β-抑制蛋白1在调节T细胞存活和自身免疫中的应用的制作方法

专利名称：β-抑制蛋白1在调节T细胞存活和自身免疫中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及(3抑制蛋白1的抑制剂在制备用于治疗或 预防对象的与CD4+T细胞凋亡异常相关的疾病中的用途。
背景技术：
在生物体内，T细胞和B细胞构成了获得性免疫系统保护着机体免受病原体的 侵害。为保证机体正常的免疫应答，这些细胞的凋亡是被精确地调控着的。在胸腺 中，根据TCR信号的强弱，大部分T细胞经过阴性选择和阳性选择凋亡了。生存 下来的T细胞进入外周血系统形成外周血CD4+和CD8+ T细胞库。外周血中的 CD4+ T细胞由于胸腺中的新细胞输入和外周血中CD4+ T的细胞凋亡维持着其的动 态平衡(1， 2)。当CD4+T细胞接触到其特异抗原时，细胞开始分裂、分化成有功 能的CD4+ T细胞。这些有功能的CD4+ T细胞在清除了外来抗原后需要及时凋亡， 否则会对正常机体产生伤害。参与这些有功能的CD4+T细胞凋亡的信号通路主要 有激活引起的细胞凋亡(AICD)和激活细胞的自发凋亡(ACAD)。在所有这些 CD4+ T细胞发育过程中，控制CD4+ T细胞凋亡的调节分子的表达异常可能破坏 CD4+ T细胞平衡，使针对自身抗原的CD4+ T细胞存活下来或者延长CD4+ T细胞的 免疫应答，从而导致很多免疫疾病，如自身免疫病和淋巴细胞增多症等(3-6)。
在哺乳动物中，CD4+T细胞的凋亡主要由两条通路来介导(1， 6)。 一条是通 过细胞表面受体，如TNF和Fas等受体。它们主要介导激活CD4+T细胞的凋亡。 这些受体的激活能直接通过招募和活化caspase来诱导细胞凋亡(7-11)。与这条通 路对应的介导CD4+T细胞凋亡的途径是Bd-2家族蛋白介导的线粒体通路。这个蛋 白家族包括抗凋亡和促凋亡两大类分子，这些分子协同地调控着线粒体膜的完整性 以及存在于线粒体中促调亡蛋白的释放(12， 13)。实验表明Bcl-2家族蛋白主要 介导因细胞因子缺少，胁迫或激活的CD4+T细胞的自发凋亡(1， 14-17)。 Bcl-2是 这个蛋白家族的原型蛋白。在5cZ-2敲除小鼠中，T细胞很容易凋亡并且当小鼠变老 的时候，出现白细胞减少症(18)。而在Sd-2过表达的小鼠中，T细胞对很多凋亡 刺激不敏感(15， 16)，机体的免疫应答时间变长并且小鼠会自发出现一些自身免 疫病的症状(19)。
(3抑制蛋白家族(parrs)包含p抑制蛋白1G3arrl)、 (3抑制蛋白2(13arr2)等。它们是具有多种功能的信号分子(20)， 一方面，它们能介导多种受体的内吞(21-24)。另 一方面，它们通过和很多信号分子的结合调节这些信号通路，如Src家族激酶的 活性， 一些MAPK信号通路(20， 25， 26)。卩-抑制蛋白l(基因号NM-004041)是 GPCRs的重要调节蛋白，在细胞质与细胞核中都有分布。近来，人们又发现，(3arrl 不仅在细胞质里调节着信号通路，在核里它能直接调控基因的转录(27)。表明 卩arrl的有些功能是通过影响基因的表达来实现的。Parrs是一类泛表达的蛋白，但 它的蛋白水平在神经细胞和免疫细胞中相对更高，如(28， 29)报道和图2A所示。 最近的研究发现，Parr2在初级免疫细胞中负调节Toll-like受体的信号传导。而另一 实验室发现，A^d;小鼠在哮喘模型中的发病及病情显著低于其野生型(30， 31)。 但是到现在为止，人们仍然没有发现(3arrl在免疫细胞中的功能。

发明内容
经过研究，本发明者发现，parrl正调控CD4+T细胞的存活和其在体内的动态 平衡。Parrl的这个功能很可能是通过其核内功能实现的，在核内它能促进基 因区组蛋白H4的乙酰化水平和该基因的表达。本申请实施例中进一步阐明了(3arrl 调节〔04+ T细胞存活的重要生理意义l)在自身免疫脱髓鞘疾病小鼠模型EAE的 实验中，A^r/敲除小鼠对EAE的诱导很不敏感而^Ar/转基因小鼠的发病相对野生 型有明显的增加；2)在自身免疫脱髓鞘疾病MS的病人外周血CD4+T细胞中，parrl 和Bcl-2的表达显著地高于正常对照。而这种库rr/和的高表达对CD4+T细胞 的存活是重要的。因此，本发明提供了一种新的调控CD4+T细胞生理功能的分子 机制，并且为利用这种分子机制来治疗自身免疫疾病提供了基础。
具体而言，本发明一方面涉及(3抑制蛋白1的抑制剂在制备药物中的用途，其 特征在于，所述P抑制蛋白l的抑制剂选自(i)抑制(3抑制蛋白l活性的物质；(ii)抑制 编码(3抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质，所述药物用于治疗或预防哺 乳动物对象的与CD4+T细胞凋亡异常相关的疾病。
本发明另一方面提供了用于治疗或预防对象的与CD4+T细胞凋亡异常相关的 疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的(3抑制蛋白1的抑 制剂作为活性组分，以及药学上可接受的载体，其中所述P抑制蛋白1的抑制剂选 自(i)抑制P抑制蛋白l活性的物质；(ii)抑制编码P抑制蛋白1的基因转录、翻译或这 两者的物质。
本发明还有一方面还提供了一种从候选物质中筛选出用于治疗或预防与CD4+ T细胞凋亡异常相关的疾病的药物的方法，该方法包括a)使所述候选物质与表达 P-抑制蛋白1的细胞接触；b)鉴定(3-抑制蛋白1在所述细胞的细胞核内的表达水平，并将该表达水平与未接触所述候选物质的细胞的细胞核内(3-抑制蛋白1表达水平相
比较；c)选出使细胞核内P-抑制蛋白1表达水平降低的物质作为治疗或预防与004+ T细胞凋亡异常相关的疾病药物。
本发明的其它目的和优点可以通过下文的详细描述和具体实施例来获知。


图1显示了 P-抑制蛋白1正调控CD4+ T细胞的动态平衡和存活。图中(A) 分离ySa"尸-(1K0), P ;rWg (1TG)和野生型(WT)小鼠脾细胞(上)以及淋巴细胞 (下)，流式细胞分析CD4和CD8分子在这些细胞上的表达。FACS图是每组10 只小鼠中的代表。数字显示的是每个区域的细胞百分比。(B,C)从^W7-,~厅&和 野生型小鼠中分离CD4+和CD8+T细胞，这些细胞用CD3和CD28的抗体激活(C) 或不激活(B)。随后，细胞培养在单纯的培养液里。活细胞的数量是通过排除PI 和膜联蛋白V阳性的细胞得到。三次平行实验，* P<0.05, ** PO.01和相应对照比 较。(D,E) y5^r,-， y^rW g和野生型小鼠每组5只腹腔注射100 pg SEB。尾静脉取 血，外周血中TCRVp8，或Vp"阳性的。04+和CD8+T量用流式细胞分析得到。 数据从三次平行实验得到，*P<0.05，**P<0.01和相应对照比较。
图2显示了p-抑制蛋白l在小鼠不同组织的表达以及A^,-小鼠的淋巴细胞的 发育。(A)免疫印迹的方法检测小鼠不同组织中(3arrl和(3arr2的表达，肌动蛋白 作为上样量的内参。(B)流式细胞分析Awr,-和M小鼠(13-18周)来源的脾脏 细胞和淋巴细胞中CD3和B220的表达，FACS图是每组5只小鼠中的代表。数字 显示的是每个区域的细胞百分比。脾脏细胞(上)和淋巴细胞(下)中特异细胞群的 细胞数也显示了。 (C)流式细胞分析/ fl厅,-和*小鼠(13-18周)来源的胸腺细 胞中CD4禾n CD8的表达。FACS图是每组大于5只小鼠中的代表。数字显示的是每 个区域的细胞百分比。特异细胞群的细胞数也显示了。 DP表示双阳性，DN表示双 阴性，SP表示单阳性。**P<0.05和相应对照比较。
图3显示了 p-抑制蛋白1对CD4+T细胞中IL-2分泌、Akt和Erk激活的影响。 (A)脾脏CD4+ T细胞用相应量的CD3和CD28的抗体激活，24小时后用ELISA 检测培液中IL-2的水平。数据来源于三次平行实验。(B)^^,-和w〃j、鼠来源的 脾脏CD4+T细胞用相应量的CD3和CD28的抗体激活或不激活，免疫印迹实验检 测磷酸化的(p-) Akt, (p-) Erk和所有的Akt, Erk水平。图是两次次平行实验中的代表。
图4显示了不同处理后，(3-抑制蛋白和p300的表达以及p-抑制蛋白1对&/-2 家族基因的转录影响。(A) Jurkat细胞中转染如图所示的质粒后，免疫印迹实验检 测其对这些蛋白表达的影响。(B) Jurkat细胞中转染如图所示的质粒后，RT-qPCR 实验检测&/-2，5似,说'附，万^/和万cZ-;c/的转录水平，7ff7 r来归一化上样量。数据来源于三次平行实验，**P<0.01和相应对照比较。
图5显示了 P-抑制蛋白1促进CD4+ T细胞中的表达。(A)脾脏CD4+ T 细胞用CD3和CD28的抗体激活相应的时间，免疫印迹实验分析(3arrl,Bcl-2和Bax 的表达。肌动蛋白用作上样的内参。(B,C，D)从〃aAT,-(C)， y5fl"/g(B)， / an^-(D)和 野生型小鼠脾脏中分离004+ T细胞，并按上所述方法激活相应的时间。细胞取样 后，用RT-qPCR和免疫印迹分别检测Bcl-2和Bax的mRNA水平和Bcl-2， Bax及 Parrl的蛋白水平。m/Z/^r是RT-qPCR实验的内参，而肌动蛋白是免疫印迹实验的 内参。所有的免疫印迹和RT-qPCR实验平行做三次以上，**P<0.01和相应对照比 较。
图6显示了P-抑制蛋白1通过转录促进&/-2的表达以及卩-抑制蛋白1对CREB 和NF-kappa B报告基因的影响。(A)Jurkat细胞中转染如图所示的质粒后，RT-qPCR 和免疫印迹实验检测万c/-2和^ox的表达水平。(B， C) Jurkat细胞中转染y5ga/或 y5"rr/ 33小时后，用0, 5, 10 pg放线菌酮(CHX) (B)或0, 2, 4 pM放线菌素D (Act)
(C)处理细胞15小时，RT-qPCR和免疫印迹实验检测￡c/-2和的表达水平。 数据来源于三次平行实验，** PO.01和相应对照比较。(D)HEK293细胞中，单转 染CREB-luciferase报告基因质粒或和不同量的A^W质粒共转。数据用相对于对照 的上调倍数表示。10 毛喉素(FK)是阳性对照。数据来源于三次平行实验。(E) HEK293细胞中，单转染NF-kappaB-荧光素酶报告基因质粒或和不同量的^庁7质 粒共转。数据用相对于对照的上调倍数表示。TNF-a是阳性对照。数据来源于三次 平行实验。* PO.05, ** PO.01和相应对照比较。
图7显示了 (3-抑制蛋白1促进CD4+ T细胞中基因座组蛋白H4乙酰化的 水平。脾脏CD4+ T细胞用CD3和CD28的抗体激活，细胞在不同时间取样后用 CHIP实验分析。在CHIP实验中用了组蛋白H3乙酰化和H4乙酰化的抗体。在上 样中和抗体染色质沉淀中和5ax基因启动子区的序列用qPCR分析。数据用 上样中的量来归一化。(A)使用了 >^小鼠的。04+ T细胞，并且分析了组蛋白H4
(左)乙酰化和H3 (右)乙酰化的水平。(B)使用了/ a厅"g和w〃j、鼠的CD4+T 细胞。(C)使用了^〃,-和^小鼠的€04+ T细胞。(D)用CHIP-qPCR实验分析 / ^r/;和M小鼠的CD4+T细胞中万cZ-2基因区的组蛋白H3乙酰化和H4乙酰化水 平。图上给出了同一位点M和/ fl厅,-组蛋白乙酰化水平的比值。"0"代表转录起始 位点，"u"代表转录起始位点上游。数据来源于三次平行实验，**P<0.01和相应对 照比较。
图8显示了 p300在(3-抑制蛋白1上调5c/-2转录中的作用。 (A-D)转染有如图所示质粒的Jurkat细胞用CHIP实验分析组蛋白H4(A,C)和 H3(B，D)的乙酰化水平。在上样和免疫沉淀复合物中(A，B，C，D)和5欲(A，B)启动子区的DNA序列用qPCR检测。(E，F)转染有如图所示质粒的Jurkat细胞用 RT-qPCR实验分析万c/J(E)和万似(F)的转录水平。数据来源于三次平行实验，** PO.01和相应对照比较。
图9显示了 (3-抑制蛋白1促进小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎。(A)在6-S周的 A^r,-,々wr/《和vv/小鼠中诱导EAE,诱导后每天观察小鼠的发病情况。数据是4 次实验的总和，包括10只y5a〃,-， 10只^wr"g禾卩14只w〃J、鼠。(B)从EAE小 鼠中取出脊髓，固定并用苏木精曙红观察炎性侵染以及Luxol fast blue观察脊髓的 脱髓鞘程度。图中所示是3-4只小鼠中的典型。(C)小鼠诱导EAE 8天以后，用 MOG肽段重刺激小鼠脾脏细胞检测细胞增殖。数据来源于三次平行实验，^P0.01 和相应对照比较。(D)小鼠诱导EAE 8天以后，从脾脏细胞中分离得到CD4+和CD8+ T细胞。无血清培液诱导这些细胞凋亡，存活的细胞通过排除PI和膜联蛋白V阳 性的细胞得到。数据来源于三次平行实验，**P<0.01和相应对照比较。
图10显示了(3-抑制蛋白l和多发性硬化疾病相关。(A,B)从14位多发性硬化 病人和14位健康人的外周血中分离得到CD4+T细胞，用RT-qPCR检测/ a厅7 (A) 和5c/-2 (B)的转录水平。*P<0.05， **P<0.01和相应对照比较。(C)从多发性硬 化病人来源的MBP特异的CD4+ T细胞克隆中，用带有y ^W siRNA慢病毒千扰 (3arrl的表达。免疫印迹试验检测~〃/和万c/-2的表达水平。图中所示是三次实验 中的典型。(D)用带有y ^W siRNA的慢病毒感染MBP特异的CD4+T细胞克隆。 无血清培液诱导这些细胞凋亡，存活并带有GFP的细胞是通过排除PI阳性的细胞 得到的。数据来源于三次平行实验，**P<0.01和相应对照比较。
图ll显示了在EAE诱导后(3-抑制蛋白1在CD4+T细胞中的表达，以及CD4+ 和CD8+T细胞中，p-抑制蛋白1的亚细胞定位。(A)免疫印迹实验检测诱导了 EAE 八天的小鼠脾CD4+T细胞中的(3arrl水平。图是两次平行实验中的典型。(B)免疫 印迹实验检测CD4+和CD8+T细胞中的(3-抑制蛋白1水平。图是三次平行实验中的 典型。(C，D) CD4+和CD8+T细胞如前所述激活0 (C)或72 (D)小时，卩arrl在核 内和细胞浆中的水平用免疫印迹实验检测。图是三次平行实验中的典型。
具体实施例方式
CD4+ T在获得性免疫中起着重要的功能，对这类细胞凋亡的不正常调节可能 导致自身免疫的发生。(3arrl是一已发现的在G蛋白偶联受体信号通路中起多种功 能的蛋白，并且它亦有在核内直接调控基因转录的功能。在本发明中，发明人发现 Parrl正调控CD4+T细胞的存活。在yaw7敲除小鼠中，幼稚和激活的CD4+T在体 内和体外实验条件下都比其野生型易于凋亡。Parrl在CD4+ T细胞中调控着万d-2 基因区组蛋白H4的乙酰化水平并影响其基因表达。在多发性硬化的小鼠模型EAE中，A^rJ敲除小鼠的病理严重程度明显低于其野生型，而A^r/转基因小鼠的病理 严重程度却明显增加。多发性硬化病人外周血CD4+T细胞中沐/r/的表达显著高于 正常人。而从病人来源并与自身抗原反应的CD4+T细胞中导入^w/ siRNAi降低其 表达，这类CD4+T细胞在细胞因子胁迫的情况下凋亡显著增加，从而揭示了parrl 在调控CD4+T细胞存活和自身免疫中的一个新功能，并且为自身免疫病的治疗提 供了新的靶点。
因此，本发明第一方面涉及(3抑制蛋白1的抑制剂在制备药物中的用途，其特 征在于，所述p抑制蛋白l的抑制剂选自(i)抑制P抑制蛋白l活性的物质；(ii)抑制编 码(3抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质，所述药物用于治疗或预防哺乳 动物对象的与CD4+T细胞凋亡异常相关的疾病。
(I) (3抑制蛋白1的抑制剂
本文的术语"P抑制蛋白1的抑制剂"具有较广的含义，其包括直接或间接(例
如通过反应性中间物、代谢物等)作用于P抑制蛋白i从而抑制或降低P抑制蛋白i
的生物活性的物质，具体包括(i)在蛋白质水平上通过相互作用直接抑制(3抑制蛋 白l的生物活性的物质；(ii)抑制编码(3抑制蛋白l的基因转录和/或翻译的物质。此
处所述的"P抑制蛋白1的(生物)活性"指的是(3抑制蛋白1促进CD4+T细胞存活的 活性、促进Bcl-2表达的活性或促进Bcl-2基因座区组蛋白乙酰化水平的活性。
本领域技术人员应当理解，本文的(3抑制蛋白1的范围不仅包括(3-抑制蛋白1 的全长序列，而且还包括了所述蛋白的各种变异形式、片段、衍生物或类似物，只 要所述变异形式、片段、衍生物或类似物具有上述相同或相似的活性。这些变异形 式包括(但并不限于)相对于所述多肽的氨基酸序列有若干个(较佳地1-10个，更佳 为1-5个，最佳为l-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代的蛋白，或是与其相同(同 源)或基本上相同(同源)且有相同或相似生物活性或功能的多肽，例如有至少60%、 更佳70%、还要佳80%、 90%、甚至95%以上的同源性或相同性的多肽。这些类 似物或衍生物与天然蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异和/或不影响序列的修 饰形式上的差异。
在一个较佳的实施方案中，可抑制P抑制蛋白1活性的物质是特异性结合P抑制 蛋白l从而抑制其活性的物质，例如，对(3抑制蛋白l有特异性的多克隆抗体和单克 隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，"特异性"是指该抗体能结合于P抑制蛋白l但 不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。该抗体的范围内还包括了抗体的各种 修饰形式、及其片段如Fab'或(Fab)2片段等。所述抗体可以通过本领域内技术人员 已知的各种技术制备，如免疫动物产生多克隆抗体或杂交瘤生产单克隆抗体。另外，除抗体外的其它已知能和(3抑制蛋白1特异性结合的其受体、配体也在所述"可抑 制J3抑制蛋白l活性的物质"的范围内。
在另一实施方案中，可抑制P抑制蛋白1活性的物质是本领域技术人员已知的 具有此抑制效果的化合物，例如，放线菌素、放线菌酮或其药学上可接受的盐、衍 生物或类似物。本领域技术人员也完全能够根据本发明所述的筛选方法来从候选物
中选出其它可抑制P抑制蛋白l活性的物质。另外，已知一些G蛋白偶联受体的激 动剂也能通过影响(3arrl在细胞核和细胞质的分布从而间接影响(3arrl的活性。这些 G蛋白偶联受体的激动剂例如包括，但不局限于，如5阿片受体和K阿片受体的激动 剂等。因此，这些G蛋白偶联受体的激动剂也包括在本发明的范围内。
"抑制编码I3抑制蛋白1的基因转录和/或翻译的那些物质"主要指的是在基因 水平上通过间接作用于P抑制蛋白1的基因来影响(3抑制蛋白1的表达，从而抑制其 活性的那些物质，通常是核酸类物质。
在一个实施方案中，这些物质例是P抑制蛋白l的编码基因(基因号:NM-004041) 的全部或部分序列的反义序列。该反义序列的长度通常可在5-200、较佳为10-100、 更佳为20-50个碱基之间。此种反义核酸分子可用化学方法来合成，采用的是天然 的核苷酸或设计成可提高分子生物稳定性或增高与P抑制蛋白1 mRNA或(3抑制蛋 白1基因形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸。该反义序列也可用生物 学方法制得，用表达载体以重组质粒，嗜菌粒或减毒病毒形式引入细胞内，在该细 胞内反义序列在高度有效的调节区之控制下产生，其活性可由引入载体的细胞类型 决定。
在另一实施方案中，抑制编码(3抑制蛋白1的基因转录和/或翻译的那些物质是 小干扰RNA(siRNA)。 RNA干扰是一种新近发现的体内基因沉默现象。小干扰RNA 是外源性双链RNA的加工产物，其在细胞内能介导RNA干扰效应，识别特异性 mRNA，沉默同源基因表达。在针对哺乳动物细胞设计siRNA时，较为有效的siRNA 具有20-30个碱基、更佳为21-25个碱基大小，其3'端宜有两个突出碱基。siRNA 的序列专一性要求非常严谨，与耙mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默 的效果。本领域技术人员通常可采用以下几个步骤来设计siRNA : (l)选择siRNA 靶位点；(2)序列同源性分析；(3)设计阴性对照。设计出的siRNA也同样可以用化 学合成方法或体外转录法来合成。关于(3抑制蛋白1 siRNA的构建的具体例子，可 以参见Parruti, G.等人，J Biol Chem 268, 9753-61 (1993)。
在还有一个实施方案中，抑制编码P抑制蛋白l的基因转录和/或翻译的那些物 质是核酶。核酶是能够特异性地与靶RNA分子配对，继而在特定的位点切割后者， 中止相应蛋白产生的核糖核酸分子。目前已知有七大类自然存在的核酶，即一类内 含子、二类内含子、RNaseP的RNA亚基、锤头状核酶、发夹型核酶、肝炎S病毒核酶、和VS核酶。在核酶家族中，锤头状核酶为最小(长约40-50个核苷酸)， 有结构简单和设计简易的优点。例如，可直接用化学方法合成DNA序列，然后利 用DNA重组技术连接到重组质粒中转录制得所述核酶，然后在试管内对所设计的 核酶对RNA底物分子的剪切特异性和效率的验证。另外，可用PCR技术来扩增 RNA(Saiki， et al. Science 1985;230:1350-1354)。将核酶的基因克隆到质粒、腺病毒、 或逆转录病毒载体中。
在获得上述抑制编码I3抑制蛋白1的基因转录和/或翻译的核酸序列(如反义序 列、核酶或小干扰RNA)后，就可用常规技术例如转化、转染、感染及物理技术(如 电穿孔及微量注射)将其引入对象细胞内。另外也可用化学方法例如DNA共同沉淀 及掺入脂质体的方法或是以气溶胶或灌洗形式来输送。用来转移核酸分子的适当的 病毒载体、质粒或克隆载体为本领域所知。适当的病毒载体的例子包括逆转录病毒 载体、慢病毒载体、腺病毒载体及DNA病毒载体等。这些技术对于本领域技术人 员而言均是熟知的。
另外，在本发明中，也可考虑通过基因变换方法(如用等位基因置换、插入失 活及缺失形成进行定向基因诱变)来干扰编码P抑制蛋白1的基因的转录，从而选择 性地抑制P抑制蛋白1的活性。
(II)用途
本发明的(3抑制蛋白1的抑制剂可用于治疗对象体内与CD4+ T细胞凋亡异常 相关的疾病。本发明适用的哺乳动物对象包括人、家畜和农场动物、非人灵长类、 以及动物园、运动场动物，或宠物，如狗、马、猫、奶牛等。在一个较佳的实施方 案中，所述哺乳动物是人。
本文所述的"CD4+ T细胞凋亡异常"的含义是，与正常对象的004+ T细胞 相比，CD4+T细胞凋亡水平降低、存活能力提高。所述CD4+T细胞凋亡尤指外周 血中的发生CD4+T细胞凋亡。
与CD4+T细胞凋亡异常相关的疾病具体包括自身免疫疾病、淋巴细胞增多症。 自身免疫病是指机体所产生的自身抗体或致敏淋巴细胞破坏、损伤自身的组织和细 胞成分，导致组织损害和器官功能障碍而引起的疾病。导致自身免疫疾病的根本机 制是免疫耐受性的终止和破坏。自身免疫性疾病往往同时具有以下特点①患者血 液中可测行高效价自身抗体和(或)自身组织成分起反应的致敏淋巴细胞。②自身 抗体和(或)自身致敏淋巴细胞作用于靶抗原所在组织、细胞，造成相应组织器官 的病理性损伤和功能障碍。③在动物实验中可复制出相似的病理模型，并能通过患 者的血清或淋巴细胞使疾病被动转移。④病情转归与自身免疫反应强度密切相关。 ⑤除一些病因明了的继发性自免疫性疾病可随原发疾病的治愈而消退外，多数原因不明的自身免疫常呈反复发作和慢性迁延。
适合用本发明来进行治疗或预防的自身免疫疾病包括，但不局限于，类风湿关 节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、多发性硬化症、重症肌无力、脱髓鞘疾 病、原发性肾上腺皮质萎縮、慢性甲状炎、I型糖尿病、慢性非特异性溃疡性结肠 炎、慢性活动性肝炎、恶习性贫血与萎縮性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出 血性综合症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减 少症等。
在较佳的实施方案中，适合用本发明来进行治疗或预防的自身免疫疾病包括脱 髓鞘疾病、多发性硬化或I型糖尿病。
(HI)药物组合物
本发明还提供了一种用于治疗或预防哺乳动物对象的与CD4+T细胞凋亡异常 相关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的(3抑制蛋白1的抑制剂作 为活性组分，以及药学上可接受的载体，其中所述p抑制蛋白1的抑制剂选自(i)抑制 P抑制蛋白l活性的物质；(ii)抑制编码P抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物 质。
本发明的药物组合物含有本文详细描述的抑制(3抑制蛋白1的物质或用本发明 的方法鉴定出的物质。该活性物质可以单独给予，但是通常是和药物载体等一同给 予，这可根据所选的给药途径和标准医药实践来选择。给药剂量应当是"有效量"， 即治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的 量。给药剂量随用途及已知因素(例如特定物质的药效学特性及其给药方式及途径； 接受者的年龄、健康情况及体重；病情性质及程度；伴随治疗种类，治疗频度及期 望效果)而异。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的 性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有 效量是没用的。然而，对于某给定的症状而言，可以用常规实验来确定该有效量， 临床医师是能够判断出来的。
术语"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体或赋形剂，其应当与本 发明的P抑制蛋白1的抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低 药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或赋形剂或其组分的一些物质的具 体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及 其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽； 明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉 籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween;润湿剂，如月桂基硫酸钠；着 色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和 磷酸盐缓冲液等。另夕卜，在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co. ， N.J.
1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
本文详细描述的或用本发明方法鉴定的一种以上的物质还可以和其它药剂联 合使用。它们可以作为单独分开的剂型同时或并行给药，或作为各组分治疗剂的物 理组合物以单独或组合的剂型给药。本发明的物质可经口、经外用、直肠、胃肠外、 局部、吸入方式使用。该物质也可经由控释或缓释胶囊系统及其它药物输送技术给 药。
例如，对于以片剂或胶囊剂形式的口服给药，可将活性物质与药学上可接受的 无毒、口服、惰性载体(如乳糖，淀粉，蔗糖，葡萄糖，甲基纤维素，硬脂酸镁，磷
酸二钙，硫酸钙，甘露糖醇，山梨糖醇等)合用；对于液体剂型的经口给药，口服活
性物质可与任一种药学上可接受的口服、无毒惰性载体(如乙醇，甘油，水等)合并。 如果需要，也可将合适的粘合剂，润滑剂，崩解剂，及着色剂搀混于剂型中。合适 的粘合剂包括淀粉，明胶，天然糖类如葡葡糖或p-乳糖，玉米增甜剂，天然及合成 的树胶如阿拉伯胶、西黄蓍胶或海藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡类等。可 用于这些剂型的合适的润滑剂包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸 钠，氯化钠等。崩解剂的例子包括淀粉，甲基纤维素，琼脂，皂土，黄原胶等。本 发明所述的药物组合物也可以脂质体输药系统形式给药，例如小的单层囊，大的单 层囊及多层囊。脂质体可由各种磷脂(如胆固醇，硬脂基胺或磷脂酰胆碱)形成。本 发明详细描述的以及用本发明方法鉴别的物质也可与可溶性聚合物偶合，这些聚合 物为可定向的药物载体。这些聚合物的例子包括聚乙烯吡咯垸酮，吡喃共聚物，聚 羟丙基甲基丙烯酰胺-酚，聚羟乙基天冬酰胺酚，或被棕榈酰基取代的聚环氧乙垸-聚赖氨酸。这些物质也可与用于控制药物释放的可生物降解的聚合物偶合。合适的
聚合物包括聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸及聚乙醇酸的共聚物，聚s-己内酯，聚羟丁
酸，聚原酸酯类，聚縮醛类，聚二氢吡喃类，聚氰基丙烯酸酯类，水凝胶的交联或
两亲性嵌段共聚物。合适的药物载体及药物的制法在《雷明顿医药科学》Mack Publishing Company中有所描述，这是本领域的标准参考文献。
(IV)鉴定方法
技术领域：
本发明另一方面还提供了一种从候选物质中筛选出用于治疗或预防与CD4+ T 细胞凋亡异常相关的疾病的药物的方法，该方法包括 a)使所述候选物质与表达(3-抑制蛋白1的细胞接触；b) 鉴定p-抑制蛋白1在所述细胞的细胞核内的表达水平，并将该表达水平与未
接触所述候选物质的细胞的细胞核内P-抑制蛋白1表达水平相比较；
c) 选出使细胞核内P-抑制蛋白1表达水平降低的物质作为治疗或预防与CD4+T 细胞凋亡异常相关的疾病药物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、 微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这 些技术在下列文献中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版 (1989);《DNA克隆》第I和II巻(D.N. Glover编辑1985);《寡核苷酸合成》(M丄Gait 编辑，1984);《核酸杂交》(B.D.Hames和S丄Higgins编辑.1984);《蛋白质纯化 原理和实践》第2版(Springer-Verlag， N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV巻(D.C. Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
实施例 材料和方法
1. 病人样品
在该研究中，明确诊断是复发缓和型多发性硬化的病人志愿者来自复旦大学华 山医院和交通大学瑞金医院神经内科门诊部。按照当地医院条例经过病人的知情同 意以后，抽取病人的外周血液样品。此研究中的健康人志愿者来自中科院上海分院 生化细胞所的员工或学生，部分来自上海市血液中心。他们如前所述也经过知情同思。
2. 人T细胞样品制备
T细胞用鼠源抗人的抗CD4的抗体标记后，用山羊抗鼠IgG磁珠，分离柱以及 AutoMACS分离装置进行分离纯化，通过FACS检验得到纯度大于90%的CD4+ T细 胞。
3. 小鼠
C57BL/6小鼠是从中科院上海实验动物中心购得。具有C57BL/6背景的yft^r,-和A^r2;小鼠是由美国杜克大学医学中心Robert J. Lefkowitz博士惠赠。^rr^g 小鼠如Rapid xenograft tumor growth in beta-arrestinl transgenic mice due to the elevation of tumor angiogenesis Lin Zoul, 2, Rongxi Yangl, 3 and Gang Peil描述产生， 并且和C57BL/6回交9代以上。动物的词养和操作是按照中科院上海生命科学院实验动物委员会的条例进行。所用的动物在无病原体的环境下饲养，并且在实验之前 进行基因组的鉴定。
4. 抗体、试剂、质粒和干扰siRNA
鼠源的抗Bcl-2和Bax的抗体，PE偶联的抗鼠CD4、 CD8、 B220、和VpS的抗 体以及FITC偶联的抗鼠CD4、 CD8、 CD3和Vp8的抗体购于BD Biosciences公司。 抗(3arrs (A1CT)的兔源多克隆抗体由Robert J. Lefkowitz博士惠赠。抗乙酰化组蛋 白H4和组蛋白H3的抗体购自Upstate Biotechnology公司。IRDyeTM800CW偶联 的抗鼠IgG和抗兔IgG纯化的抗体是从Rockland公司购得。抗肌动蛋白的抗体和 试剂放线菌素D以及地塞米松是从Sigma公司购得。抗Erk和抗ser217/221磷酸化 的Erk的抗体是Cell Signaling公司的产品，而抗Akt和抗ser473磷酸化的Akt的抗 体是从上海KANGCHEN公司购得。SEB是由北京Biotinge Biomedicine公司生产。 编码"gfl/， ii4-yftwr/ (如前所述)(29)、 /W-y6^r2、 y6^W0^化的质粒是按照先 前描述构建的(32)。 /7^S/C/6/A^W siRNA、 /755/Wy6^r2 siRNA和/755/t/6/非特异 siRNA的质粒是如前描述构建的(29)。 p300野生型和其活性区突变体(C/H1缺 失)质粒是从Upstate公司购得。人MBP小肽是由安德生癌症中心小肽中心实验 室合成并纯化的。小肽的纯度大于90%。
5. 流式细胞分析
细胞重悬在含有1%BSA的PBS缓冲液中。用相应细胞表面抗原的荧光抗体 如CD4、 CD8、 CD3、 B220、 TCR V,和Vp6等抗体在推荐的缓冲液中4度孵育1 小时。标记了的细胞经过洗涤后用BD公司的FACSAria仪器分析。
6. 细胞纯化、激活和培养
小鼠的脾脏细胞用纯化的兔源抗鼠的CD4抗体或兔源抗鼠的CD8抗体标记后， 用山羊抗兔的IgG磁珠，分离柱以及AutoMACS分离装置进行分离纯化，通过FACS 检验，得T细胞的纯度大于95%。分离纯化后的T细胞在包被有大颊鼠源抗鼠的 CD3 (CD3s链)单克隆抗体培养皿中和CD28单克隆抗体共同刺激下激活。培养用 的是RPMI1640培液加上10%的胎牛血清，2mM L-glutamine,5 mM 2-ME,和100单 位/ml的青霉素。髓磷脂基质蛋白(MBP)特异的CD4+T细胞是培养在含有20ng/ml 的MBP小肽(33)禾P 100U/ml的人重组IL-2的RPMI1640培养液中。
7. 逆转录和实时定量PCR
实验中所有的总RNA都按照Invitrogen使用指南用TRIzol提取。在逆转录的实验中，使用了 oligo(dT)引物和superscript II系统。所有定量的基因转录实验都由 qPCR完成。使用的qPCR系统主要包括:Brilliant SYBR Green QPCR Master MIX 和一个Light Cycler检测仪(Stratagene)。使用的引物有鼠&/-2-sense， 5，-TTC TCC TTC CAG CCT GAG AGC AA-3' (SEQ ID NO: 1), antisense, 5，-ATG ACC CCA CCG AAC TCA AAG-3 (SEQ ID NO: 2)，；鼠5ax-sense, 5，-AGG ATG CGT CCA CCA AG-3， (SEQ ID NO: 3)， antisense, 5'陽AAG TAG AAG AGG GCA ACC AC-3， (SEQ ID NO: 4);鼠朋灯-sense, 5，-CCT GCT GGA TTA CAT TAA AGC ACT G-3， (SEQ ID NO: 5), antisense, 5，-TTC AAC ACT TCG AGA GGT CCT-3， (SEQ ID NO: 6);鼠 //尸i r作为cDNA输入对照；人i/尸Ar-sense, 5，-CCT GCT GGA TTA CAT CAA AGC ACT G-3， (SEQ ID NO: 7), antis画，5'陽TCC AAC ACT TCG TGG GGT CCT-3， (SEQ ID NO: 8);人to-sense 5，-ATC CAG GAT CGA GCA GGG CG-3， (SEQ ID NO: 9)， antisense, 5，陽ACT CGC TCA GCT TCT TGG TG-3， (SEQ ID NO: 10);人所m-sense, 5，-CAA TGG CTA ACT GGG ACT A-3， (SEQ ID NO: 11), antisense, 5,-TCT TCG GCT GCT TGG TAA -3' (SEQ ID NO: 12);人5ad-sense, 5，-CCA GAG TTT GAG CCG AGT GAG-3' (SEQ ID NO: 13)， antisense, 5，-GCT GTG CTG CCC AGA GGT T-3， (SEQ ID NO: 14);人ScZ-xZ-sense, 5，陽CAA CCC ATC CTG GCA CCT陽3， (SEQ ID NO: 15)， antisense, 5，-CGA TCC GAC TCA CCA ATA CC-3， (SEQ ID NO: 16);人^a^W-sense, 5，-GGG ACG CGA GTG TTC AAG AA-3， (SEQ ID NO: 17)， antisense, 5，- AC A AAC AGG TCC TTG CGA AAG-3 ， (SEQ ID NO: 18)。人5c/-2的 转录水平使用Tagman探针来完成的5c/-2-sense， 5，-CCT GTG GAT GAC TGA GTA CCT GAA-3， (SEQ ID NO: 19), antisense, 5'國CAG CCA GGA GAA ATC AAA CAG A-3， (SEQ ID NO: 20), Taqman探针，5'{AGG ATA ACG GAG GCT GGG ATG CCT TTf-3，(SEQ ID NO: 21)。
8.EAE的诱导和评估
在EAE诱导中使用的MOG抗原35-55位的氨基酸残基序列为Met-Glu-Val陽Gly陽Trp-Tyr陽Arg陽Ser-Pro-Phe-Ser陽Arg-Val-Val-His陽Leu-Tyr-Arg-Asn陽Gly-Lys。该肽 段是从BioAsia Biotechnology公司购得，其纯度大于95%。急性的EAE诱导是这 样进行的第一天，皮下注射含有300吗MOG肽段和5mg/ml热灭活的肺结核分 支杆菌H37Ra肽链(BD公司生产)的CFA,以及尾静脉注射200ng/小鼠的百日咳 毒素。第三天，再次尾静脉注射200ng/小鼠的百日咳毒素。诱导了EAE的小鼠每天 进行称量和病情观察。按照发病的严重程度对小鼠进行打分，具体是O,没有任何 病情的症状；l，尾巴无力；2，一条或两条后肢轻瘫；3,两后肢瘫痪；4,前肢轻瘫；5， 垂死或死亡。9. 细胞存活分析
T细胞养在无血清的RPMI 1640培养基中。按图上显示的时间点，用膜联蛋 白-V-FLUOS标记试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)通过排除PI和膜联蛋白 (annxin) V阳性的细胞得到存活细胞的百分比。在检测GFP阳性细胞存活的实验 中，单通过排除PI阳性的细胞得到存活细胞的百分比。
10. 组织化学观察
从诱导20天的EAE小鼠中取出组织，4%福尔马林固定，石蜡包埋。然后用 Luxol fast blue或者H&E进行染色。最后，用光学显微镜进行观察照相。共有3-4 只小鼠的脊髓，每只小鼠取3段样品进行脱髓鞘程度和感染程度的定量检测(34)。
11. 染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀(CHIP)是根据Upstate生物公司的CHIP试剂盒进行的9 在上样中和免疫沉淀复合物中特异基因启动子区的序列是通过qPCR来检测的。特 异基因启动子区引物的设计选在转录起始位点上游1000到下游500的碱基区域内。 所得到的结果是由沉淀中的量用上样量规一化得到。使用的基因启动子区和万c/-2 基因位点的引物有鼠5c/-2启动子sense, 5'-GGC AAA CCC TCC CCC ACC ACC TC-3， (SEQ ID NO: 22), antisense, 5，-CCA CCG GAC CGC TTC AGA CCT C-3， (SEQ ID NO: 23);鼠5ax启动子，sense, 5，-GGG GAA ACA ACC AAC TCT GG-3， (SEQ ID NO: 24), antisense 5，-CAT CAC TGC CGC TGC CTC T-3， (SEQ ID NO: 25);鼠 5c/-2基因位点u25,000 sense, 5，-GCT GTT TAT CAG TTA GTG GGT C-3， (SEQ ID NO: 26), antisense 5，-GGG TCA GAA GTG GGA GTG-3， (SEQ ID NO: 27); u20,000 sense, 5，-TGC CAA GGT TAG CAG GAC-3， (SEQ ID NO: 28)， antisense, 5，-CCA GAG GAC AAA TGA GGG-3' (SEQ ID NO: 29); ul5,000 sense, 5，-CAT TTG TCT GCC CTA TCT-3， (SEQ ID NO: 30)， antisense, 5，-TTA ACT GGG AAC ACC TCA-3， (SEQ ID NO: 31); ulO,OOO sense, 5，-AGT GCT TAT CGC TCT TCC-3， (SEQ ID NO: 32), antisense, 5'隱CTC CAA ACC TGA CCC TCT-3， (SEQ ID NO: 33); u5,000 sense, 5'陽GCA GCA AAC AAT CTT CAT-3' (SEQ ID NO: 34)， antisense, 5，-ACA CCA ATA CCA ACC CTA-3， (SEQ ID NO: 35); 50,000 sense, 5，-CCT TCT CAA TCA GCC AGC AT-3， (SEQ ID NO: 36), antisense, 5，-AAG CAA GCC TCC TCA CCC-3， (SEQ ID NO:
37) ; 100,000 sense, 5，-CAC TCA GAG AAG AAT TCA CAC AGA A-3， (SEQ ID NO:
38) ， antisense 5，-TTC TGT GTG AAT TCT TCT CTG AGT G-3， (SEQ ID NO: 39); 150,000 sense, 5，-CCC CAG AAC TCA TGT CTC-3， (SEQ ID NO: 40), antisense, 5，-TTC CAA TGC TCT CCC AAA-3' (SEQ ID NO: 41); 175,000 sense, 5，-CAG AGT GAG TAT TGG AGG AG-3' (SEQ ID NO: 42), antisense, 5'-AAA GAC AGT GGT GGG AAA-3， (SEQ ID NO: 43); 176,000 sense, 5，-TGA CCC TGA GGA GAT GGA-3， (SEQ ID NO: 44), antisense, 5，-GGT ATG ACC TGG GCT TCG-3， (SEQ ID NO: 45); 181,000 sense, 5,-AGG AGC AAA CTC AGG AAT-3' (SEQ ID NO: 46)， antisense, 5，-AGT CAC AAA GAT GGC AGA-3， (SEQ ID NO: 47); 186,000 sense, 5，-CAG ACG CAC CAC TGA TTT-3' (SEQ ID NO: 48), antisense, 5，-AGC AGC CAG CAG ACT TAC-3 ， (SEQ ID NO: 49); 191,000 sense, 5，-TAC GAG CGA TAC ATA CAA C陽3， (SEQ ID NO: 50), antisense, 5，-CTA GAG CCA GTC CTT CTT-3， (SEQ ID NO: 51). 人启动子区5c/-2 sense, 5，-GCG ACT CCT GAT TCA TTG-3， (SEQ ID NO: 52), antisense 5，-AGG TGC GTT TCC CTG TA-3， (SEQ ID NO: 53); Box sense, 5，-TAT CGG GAG ATG CTC ATT GGA-3' (SEQ ID NO: 54), antisense, 5，-CCC TCG GGA GGT TTG GTC-3， (SEQ ID NO: 55)。
12. 免疫印迹
在免疫印迹实验中，蛋白条带通过增强的化学发光方法检测。在一些实验中， 采用了IRDye800CW偶联二抗荧光定量的方法。这些实验中的图片由Odyssey远红 外图像系统(Li-CorBioscience公司)取得。
13. 细胞增殖实验
在细胞增殖实验中，5 x 10S的鼠脾脏细胞培养在含有MOG或不含MOG的 DMEM完全培养基中72小时。在进行细胞分析前16—18个小时的时候，加入lpCi 的[3H]胸苷。DNA中惨入的[3H]胸苷用(3板检测仪进行检测。
14. 细胞系
Jurkat和HEK293细胞是从American Type Culture Collection公司购得，并分 别在RPMI1640或者MEM (Gibco-BRL公司)培养液中进行培养。Jurkat细胞用 Amaxa的转染试剂盒进行转染，而HEK293细胞用磷酸钙的方法进行转染。
15. 细胞因子的检测
2 x 105的CD4+ T细胞如前所述用CD3和CD28抗体激活24小时，细胞上清 收集后根据PIERCE公司的使用指南用IL-2 ELISA试剂盒进行检测。同时，用纯 化并已知浓度的重组鼠IL-2做定量用的标准线。16. 细胞核组分的提取
细胞核组分按照以前的描述经过一些改动进行提取(27)。具体地用各种方
法处理后的细胞洗涤后重悬于400^1的低渗缓冲液中，冰浴10分钟。后加3|^10% 的NP-40混匀，继续冰浴5分钟。短暂离心后，所得沉淀即为细胞核组分粗提物。 该组分经洗涤，重悬于低渗缓冲液中4度摇晃1小时。再经离心，得到的上清即为 细胞核组分。
17. 报告基因实验
HEK293细胞中共转染Clontech公司的pNF-kappa-B-Luc或pCREB-TA-Luc， 和pRL-TK，以及一些图中所显示的质粒。转染36小时以后，用双荧光素酶报告分 析系统检测荧光素酶的活性。用10ng/ml毛喉素(FK)处理和10ng/ml rhTNF-a
处理的细胞作为实验的阳性对照。
18. 数据处理和统计
定量实验数据用平均数土s.e.m表示。用one-way ANOVA检测数据间是否有统 计学差异，然后再用Bonferroni post-hoc对多组数据或tow-tailed Student's f检测两
组数据间的显著性差异。
实验结果
1. parrl正调节外周血CD4+ T细胞的动态平衡和存活
在研究A^r/敲除(^厅,-)小鼠免疫系统的时候发现当小鼠在13周以后外 周淋巴系统中CD4+ T细胞的数量明显变少(图1A和2B)。 CD4+ T细胞的数量是由 胸腺中进入的CD4+ T细胞和外周CD4+ T细胞的凋亡来维持的。发明人检测了 y6^r,-小鼠和野生型(w。小鼠中胸腺细胞CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量，发 现并没有改变(图2C)。随后，发明人检测了外周血004+ T细胞的凋亡。从A^r产-小鼠，~〃/转基因(y^厅"g)小鼠和M小鼠脾脏分离得到CD4+T细胞，用抗-CD3 和抗-CD28抗体激活或者不激活,然后在无血清也无细胞因子的培养基中培养。图 1B和1C显示，激活了的;&wt/《CD4+ T细胞生存能力比其野生型明显增加，而 yferr,-的CD4+ T细胞无论是在其幼稚还是激活状态下都明显比其野生型对凋亡更 敏感。这些数据表明(3arrl促进CD4+T细胞体外的生存能力。
为了进一步表明体内的情况，发明人用SEB来注射小鼠。SEB在体内能特异 地激活CD4+ Vp8.1/2 T细胞而对CD4+ Vp6.1 T细胞没有影响(16)。如图ID和IE 所示各基因型的小鼠中，CD4+Vp8.1/2T细胞的数量在SEB注射三天后显著增加， 而在注射七天后有明显的下降。在此后的几天中观察到/3^r7,g的CD4+Vp8.1/2T细胞凋亡明显少于wf的，而^/^-/-小鼠的〔04+Vp8.1/2 T细胞凋亡比wf增多。这 些结果表明在体内Parrl也能促进CD4+T细胞的存活。IL-2是促进幼稚和激活的 CD4+T细胞的一个重要细胞因子(55-57)。当CD4+T细胞在体外激活后，它们产 生大量的IL-2 (1)。然而，如图3A所示yQbAT,-CD4+T细胞产生IL-2的能力比其 M要略强。因此，(3arrl不可能是通过影响CD4+T细胞IL-2的产生来调节这些细胞 存活的。
2.parrl促进BcI-2的表达
进一步研究了 (3arrl促进CD4+T细胞存活可能的分子机制。考虑到Akt(38) 和Erk (39)的激活能促进CD4+ T细胞存活，并且(3arrl本身能正调节Akt和Erk 的活性(20)，因此，研究了是否是由于Parrl上调Akt或Erk的活性从而促进CD4+ T细胞的存活能力。^w/;和M的CD4+T细胞如前所述那样在体外激活，用Akt 和Erk的磷酸化抗体来检测它们的活性。如图3B所示，在幼稚和激活了的CD4+T 细胞中，^厅,-并没有影响Erk的磷酸化水平；而Akt的磷酸化水平在激活状态下 的CDf T细胞中有所下降。因为，Parrl能同时促进幼稚和激活了的004+ T细胞 的存活，而Parrl并没有影响幼稚CD4+ T细胞中Akt和Erk的磷酸化水平，所以， 推测(3arrl促进CD4+ T细胞的存活还有其他的机制。Affymetrix基因芯片数据表明 通过siRNA抑制parrl的表达能降低抗凋亡分子Bc/-2的表达，但并不影响Bcl-2家 族其他蛋白的表达，如所m, 5ax和ScZ-x/等。在Jurkat T细胞中进一步验证了这 些结果(图4),并且发现是核内的parrl调控着5c/-2的表达，因为(3arr2和 (3arrlQ394L(Parrl不进核的突变体)(32， 40)并没有此功能。
Bcl-2是调节幼稚和激活T细胞存活的一个重要分子(1， 16)，因此进一步检 测了在CD4+ T细胞中Parrl和Bcl-2的表达情况丄04+ T细胞如上述方法激活以后， Parrl和Bcl-2的蛋白水平在前两天中逐步下降，而在激活后第三天升高并在随后保 持该水平(图5A)。当进一步在激活40到64小时这段时间内检测f3arrl和Bcl-2的 表达情况，发现Parrl蛋白水平的升高早于Bcl-2 (图5A)。是不是在CD4+T细胞 中，(3arrl调节着Bcl-2的表达呢？发明人同时激活A^r/《小鼠和M的CD4+ T细 胞，并检测(3arrl和的mRNA和蛋白水平。结果发现.'yftw^g小鼠来源的CD4+ T细胞在激活48小时后Parrl的水平明显比其野生型高，和此一致的是Sc/-2的 mRNA和蛋白水平也在该时间有显著升高(图5B)。当^w"和wf小鼠来源的CD4+ T细胞在体外激活后，万d-2的mRNA和蛋白水平在激活后没有变化并保持在野生 型里最低的水平(图5C)。在实验中发现，Parr2的蛋白水平也在CD4+T细胞激活 过程中有跟Parrl类似的变化。发明人在/5b/r2;的CD4+ T细胞检测了 的mRNA 和蛋白水平，发现5^-2表达正常(图5D)。这些结果表明(3arrl而不是Parr2调节着CD4+ T细胞中的表达，这可能是导致yft^,-和/5^r/g的CD4+ T细胞存活 能力异常的原因，因为这跟&/-2敲除和转基因的〔04+丁细胞存活能力很类似(18)。 因为在CD4+ T细胞激活过程中的mRNA和蛋白水平同时变化，所以发 明人用JurkatT细胞来证明Parrl是否通过影响^0/-2的转录来调节它的表达。和 图4 一致(图6A)，在Jurkat T细胞中过表达或用siRNA下调parrl能促进或抑制 石C/-2的mRNA和蛋白水平。进一步，发明人用转录抑制剂和蛋白合成抑制剂，发 现它们都能有效地抑制(3arrl对Bcl-2表达的上调(图6B和6C)。由此可见，Parrl是 通过促进5^/-2的转录来调节它的表达的。有报道发现CREB (41)禾n NF-kappaB (42)是影响5cW表达的转录因子。但发明人发现Parrl并不能在报告基因系统中 影响CREB禾口 NF-kappaB报告基因的活性(图6D和6E)。由此可见，f3arrl可能是 通过其他方式来调控表达的。
3. 卩arrl促进5c/-2基因座区组蛋白乙酰化水平
另一条(3arrl调控基因表达的方式是通过上调特异基因启动子区的组蛋白H4 的乙酰化水平(27)。在CD矿T细胞激活过程中，发明人发现5^/-2基因启动子区 的组蛋白H4乙酰化水平的变化模式和表达很相似(图7A)。 &/-2基因启动 子区的组蛋白H4乙酰化水平在CD4+ T细胞激活后逐渐下降，到48小时的时候达 到最低，随后到72小时的时候又上升。而作为组蛋白H4乙酰化水平的对照蛋白 H3乙酰化水平并没有改变。进一步发明人发现，禾叩arrl对表达影响一致， Parrl也影响着万d-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平。在Az"hg CD4+ T细 胞激活48时，基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平相对于野生型有显著的 升高(图7B)。而当^庁,-CD4+ T细胞激活后，5"-2基因启动子区的组蛋白H4 乙酰化水平一直保持在相当于野生型中最低的水平(图7C)。进一步，发明人发现 (3arrl影响着5c/-2基因座区从转录起始点上游lO,OOObp到下游186,000bp染色体区 的组蛋白H4乙酰化水平(图7D)。这些实验表明Parrl很可能是通过促进 基因座区组蛋白H4乙酰化水平来上调5cZ-2基因表达的。
4. p300在Parrl上调表达中的是必需的
细胞内组蛋白的乙酰化水平是由组蛋白去乙酰化酶和组蛋白乙酰化酶调控着 的。以前的研究发现parrl促进组蛋白H4的乙酰化水平是通过结合组蛋白乙酰化 酶p300 (43)并把它募集到特异基因的启动子区实现的(27)。因此，发明人检测 了p300在Parrl上调5cW表达中的作用。和前面结果一致的是在Jurkat细胞中， Parrl而不是parr2或(3arrlQ394L促进5c/-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平 (图8A)。进一步，发明人发现p300也能促进Sd-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平和mRNA水平，而且这种促进能被共表达(3arrl进一步加强而被共表达 yftwr/ siRNA所抑制(图8C和8E)。 p300DN (p300的无活性突变体)能显著降低 &/-2基因启动子区的组蛋白H4乙酰化水平和5cZ-2mRNA水平，并也能阻断parrl 对其的促进作用(图8C和8E)。这些结果显示p300在(3arrl介导的5^-2基因启动 子区H4乙酰化水平的升高和转录的增加中起重要作用。
5. Parrl在自身免疫病多发性硬化的作用
信号调控分子对CD4+ T细胞凋亡的精细调控能使CD4+ T细胞不至于产生自身 免疫性。考虑到Parrl在CD4+T细胞凋亡调控中的重要作用，发明人进一步研究其 是否会影响自身免疫。小鼠的EAE模型是多发性硬化(MS)的一个很好的动物模 型(44)。在该模型中，人们认为CD4+T细胞起了主导作用并且它的发病机理比较 清楚。发明人用MOG35-55来免疫三种不同基因型的小鼠，诱导其产生EAE。随后 观测20天如图9A所示，发现/5b厅/-〃小鼠的发病起始点比M小鼠有显著后延(M: 9.7±2.9天vs.戶wW;: 16.3±3.0天)并且病的严重程度也显著下降(最大平均病情评 分wt 3.2±0.27 vs. yft^,-: 1.4±0.4)。而在/5kwr/,g小鼠中，虽然发病起始点跟w〃J、 鼠没有显著差别(教9.7±2.9天vs. yfer^g: 8.7±0.8天)，但是病的严重程度却明显 增力卩(最大平均病情评分"fl〃"g:4.2士0.3vs.鍵3.2士0.2)。与此结果一致的是，当发 明人检测小鼠脊髓病变程度的时候发现，/5^W;小鼠的炎性细胞侵染和脊髓脱髓鞘 程度较轻；而Awhg小鼠却刚好相反(图9B)。这些数据表明(3arrl在这个EAE模 型中起着正调节的作用。因为，Parrl能促进CD4+T细胞的存活，是否该机制参与 到Parrl对自身免疫的正调控中了呢？发明人首先用MOG35-55来重新刺激EAE小 鼠的脾淋巴细胞，发现^whg小鼠脾淋巴细胞的增殖明显高于野生型的，而P『W-M、鼠的则较低(图9C)。进一步，发明人用MOG35-55重刺激EAE小鼠脾淋巴细 胞中纯化得到的MOG特异的CD4+ T细胞，并观察在细胞因子胁迫下这些CD4+ T 细胞的存活。和图1B和1C一致的是从/5^W,g小鼠来的MOG特异的CD4+T细 胞明显比野生型的存活能力强，而从y&厅,-小鼠中来的CD4+ T细胞存活能力则较 差(图9D)。这些结果表明Pairl在EAE模型中起着正调节的作用，这可能是由于 促进CD4+ T细胞的存活能力来实现的。
几年前，Annevroon和他的同事们发现在小鼠诱导EAE以后，parrl在外周血 中的水平显著升高了 (45)。发明人进一步发现从￡八6小鼠中来的004+ T细胞中 的Parrl的蛋白水平有显著升高(图IIA)。鉴于这些发现，发明人检测了f3arrl在多发 性硬化病人CD4+T细胞中的表达，如图10A和IOB所示多发性硬化病人CD4+T 细胞中^厅/和5c/-2的转录水平明显高于健康人。进一步，用带有^厅7siRNA的 逆转录病毒感染从多发性硬化病人来源的MBP特异的CD4+ T细胞(46)，发现Bcl-2的表达显著下调了 (图10C)。而当这些MBP特异的CD4+T细胞被感染带有A^/ siRNA的逆转录病毒后经受细胞因子胁迫时，这些细胞明显比感染了带有空载体的 逆转录病毒更易凋亡(图IOD)。这些结果表明，在多发性硬化病人中，针对自身抗 原的CD4+ T细胞有较高的A^r/表达水平，这可能促进了这些细胞的存活能力从而 使它们逃脱机体的监管机制促进多发性硬化的发展。
讨论
在哺乳动物中，免疫系统是体内最动态的系统之一。而免疫系统中免疫细胞的 调亡受很多胞外和胞内信号的调控以维持其正常的生理功能。Parrl是一个具有多种
功能的信号分子，参与很多信号通路的调节。此外，它还具有直接进核调控特异基 因转录的能力。发明人在本发明中发现，(3arrl能特异地调节CD4+T细胞的存活和 动态平衡，从而影响机体的获得性免疫应答。虽然，在激活的CD4+ T细胞中Akt 的活性受到一定抑制，但是，Parrl影响CD4+T细胞存活的这个能力主要还是通过 其核内功能实现的。在无论是幼稚的还是激活了的CD4+ T细胞核内，)3arrl上调 &/-2基因启动子区组蛋白H4乙酰化的水平，从而促进5cZ-2基因的表达。进一步 的研究发现(3arrl在自身免疫引起的脱髓鞘疾病和链唑霉素引起的I型糖尿病中起 着重要的作用。在自身免疫引起的脱髓鞘疾病中，那些特异致脑炎的CD4+T细胞 中/3brW的高表达促进这些细胞在体内的存活能力。因此，发明人的结果表明，|3arrl 在CD4+T细胞存活以及人和鼠的自身免疫疾病中起着重要的调节作用。
细致的机制分析发现J3arrl在CD4+T细胞中对表达的调控是通过影响 表观遗传修饰来实现的。Bcl-2是通过调控线粒体膜的完整性和存在于线粒体中促调 亡蛋白的释放来调节细胞存活的(12)。在T细胞中，Bcl-2必须维持在适当的水平， 否则就会引起T细胞动态平衡的打破和免疫应答的混乱。然而到目前为止，对于 Bd-2在T细胞中的调控机制，人们还不是很清楚。发明人发现不管在幼稚的还是 激活的004+ T细胞中，parrl促进&/-2基因区组蛋白乙酰化的水平和&/-2基因 的转录水平。也发现f3arrl在CD4+T细胞中的这种功能在人和鼠中是保守的。因此， 这些实验在揭示了一个新颖的调控CD4+T细胞存活的机制以外，还发现了一种调 节基因表达的表观遗传机制。而这种机制以前是没有被报道过的。
在这个研究中，(3arrl促进T细胞的存活功能主要针对于外周血的CD4+而不 是008+ T细胞或是胸腺T细胞。在胸腺T细胞中，如图2A中显示的那样(3arrl 的表达水平明显要低于其在脾脏细胞或是淋巴结细胞的表达水平。这种表达水平的 差异可能是导致Parrl在胸腺T细胞中作用小的原因。然而，从图11B中可以看到， Parrl表达水平在CD4+和CD8+T细胞中的差异不是很明显。但是，(3arrl对CD4+和 CD8+ T细胞存活的影响却有显著的差异。和野生型细胞比较，A^r^CDf T细胞的存活能力显著降低，而/5b庁,-CD8+T细胞却没有明显差别。细致的机制显示是 核内的f3arrl上调了 5c/-2基因区组蛋白的乙酰化水平和其转录水平，因为过表达 Parrl的不进核内突变体ParrlQ394L并不影响5c/-2的表达。因此，发明人猜想是否 (3arrl在004+和CD8+T细胞的亚细胞定位有区别。如图IIC和IID所示，不论在 幼稚的还是激活的CD4+T细胞中，Parrl在核内的表达水平都比CD8+T细胞的高。 因此，可能是(3arrl在CD4+和CD8+T细胞中亚细胞水平分布的不一样导致了(3arrl 对CD4+和CD8+ T细胞存活影响的不一样。
以前的研究表明当GPCR激活以后，Parrl和Parr2被招募到细胞膜上；在那 里它们和磷酸化的GPCR结合引起受体的内吞和信号的终止(47)。然而，现在越 来越多的证据表明这两个f3arr在功能上和受体的特异性上有很多差别。在发明人这 个研究中，(3arrl而不是(3arr2促进基因区的乙酰化水平和其转录水平。发明 人的这个结果和先前的结论是一致的(27)，这可能是这两个(3arr在亚细胞水平的分 布上不一样导致的。虽然，在此功能上这两个l3arr不一样，但是，从动物水平来看 它们都能调控免疫反应。在这个研究中，发明人发现(3arrl能促进CD4+T细胞的存 活和自身免疫；而另一个早先的研究表明，(3arr2敲除的小鼠在哮喘模型实验中其症 状明显低于野生型小鼠，而这可能是由于Parr2影响了免疫细胞的迁移导致的。从这 些结果可以看出虽然l3arrs影响的细胞机制不一样，但都在免疫系统中起着促进免 疫反应的功能。
发明人实验室最近的研究表明Parrl具有在核内直接调控基因转录的功能； 而该功能是受一些GPCRs影响的(27)。另外，在体外激活的CD4+T细胞中，Nguyen K.和Miller B.C.发现有delta阿片受体(DOR)的表达(48)。有趣的是，发明人 在体外的实验中发现:DOR的激活能)3arrl依赖地上调5c/-2的表达。这些数据显示， (3arrl可能作为一个重要的信号调节分子介导外界促进CD4+ T细胞存活的信号从 而影响获得性免疫应答。考虑到(3arrl在CD4+T细胞中内在的生理功能，这些结果 不仅揭示了在正常生理条件下调节免疫系统的一种机制，也为自身免疫病如多发性 硬化提供了一种可能的治疗靶点。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显 的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此， 所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专 利和专利申请均纳入本文作参考。
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<400> 55
ccctcgggag gtttggic 18
权利要求
1.β抑制蛋白1的抑制剂在制备药物中的用途，其特征在于，所述β抑制蛋白1的抑制剂选自(i)抑制β抑制蛋白1活性的物质；(ii)抑制编码β抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质，所述药物用于治疗或预防哺乳动物对象的与CD4+T细胞凋亡异常相关的疾病。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制(3抑制蛋白1活性的物质选 自放线菌素、放线菌酮或P抑制蛋白1的特异性抗体。
3. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述抑制编码(3抑制蛋白l的基因转 录、翻译或这两者的物质是小干扰RNA、 (3抑制蛋白l的编码基因全部或部分序列的 反义序列或核酶。
4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制编码P抑制蛋白1的基因转 录、翻译或这两者的物质负载于载体内。
5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述载体选自逆转录病毒载体、慢 病毒载体、腺病毒载体或DNA病毒载体。
6. 如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物是人。
7. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述与CD4+T细胞凋亡异常相关 的疾病选自自身免疫疾病或淋巴细胞增多症。
8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述自身免疫疾病选自类风湿关节 炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、多发性硬化症、重症肌无力、脱髓鞘疾病、 原发性肾上腺皮质萎縮、慢性甲状炎、I型糖尿病、慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢 性活动性肝炎、恶习性贫血与萎縮性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合 症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症。
9. 一种用于治疗或预防对象的与004+T细胞凋亡异常相关的疾病的药物组合 物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的P抑制蛋白1的抑制剂作为活性组分， 以及药学上可接受的载体，其中所述P抑制蛋白l的抑制剂选自(i)抑制(3抑制蛋白l活 性的物质；(ii)抑制编码(3抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质。
10. —种从候选物质中筛选出用于治疗或预防与CD4+T细胞凋亡异常相关的疾 病的药物的方法，该方法包括-a) 使所述候选物质与表达P-抑制蛋白1的细胞接触；b) 鉴定(3-抑制蛋白l在所述细胞的细胞核内的表达水平，并将该表达水平与未接 触所述候选物质的细胞的细胞核内(3-抑制蛋白1表达水平相比较；C)选出使细胞核内P-抑制蛋白1表达水平降低的物质作为治疗或预防与CD4+ T 细胞凋亡异常相关的疾病药物。
全文摘要
本发明涉及β-抑制蛋白1在调节T细胞存活和自身免疫中的应用。具体地说，本发明涉及β抑制蛋白1的抑制剂在制备药物中的用途，所述β抑制蛋白1的抑制剂选自(i)抑制β抑制蛋白1活性的物质；(ii)抑制编码β抑制蛋白1的基因转录、翻译或这两者的物质，所述药物用于治疗或预防哺乳动物对象的与CD4⁺T细胞凋亡异常相关的疾病。
文档编号A61P21/04GK101318012SQ200710041559
公开日2008年12月10日 申请日期2007年6月4日 优先权日2007年6月4日
发明者施裕丰, 臧敬五, 钢 裴 申请人:中国科学院上海生命科学研究院