCAC81 ATGTTGTCAG AAAAACGCTT101 TCGTTATGGA GTTCTGACGG121 AGGCCATGAC ATCCATCTCC141 ACGTTCGCGC GCCTTGTTCT161 GTTTCTAGTG GAGTCGCTTT181 (GTAGCATCAT TTCACCAATC)/(primer 1#)201 CCTCTCGATT TTTCATCGTT221 TCGCGCGCCC GTTCCCCGTC241 GCACATCTGC TC的弓形虫特异DNA片段的诊断基因的核苷酸1～19和180～199的互补链；在键入反应时间步骤中制备1微摩尔数(μmol)的引物1#和引物2#所对应的键入反应时间应均为228分，即3.8小时。
全文摘要
本发明涉及一对能检测弓形虫DNA的寡核苷酸引物及其制备，属生物化学试剂制备的技术领域。该对引物有弓形虫检测特异性好、灵敏度高和速度快的优点，对人畜弓形虫病的防治具有重要的意义。本发明在医学、农业和畜牧业方面有广泛的应用前景。
文档编号C12P19/34GK1071459SQ9110750
公开日1993年4月28日 申请日期1991年10月4日 优先权日1991年10月4日
发明者陈诗书, 夏爱娣 申请人:上海第二医科大学