专利名称：含有白桦酸衍生物的抗肿瘤药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤药物，具体是关于一种以白桦酸衍生物3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸或3-脱氧-3-羰基-白桦酸作为有效成分的抗肿瘤药物。
背景技术：
白桦酸，又名桦木酸，是五环三萜类化合物，英文名称为Betulinicacid，化学名为3β-hydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid，其分子式为C30H48O3，分子量为456.71，白桦酸的化学结构式如下 白桦酸有几种生物来源，如从蒲桃树叶、白桦树皮乙醇萃取物进行重结晶提取；也可以用白桦脂醇为原料通过化学合成得到。白桦酸是一种无色结晶，熔点316～318℃。白桦酸具有抗肿瘤、抗艾滋病病毒、抗炎和体外抗疟病作用等多种生物活性，并对肿瘤细胞具有一定的选择性细胞毒性及其较好的治疗指数，甚至达到500mg/kg时，也没有明显的毒性反应。九十年代中期经研究发现白桦酸可以选择性地杀死人类黑色素瘤细胞而不杀伤健康细胞。另外近期的研究表明白桦酸对脑瘤、神经外胚层瘤、白血病等恶性肿瘤细胞也有抑制作用(周映霞等，中国药学杂志，2005年06期第6页；徐萍等，中国药师，2006年02期；李丹等，药学进展，2004年03期第15页)。
白桦酸抗肿瘤作用机制认为是降低肿瘤细胞线粒体膜电位，引起细胞内线粒体通透性改变，最后导致细胞凋亡，另外与其上调肿瘤细胞膜p53蛋白的表达，改变肿瘤细胞膜Ca2+、Mg2+-ATP酶活性有关(BasuS，et al.，Glycoconj J.2004；20(9)563-77；Wick W，et al.，Pharmacol ExpTher.1999 Jun；289(3)1306-12)。
中药提取的23-羟基桦木酸是一种白桦酸衍生物(叶银英等，中国肿瘤临床与康复，2000年01期第52页；程燕等，中国药理学通报，2007年03期第48页)。它对黑色素瘤细胞抗肿瘤作用，低剂量(20～40μg/ml处理48小时)诱导细胞分化，细胞形态由堆积变为平铺，与苯乙酸钠诱导黑色素瘤细胞形态变化类似，呈一定的极性生长。小鼠用300～600mg/kg药物灌胃治疗移植的黑色素瘤，经FCM检测发现大量的细胞被阻滞在G0～G1期，进入S期的细胞数量减少，使细胞DNA合成能力降低、从而使肿瘤体积缩小。
本发明人在研究工作中发现了两个白桦酸衍生物，可开发成新的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明提供一种含有白桦酸衍生物的抗肿瘤药物，它是以白桦酸衍生物3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸(化合物A)或3-脱氧-3-羰基-白桦酸(化合物B)作为有效成分的抗肿瘤药物。抗肿瘤药物中含有抗肿瘤有效量的化合物A或化合物B及可药用载体和/或赋形剂。
本发明人通过试验证明二个白桦酸衍生物化合物A或化合物B能广泛抑制多种类型的人肿瘤细胞系生长，并进一步诱导肿瘤细胞凋亡。在人肿瘤异种移植模型研究中，3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸和3-脱氧-3-羰基-白桦酸被证明是一种有效的抗肿瘤剂，能强烈抑制人黑色素瘤，恶性神经胶质瘤，前列腺癌，肺癌和结肠癌细胞在体内生长。3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸和3-脱氧-3-羰基-白桦酸具有被开发成为新的广谱抗肿瘤药物的巨大潜力。
化合物A(3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸)，英文名称3-deoxy-3-oxo-dihydrobetulinic acid，其分子式为C30H48O3，分子量为456.71。
化合物B(3-脱氧-3-羰基-白桦酸)，英文名称3-deoxy-3-oxo-betulinic acid，其分子式为C30H46O3，分子量为454.71。
化合物A和化合物B的化学结构式如下所示 化合物A
化合物B化合物A和化合物B的制备(参见文献Hashingmoto Fumio et al.，Bioorganic & Medical Chemistry，1997，5(12)2133-2143)。
化合物A的制备方法，包括下列3个步骤(1)28-O-苄基-白桦酸制备白桦酸，溴化苄和含碳酸钾的无水丙酮在室温下反应2小时，制得28-O-苄基-白桦酸；(2)28-O-苄基-3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸制备28-O-苄基-白桦酸，氯铬酸吡啶盐和含碳酸钾的二氯甲烷在室温下反应2小时，制得28-O-苄基-3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸；(3)3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸制备28-O-苄基-3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸在乙酸乙酯中加氢，经5％Pd-C催化剂在室温下反应18小时，制得3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸。
化合物B(3-脱氧-3-羰基-白桦酸)制备方法白桦酸，氯铬酸吡啶盐和含碳酸钾的二氯甲烷在室温下反应2小时，制得3-脱氧-3-羰基-白桦酸。
白桦酸衍生物化合物A和化合物B的药理试验1.体外试验使用人肿瘤细胞系进行细胞毒性试验。在含有不同浓度化合物A或化合物B的正常培养基中培养31种肿瘤细胞株，3天后应用MTT法测定细胞存活情况。结果(表1)显示大多数人体肿瘤细胞对化合物A和化合物B敏感。有些肿瘤细胞对这两种化合物的EC50(半数致死量)低于1μm。但是，正常人乳腺上皮细胞(MCF10a)和正常小鼠成纤维细胞(MEF)对化合物A或化合物B不敏感，即便这两种化合物的浓度高达30μm，这些细胞仍然生长良好。体外试验证明化合物A或化合物B能广泛抑制人体肿瘤细胞株，但对正常细胞株没有作用。
表1 化合物A或化合物B体外抑制人肿瘤细胞生长
2.应用人肿瘤移植裸鼠模型进行化合物或化合物B的抗肿瘤有效性试验在化合物A或化合物B有效抑制多种肿瘤细胞体外增殖的基础上，应用人肿瘤移植裸鼠(皮下接种)评价化合物A或化合物B的抗肿瘤作用，受试的肿瘤细胞包括人前列腺癌细胞LnCAP，人肺癌细胞NCI-H23，人结肠癌细胞HCT-116，人黑色素瘤细胞G-361和人恶性神经胶质瘤细胞U-251。结果(图1-5)显示，化合物A强烈抑制这5种肿瘤生长，其TGI值分别为2％，0％，3.5％，0％和0％。化合物B抑制这5种肿瘤生长，其TGI值分别为20.5％，46％，40％，60％和67％。同时未发现化合物A或化合物B具有明显的副作用，包括体重的变化。这些数据表明化合物A或化合物B能明显抑制体内肿瘤生长，是开发新的抗肿瘤药物很好的候选化合物。
此外还进行下列试验化合物A或化合物B在小鼠体内的药代动力学试验口饲给药的化合物A或化合物B在4个小鼠体内的药代动力学参数见表2和表3。这些实验数据表明化合物A或化合物B能在体内保持一定的药物浓度，有利于抗肿瘤的效果。
表2.化合物A在小鼠体内的药代动力学参数
表3.化合物B在小鼠体内的药代动力学参数
化合物A或化合物B给药后对小鼠的急性毒性试验受试小鼠处死后进行病理分析。结果显示，以单次剂量500mg/kg和多次剂量200mg/kg(QD×15)给予化合物A或化合物B，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。
由以上药理试验的效果证明，白桦酸衍生物化合物A或化合物B对31种肿瘤细胞株的细胞毒性试验结果显示有广谱的抗肿瘤作用；在人肿瘤移植裸鼠模型试验中，化合物A或化合物B都显示出对人前列腺癌细胞LnCAP、人肺癌细胞NCI-H23、人结肠癌细胞HCT-116、人黑色素瘤细胞G-361和人恶性神经胶质瘤细胞U-251有强烈的抑制肿瘤生长的作用。同时未显示有明显的副作用。此外药代动力学试验也显示化合物A或化合物B在小鼠体内能保持一定的药物浓度，有助于抗肿瘤效果；化合物A或化合物B给药后对小鼠的急性毒性试验也显示未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。因此白桦酸衍生物化合物A或化合物B是一种有效的具有很大开发前景的广谱抗肿瘤新药。化合物A或化合物B可作为抗肿瘤药物的原料药，优先作为抗恶性实体瘤药物的原料药，化合物A或化合物B也可与通常的可药用载体和/或赋形剂制成抗肿瘤药物。所述通常的可药用载体和/或赋形剂，例如谷物油，羧甲基纤维素钠等。
化合物A一般口服有效剂量为每天150mg/体表面积m3，连续三周，休息一周为一疗程。化合物B一般口服有效剂量为每天450mg/体表面积m3，连续三周，休息一周为一疗程。化合物A或化合物B每天总剂量一次于早餐后半小时口服，具体病例可由医师根据病情调整。
图1是化合物A组，化合物B组，对照组治疗皮下接种的人前列腺癌(LnCAP)肿瘤的肿瘤体积-移植后天数曲线图。
图2是化合物A组，化合物B组，对照组治疗皮下接种的人肺癌(NCI-H23)肿瘤的肿瘤体积-移植后天数曲线图。
图3是化合物A组，化合物B组，对照组治疗皮下接种的人结肠癌(HCT-116)肿瘤的肿瘤体积-移植后天数曲线图。
图4是化合物A组，化合物B组，对照组治疗皮下接种的人黑色素瘤(G-361)肿瘤的肿瘤体积-移植后天数曲线图。
图5是化合物A组，化合物B组，对照组治疗皮下接种的人恶性神经胶质瘤(U-251)肿瘤的肿瘤体积-移植后天数曲线图。
具体实施例方式
实施例1化合物A(3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸)的制备(参见文献Hashingmoto Fumio等Bioorganic & Medical Chemistry，1997，5(12)2133-2143)。
(1)28-O-苄基-白桦酸制备207.5mg白桦酸，1ml溴化苄和含400mg碳酸钾的20ml无水丙酮在室温下反应2小时，制得207mg 28-O-苄基-白桦酸；(2)28-O-苄基-3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸制备304.1mg 28-O-苄基-白桦酸，300mg氯铬酸吡啶盐和含100mg碳酸钾的5ml二氯甲烷在室温下反应2小时，制得281mg 28-O-苄基-3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸；(3)3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸制备
223mg 28-O-苄基-3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸在100ml乙酸乙酯中加氢，经5％Pd-C催化剂在室温下反应18小时，制得产物210mg 3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸，为无色针状，mp为265-267℃。
实施例2化合物B(3-脱氧-3-羰基-白桦酸)的制备50mg白桦酸，60mg氯铬酸吡啶盐和含100mg碳酸钾的5ml二氯甲烷在室温下反应2小时，制得产物45mg3-脱氧-3-羰基-白桦酸，为无色针状，mp为232-233℃。
实施例3细胞毒性试验(参见Carmichael J et al.，Cancer Research，1987，47943-946)使用人肿瘤细胞系进行细胞毒性分析。人肿瘤细胞系购自ATCC(美国细胞、菌种库)和NCI(美国国立癌症研究所)，用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养液，在含5％CO2的37℃孵箱中培养。用胰蛋白酶消化汇合的细胞，经培养液洗涤后计数。向96孔培养板的每孔中加入3000～6000个细胞，孵育16小时或24小时。然后向孔内加入不同浓度的化合物A或化合物B，继续培养72小时后，对药物处理组细胞和对照组细胞进行MTT(四氮唑蓝)试验，结果见表1。
实施例4应用人肿瘤移植裸鼠模型进行化合物A或化合物B的抗肿瘤有效性试验(1)建立人肿瘤移植裸鼠模型(参见Harrison SD Jr et al.，J NatlCancer Inst，1991，83(20)1509)T细胞缺陷裸小鼠(nu/nu)，雄性，6周龄，购自Charles River实验室，按照大学动物饲养和使用委员会指南饲养于无病原体环境。将5×106个LNCaP、NCI-H23、HCT-116、G-361、U-251细胞分别悬浮于0.2ml HBSS(Hanks’平衡盐溶液)或基质胶(50∶50，v/v)中，皮下接种到小鼠的侧腹部区域。当肿瘤平均直径达7～8mm时，选出肿瘤大小为100～200mm3的小鼠，分为给予玉米油配制的化合物A或化合物B的处理组和只给予载体(玉米油)的对照组。为保证化合物A或化合物B处理组和对照组在处理开始时肿瘤体积分布大致相等，将小鼠分成三类肿瘤体积小(长度＜4mm)，肿瘤体积中等(4～8mm)，肿瘤体积大(＞8mm)。对照组，化合物A或化合物B处理组中来自相同类别的小鼠数目大致相等。
(2)裸小鼠肿瘤移植模型的给药(化合物或化合物B)在口服给药试验中，将化合物A(30mg/kg)或化合物B(100mg/kg)溶解于玉米油中。每日灌饲给予单次剂量200μl药液(用玉米油配制，含0.75mg化合物A或2.5mg化合物B)，每周5次，持续3周；对照组按同样方法给予载体(玉米油)。小鼠单独饲养，允许自由采食。
(3)抗肿瘤效应评价每3～4天沿两个垂直方向对肿瘤进行测量。肿瘤体积根据以下公式计算V＝(a2×b)/2其中a是肿瘤宽度(较小直径)，b是长度(较大直径)。每个肿瘤的相对肿瘤体积(RTV)定义为给定时间点的肿瘤体积与处理开始时肿瘤体积的比值。每个处理组均计算平均值。根据以下公式计算肿瘤生长抑制值(TGI)，判断抗肿瘤活性TGI(％)＝T/C×100其中T是处理组试验终点(4周)RTV的平均值，C是对照组试验终点RTV的平均值。采用美国国立癌症研究所的最小抗肿瘤活性标准(T/C≤42％)。试验结束时，将肿瘤切除并在甲醛中固定，进行组织学观察。试验结果见图1-图5。
实施例5化合物A或化合物B在小鼠体内的药代动力学试验(参见Singh sset al.，J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2004 Nov 25；811(2)209-15)取4只8周龄BlebC小鼠(2只雄性和2只雌性)，单次剂量100mg/kg给予化合物A或化合物B。分别于给药后0.5、1、3、6、12、24、48、72小时，经眼静脉取血并制得血浆，以测定给予化合物A或化合物B的血浆浓度。口饲给药的化合物A或化合物B在小鼠体内的药代动力学参数见表2和表3，这些实验数据说明化合物A或化合物B能在体内保持一定的药物浓度。
实施例6给药后化合物A或化合物B对小鼠的急性毒性试验(参见GoldbergLE et al.，Preclinical toxicological study of the new antibiotic eremomycinIts acute toxicity for laboratory animals，Antibiot Med Biotekhnol.1987，32(12)910-5)取两组8周龄的BlabC小鼠，每组10只(5只雄性和5只雌性)，分别以单次剂量500mg/kg和多次剂量200mg/kg(QD×15)给予化合物A或化合物B(用玉米油配制)，然后分别观察1周和4周。每两天称体重。试验结束后，将受试小鼠处死，进行病理分析。结果显示，以单次剂量500mg/Kg和多次剂量200mg/kg(QD×15)给予化合物A或化合物B，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。
权利要求
1.一种抗肿瘤药物，其特征在于该抗肿瘤药物是以白桦酸衍生物3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸或3-脱氧-3-羰基-白桦酸作为有效成分。
2.如权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于该抗肿瘤药物中含有抗肿瘤有效量的3-脱氧-3-羰基-二氢白桦酸或3-脱氧-3-羰基-白桦酸及可药用载体和/或赋形剂。
全文摘要
一种以二个白桦酸衍生物3－脱氧－3－羰基－二氢白桦酸或3－脱氧－3－羰基－白桦酸为有效成分的抗肿瘤药物，药理试验效果证明二个白桦酸衍生物对31种肿瘤细胞株的细胞毒性试验结果显示有广谱的抗肿瘤作用；应用人肿瘤移植裸鼠模型试验，对人前列腺癌细胞LnCAP、人肺癌细胞NCI－H23、人结肠癌细胞HCT－116、人黑色素瘤细胞G－361和人恶性神经胶质瘤细胞U－251有强烈的抑制肿瘤生长的作用。药代动力学试验也显示该二个白桦酸衍生物在小鼠体内能保持一定的药物浓度，有助于抗肿瘤效果。对小鼠的急性毒性试验显示无毒性。因此该二个白桦酸衍生物是一种具有很大开发前景的广谱抗肿瘤新药。
文档编号A61P35/00GK101066273SQ200710041680
公开日2007年11月7日 申请日期2007年6月6日 优先权日2007年6月6日
发明者张南, 邱日辉 申请人:邱日辉, 张南