Fgf-r4受体特异性拮抗剂的制作方法

专利名称：Fgf-r4受体特异性拮抗剂的制作方法
FGF-R4受体特异性拮抗剂本发明的主题是对FGF受体4(FGF_R4)特异性的拮抗剂，使得它有可能抑制这种 受体的活性。这些拮抗剂特别是对FGF受体4(FGF-R4)特异性的抗体。本发明的主题还有这些拮抗剂的治疗用途，特别是在血管发生领域中及在某些类 型的癌症的治疗中。FGF(成纤维细胞生长因子)是最早记载为能够在体外和在体内刺激血管细胞增 殖，迁移和分化的分子之一。有大量的文献描述FGF在体外和在体内对血管发生和毛细血 管形成的诱导。通过促进由肿瘤募集的血管形成，FGF还涉及肿瘤血管发生。人FGF家族包括至少23个成员，它们都具有保守的120个氨基酸的中央域。它们 如下发挥它们的生物学活性，即与它们的酪氨酸激酶型高亲和力受体(FGF-R)和硫酸类肝 素蛋白聚糖(即在大多数细胞表面和细胞外基质上存在的成分)(低亲和力结合位点)相 互作用，从而形成三元复合物。有些FGF具有对数种FGF-R的高亲和力，而其它特异性活化 一种受体或一种受体同等型。FGF-R4特异性配体已经由Xie等人(Cytokine, 1999，11 =729-35)鉴定。这种称 作FGF19的配体是专门对FGF-R4具有高亲和力的配体，而且它对受体的结合是肝素依赖性 的或硫酸类肝素依赖性的。FGF19已经在成年动物中鉴定到，只在肝细胞和小肠中，它在那 里调节肝对胆汁酸的合成。它表现为胚胎发育期间涉及的生长因子，而且表现为涉及斑马 鱼和人类中的胎脑发育。其它FGF-R4配体也有记载，诸如FGF1或FGF2。这些配体强烈活化FGF-R4，但 是不是FGF-R4特异性的它们也结合其它FGF-R(Ornitz等，J. Biol. Chem. ,1996,271 15292-7)。FGF-R4受体的活化导致数种类型的细胞信号传导。其中，最常规的形式对应于 FGF刺激FGF-R4后由磷酸化级联介导的信号传导途径的建立。此诱导导致FGF-R4的酪氨酸 激酶域的自磷酸化，并用来启动依赖其它信号传导蛋白(诸如AKT，p44/42，JNK等)磷酸化 的细胞内信号传导途径。此磷酸化介导的信号传导随细胞类型和这些细胞的表面处存在的 共同受体或粘附分子而变化(Cavallaro 等，Nat. Cell Biol. 3/7，650-657，2001 ；Stadler 等，Cell. Signal. 18/6，783-794，2006 ;Lin 等，J Biol Chem.，14 :27277_84，2007)。对于 FGF-R(包括FGF-R4)重要的另一种信号传导方法是受体在活化后与它的配体一起内化。此 机制不依赖于受体的酪氨酸激酶活性，但是依赖于FGF-R4的短C端序列(Klingenberg等， J.Cell Sci. ，113/PtlO :1827-1838,2000)。文献中记载了四种不同形式的FGF-R4。全长形式在位置388处有2种多态变体，即 FGF-R4Gly388，它是受体的正常形式，和Arg388形式，它记载于数种肿瘤的背景中(Bange 等，Cancer Res. 62/3，840-847，2002 ;Spinola 等，J Clin Oncol 23，7307-7311，2005 ； Stadler等，Cell. Signal. 18/6，783-794，2006)。还发现了在乳腺肿瘤细胞中表达的可溶 形式(Takaishi 等，BiochemBiophys Res Commun. ,267 :658-62,2000) 已经在某些垂体 腺瘤中记载了在细胞外部分中截短的第四种形式(Ezzat等，J Clin Invest. , 109 =69-78, 2002)。
FGF-R4主要在自内胚层衍生的组织(诸如胃肠道，胰，肝，肌肉和肾上腺)中表达。在文献中已知FGF-R4具有数种细胞作用，下面描述主要的三项第一，这种受体涉及在体外和在体内控制多种细胞分化过程，诸如骨骼肌分化和 再生、间充质组织分化、或骨发生，或另外涉及出生后肝发育期间的肝泡(alveoli)形成。第二，FGF-R4记载于控制胆汁酸和胆固醇稳态，而且认为涉及控制脂肪过多。另 外，在体外和在体内胆汁酸生成和胆固醇生成之间的平衡受FGF-R4控制。第三，FGF-R4涉及某些肿瘤现象，诸如肝细胞癌瘤或结肠癌发生，或乳腺纤维腺 瘤细胞或乳腺癌上皮细胞增殖，诸如乳腺或结肠直肠癌瘤细胞运动。FGF-R4在肿瘤中的 作用主要与多态性(Gly388Arg)的出现有关，所述多态性与乳腺和结肠直肠肿瘤(Bange 等，Cancer Res. 62/3，840-847，2002)、前列腺肿瘤(Wang 等，Clin. Cancer Res. 10/18， 6169-6178,2004)或肝肿瘤(Nicholes 等，Am. J. Pathol. 160/6，2295-307，2002)中肿瘤进 展的加速有关。此多态性还与肉瘤(Morimoto等，Cancer 98/10，2245-2250，2003)、肺腺 癌(Spinola 等，J Clin Oncol 23，7307-7311，2005)或鳞状肉瘤(da CostaAndrade 等， Exp Mol Pathol 82，53_7，2007)病例中的预后差有关。FGF-R4的过表达还记载于某些胰腺 癌系(Shah等，Oncogene 21/54，8251-61，2002)，而且与星形细胞瘤恶性有关(Yamada等， Neurol. Res. 24/3,244-8,2002)。另外，在结肠肿瘤异种移植物体内模型中或在肝细胞癌瘤 模型中使用抗FGF19单克隆抗体显示出FGF19的失活，而且因此阻断FGF-R4活化在结肠或 肝癌治疗中可能是有益的。文献中公认FGF/FGF-R1和FGF/FGF-R2对参与正常或病理背景中的新血管形成。 然而，从未研究FGF-R4在控制这种细胞现象中的潜在作用。事实上，直到现在才提出血管 发生的活化是由 FGF-Rl 和 / 或FGF-R2 介导的(Presta 等，Cytokine Growth Factor Rev., 16 :159-78,2005)。文献中记载了 FGF-R4拮抗剂的例子，特别是小分子，但是它们不是特异性靶 向FGF-R4的，如此导致不良作用。如此，Thompson等人(Thompson等，J Med Chem. ,43 4200-11,2000)记载了抑制数种FGF-R和还有其它受体酪氨酸激酶的酪氨酸激酶域抑制性 化学小分子。申请W02007/080325中也记载了通过与FGF-R细胞外部分结合来抑制FGF-R 的化学小分子。还研究了抗体，诸如国际申请W02005/066211和W02008052796或Chen等 人(Hybridoma 24/3，152-159，2005)中记载的抗 FGFRl 和 / 或抗 FGFR4 抗体。申请 W02005/037235记载了作为FGF-R拮抗剂的抗体，其用于治疗肥胖症和糖尿病。另外，申请 W003/063893中记载了作为激动剂的抗FGF-R4抗体。本发明的主题是FGF-R4受体拮抗剂，其特征在于它特异性结合所述FGF-R4受体。有利地，所述拮抗剂是对FGF-R4受体特异性的抗体。在一个实施方案中，作为本发明主题的拮抗剂结合FGF-R4受体的D2-D3域。在一 个有利的实施方案中，作为本发明主题的拮抗剂结合FGF-R4受体的D2域。在一个甚至更 有利的实施方案中，所述拮抗剂结合序列SEQ ID No. 70。有利地，FGF-R4受体特异性拮抗剂具有通过Biacore技术测定的小于10_8M的、小 于5x1 O^9M的、小于2χ1(Γ9Μ的或小于Ix KT9M的关于FGF-R4受体的KD。在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂对人FGF-R4和鼠FGF-R4都
5有活性。在另一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂同时对人FGF-R4，小鼠 FGF-R4和大鼠FGF-R4有活性。在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含至少一个CDR，该 CDR 具有与 SEQ ID No. 9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90，93， 94，95，98，99，100，103，104，105，108，109 或 110 相同的序列，或包含至少一个 CDR,该 CDR 的序列与序列 SEQ ID No. 9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90， 93，94，95，98，99，100，103，104，105，108，109或110相比相差一个或两个氨基酸，前提是该 抗体保留其结合特异性。在一个特别有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列为SEQ ID No. 9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90，93，94，95，98，99，100， 103，104，105，108，109或110的CDR或序列与上述序列相比相差一个或两个氨基酸的⑶R， 前提是这不改变抗体的FGF-R4受体结合特异性。在一个有利的实施方案中，本发明的抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，所 述重链包含氨基酸序列选自下组的三个⑶R序列SEQ ID似.9、10和11;或73、74和75; 或83、84和85 ；或93、94和95 ；或103、104和105 ；所述轻链包含氨基酸序列选择下组的三 个 CDR 序列SEQ ID No. 12、13 和 14 ；或 78、79 和 80 ；或 88、89 和 90 ；或 98、99 和 100 ；或 108,109 和 110。在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体的重链可变区包含与序 列 SEQ ID No. 6，77，87，97 或 107 具有至少 80%，90%，95%或 99% 同一性的序列。在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体的轻链可变区包含与序 列 SEQ ID No. 8，72，82，92 或 102 具有至少 80%，90%，95%或 99% 同一性的序列。本发明的主题还有包含如下重链的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，所述重链包 含由与序列SEQ ID No. 5，76，86，96或106具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列编码的可变区。本发明的主题还有包含如下轻链的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，所述轻链包 含由与序列SEQ ID No. 7，71，81，91或101具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列编码的可变区。本发明的主题还有包含如下重链的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，所述重链包 含多肽序列SEQ ID No. 6，77，87，97或107的可变区。本发明的主题还有包含如下轻链的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，所述轻链包 含多肽序列SEQ ID No. 8，72，82，92或102的可变区。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，其包含由核苷酸序列 SEQ ID No. 5和7，或71和76，或81和86，或91和96，或101和106编码的序列。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，其包含多肽序列SEQ ID No. 6 和 8，或 72 和 77，或 82 和 87，或 92 和 97，或 102 和 107。在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含与SEQID No. 2和 / 或 SEQ ID No. 4 ；或 SEQ ID No. 72 和 / 或 SEQ ID No. 77 ；或 SEQ IDNo. 82 和 / 或 SEQ ID No. 87 ；或 SEQ ID No. 92 和 / 或 SEQ ID No. 97 ；或 SEQ IDNo. 102 和 / 或 SEQ ID No. 107 至少80%，90%，95%或99%相同的序列。在一个特别有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含由与序列SEQ ID No. 1至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列编码的重链。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体拮抗剂抗体，其包含与序列SEQID No. 2至 少80%，90%，95%或99%相同的多肽序列的重链。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，其包含由与序列SEQ ID No. 3至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列编码的轻链。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，其包含与序列SEQ ID No. 4至少80%，90%，95%或99%相同的多肽序列的轻链。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，其包含由核苷酸序列 SEQ ID No. 1和3编码的序列。在一个甚至更有利的实施方案中，FGF-R4特异性拮抗剂抗体包含如下的重链和轻 链，所述重链包含序列SEQ ID No. 2且所述轻链包含序列SEQ IDNo. 4。由序列SEQ ID No. 2作为重链和序列SEQ ID No. 4作为轻链构成的抗体在本申请 的剩余部分中会称作40-12。在本发明的一个实施方案中，FGF-R4特异性抗体同时对人FGF-R4，小鼠FGF-R4和 大鼠FGF-R4有活性。在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂诱导对AKT/p38细胞途径的 抑制。在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂诱导对Erkl/2细胞途径的 抑制。在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂诱导对受FGF-R4控制的细 胞信号传导途径的抑制。在另一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂诱导对肿瘤细胞增殖的抑 制。在又一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂诱导对血管发生的抑制。在另一个特别有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂对FGF-R4的亲和力 比它对其它FGF受体的亲和力大10倍。在一个特别有利的实施方案中，依照本发明的抗体是FGF-R4受体特异性人源化 拮抗剂抗体。在一个实施方案中，FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体包含可变区由与序列 SEQ ID No.四或序列SEQ ID No. 31至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列编码的 轻链。在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体包含可变区与序列 SEQ ID No. 30 或序列 SEQ ID No. 32 至少 80%，90%，95%或 99%相同的轻链。在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体包含可变区由与核苷 酸序列SEQ ID No. 29或序列SEQ ID No. 31相同的序列编码的轻链。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体，其包含可变区 由与序列 SEQ ID No. 33，序列 SEQ ID No. ；35 或序列 SEQ ID No. 37 至少 80%，90%，95%或
799 %相同的序列编码的重链。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体，其包含可变区 与序列 SEQ ID No. 34，序列 SEQ ID No. 36 或序列 SEQ ID No. 38 至少 80%，90%，95%或 99%相同的重链。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体，其包含由核苷 酸序列SEQ ID No. 33和/或SEQ ID No. ；35和/或SEQ ID No. 37编码的重链。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体，其中序列SEQ ID No. 30或32的人源化序列与序列SEQ ID No. 34，36或38的人源化序列组合使用。在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列SEQ IDNo. 73，74， 75，78，79和80的⑶R或序列与上述序列相比相差一个或两个氨基酸的⑶R，前提是这不改 变抗体的FGF-R4受体结合特异性。在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列SEQ IDNo. 83，84， 85，88，89和90的⑶R或序列与上述序列相比相差一个或两个氨基酸的⑶R，前提是这不改 变抗体的FGF-R4受体结合特异性。在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列SEQ IDNo. 93，94， 95，98，99和100的⑶R或序列与上述序列相比相差一个或两个氨基酸的⑶R，前提是这不 改变抗体的FGF-R4受体结合特异性。在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列SEQ IDNo. 103， 104，105，108，109和110的⑶R或序列与上述序列相比相差一个或两个氨基酸的⑶R，前提 是这不改变抗体的FGF-R4受体结合特异性。在本发明的一个优选的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列SEQ ID No. 83，84，85，88，89 和 90 的 CDR。在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体是人抗体，其重链可变 区包含与序列SEQ ID No. 76，86，96或106具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列。在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体是人抗体，其轻链可变 区包含与序列SEQ ID No. 71，81，91或101具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列。本发明的主题还有包含如下重链的FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体，所述重链 包含由与序列SEQ ID No. 77，87，97或107具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列编码的可变区。本发明的主题还有包含如下轻链的FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体，所述轻链 包含由与序列SEQ ID No. 72，82，92或102具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷 酸序列编码的可变区。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体，其包含由核苷酸序 列SEQ ID No. 71和76或核苷酸序列SEQ ID No. 81和86或核苷酸序列SEQ ID No. 91和 96或核苷酸序列SEQ ID No. 101和106编码的序列。本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体，其包含多肽序列SEQ ID No. 72和77或多肽序列SEQ ID No. 82和87或多肽序列SEQ IDNo. 92和97或多肽序列SEQ ID No 102 和 107。在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含与SEQID No. 72和 /或SEQ ID No. 77至少80%，90%，95%或99%相同的序列。在另一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体包含与SEQ ID No. 82 和 / 或 SEQ ID No. 87 至少 80%，90%，95%或 99%相同的序列。在另一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体包含与SEQ ID No. 92 和 / 或 SEQ ID No. 97 至少 80%，90%，95%或 99%相同的序列。在另一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体包含与SEQ ID No. 102 和 / 或 SEQ ID No. 107 至少 80%，90%，95% 或 99%相同的序列。在一个优选的实施方案中，本发明的主题是如下的FGF-R4受体特异性人拮抗剂 抗体，其包含由与序列SEQ ID No. 82至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列编码 的轻链和包含与序列SEQ ID似.87至少80%，90%，95%或99%相同的多肽序列的重链。甚至更优选地，本发明的主题是如下的FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体，其包含 有核苷酸序列SEQ ID No. 82和87编码的序列。由序列SEQ ID No. 77作为重链和序列SEQ ID No. 72作为轻链构成的抗体在本申 请的剩余部分中会称作克隆8。由序列SEQ ID No. 87作为重链和序列SEQ ID No. 82作为轻链构成的抗体在本申 请的剩余部分中会称作克隆31。由序列SEQ ID No. 97作为重链和序列SEQ ID No. 92作为轻链构成的抗体在本申 请的剩余部分中会称作克隆33。由序列SEQ ID No. 107作为重链和序列SEQ ID No. 102作为轻链构成的抗体在本 申请的剩余部分中会称作克隆36。本发明的范围不限于包含这些序列的抗体。事实上，所有特异性结合FGF-R4的对 这种受体具有拮抗作用的抗体都是本发明的范围的一部分。本发明的主题还有偶联至细胞毒剂的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体。本发明的一个主题是FGF-R4受体特异性拮抗剂在治疗与血管发生有关的疾病中 的用途。本发明的一个主题是FGF-R4受体特异性拮抗剂在治疗癌症中的用途。本发明的一个主题是FGF-R4受体特异性拮抗剂在治疗肝癌瘤 (hepatocarcinomas)或任何其它类型肝癌中的用途。本发明的一个主题是FGF-R4受体特异性拮抗剂在治疗胰腺癌中的用途。本发明的一个主题是如下的FGF-R4受体特异性抗体，其供治疗与血管发生有关 的疾病和治疗肝癌瘤或任何其它类型肝癌二者使用。本发明的一个主题是如下的FGF-R4受体特异性抗体，其供同时治疗与血管发生 有关的疾病，治疗肝癌瘤或任何其它类型肝癌，及治疗胰腺癌，或表达FGF-R4的胃肠道器 官或任何其它器官的癌症使用。本发明的一个主题是包含FGF-R4受体特异性拮抗剂和赋形剂的药物组合物。本发明的一个主题是治疗癌症的方法，包括给患者施用FGF-R4受体特异性拮抗 剂抗体。
本发明的一个主题是治疗与血管发生病理性升高有关的疾病的方法，包括给患者 施用FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体。本发明的一个主题是选择FGF-R4受体特异性拮抗剂单克隆抗体的方法，其包括 下面的步骤a.给小鼠免疫接种，b.自小鼠取出淋巴结，并c.筛选杂交瘤上清液。本发明的一个主题是生成FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体的细胞系。本发明的一个主题是生产FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体的方法，其包括培养生 成FGF-R4受体拮抗剂抗体的细胞系。本发明的一个主题是包含FGF-R4受体特异性拮抗剂的药物。本发明的主题还有编码选自下组的多肽的多核苷酸SEQ ID No. 2，4，6，8，9，10， 11，12，13，14，30，32，34，36，38，72，73，74，75，77，78，79，80，82，83，84，85，87，88，89，90， 92,93,94,95,97,98,99,100，102，103，104，105，107，108，109 和 110，以及与这些序列之一 至少80%，90%，95%或99%相同的序列。本发明的一个主题是包含如上所述多核苷酸或编码如上所述多肽的重组载体。为了能够表达作为本发明的一个主题的FGF-R4受体拮抗剂抗体的重链和/或轻 链，将编码所述链的多核苷酸插入表达载体。这些表达载体可以是质粒，YAC，粘粒，逆转录 病毒，EBV衍生附加体，和本领域技术人员认为适合于表达所述链的任何载体。本发明的一个主题是包含如上所述重组载体的宿主细胞。发明详述本发明的一个主题是对FGF-R4特异性(与FGF-Rl、R2或R3不起交叉反应)的抗 体用于抑制血管发生和肿瘤生长的用途。出乎意料地，本发明显示了 FGF-R4在控制血管发生中发挥积极的且特异性的作用。先前从未显示或提出FGF-R4的这种功能。因此，这种受体可用作治疗展现血管发 生失调的病理的靶物。因此，能够调控所述受体的活性的FGF-R4配体是众多血管发生相关 病理的潜在治疗剂。因此，本发明可用于治疗所有涉及血管发生失调及需要抑制血管发生的病理。所 涵盖的病理可以是癌症(其中依照本发明的拮抗剂用作肿瘤血管发生抑制剂)或记载有 血管发生失调的病理，诸如老年性黄斑变性或ARMD，炎性疾病诸如类风湿性关节炎、骨关节 炎、结肠炎、溃疡或肠的任何炎性疾病，动脉粥样硬化或肥胖症的治疗。在抑制肿瘤生长中也例示了这些抗体的用途。因此，依照本发明的拮抗剂可用于 治疗某些涉及FGF-R4失调的癌症，更特别地是肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺 癌、皮肤癌或食管癌。依照本发明的拮抗剂的主要优点之一在于特异性针对FGF受体中的FGF-R4。这种 特异性使之有可能限制抑制酪氨酸激酶域的化学小分子可能具有的不良作用。另外，由于 FGF-R4不是遍在表达的，而是具体地在内皮细胞上表达，例如肝细胞、胆囊细胞、乳腺细胞、 前列腺细胞、卵巢细胞、胰腺细胞或肾细胞，因此这提供了在限制副作用的情况中治疗涉及FGF-R4活性失调的疾病的方法。术语“拮抗剂”指任何能够降低或完全抑制FGF-R4活性的配体。因此，这种拮抗 性化合物也称作FGF-R4抑制剂。这种拮抗剂可以是任何FGF-R4配体，诸如嵌合分子、重组蛋白、寡糖、多糖、寡核 苷酸或抗体，其能够特异性结合FGF-R4受体，但排斥任何其它FGFR。因此，本发明的一个主题是FGF-R4特异性拮抗剂。依照本发明，特异性结合 FGF-R4的拮抗剂指不结合其它FGF受体(即FGF-Rl、FGF_R2或FGF-R； )的配体。特别地， FGF-R4特异性抗体指不展现与FGF-Rl、FGF-R2或FGF-R3的任何交叉反应的抗体。“特异性结合”指对一种受体的结合强度与另一种受体相比(在本案中指对 FGF-R4的结合与对FGF-Rl、FGF-R2或FGF-R3的可能的结合之间)相差至少10倍。在本发明的一个实施方案中，FGF-R4配体是寡糖或多糖。“寡糖”指任何含有3个至10个单糖单元的糖聚合物。存在天然寡糖(诸如例如 果糖寡糖(FOS))和合成寡糖(诸如例如肝素模拟物抗血栓药)。术语“多糖”指任何由通过糖苷键彼此连接的超过10个单糖构成的聚合物。存 在天然多糖(诸如例如粘多糖、岩藻多糖(fucoids)、角叉菜胶或细菌表多糖)，正如合成 多糖。如此，低分子量岩藻多糖(fucoidans)或高硫酸化表多糖(exopolysaccharide)显 示出促血管发生活性(Chabut 等，Mol Pharmacol.，2003，64 :696-702 ；Matou 等，Biochem Pharmacol. ,2005,69 :751-9)。相反，肝素衍生的低硫酸化寡糖或硫酸磷酸甘露戊糖可具有 抗血管发生特征(Parish 等，1999，15 :3433-41 ；Casu 等，J Med Chem.，2004，12 :838-48)。在本发明的一个实施方案中，FGF-R4配体是抗体。术语“抗体”指任何类型的抗体或衍生分子，诸如多克隆和单克隆抗体。自单克 隆抗体衍生的分子包括人源化抗体、人抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、抗体片段、纳米抗体寸。在本发明的一个实施方案中，FGF-R4特异性拮抗剂是多克隆抗体。“多克隆抗体”指如下的抗体，其是自源自数个B淋巴细胞克隆且识别一系列不同 表位的抗体混合物生成的。在一个有利的实施方案中，FGF-R4特异性拮抗剂是单克隆抗体。“单克隆抗体”指如下的抗体，其是自衍生自单一类型B淋巴细胞的、克隆扩增的基 本上同质的抗体群获得的。除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外，构成这种群 体的抗体是相同的。这些抗体针对单一表位，因此是高度特异性的。术语“表位”指抗原上抗体所结合的位点。如果抗原是聚合物(诸如蛋白质或多 糖)，那么表位可以由连续的或不连续的残基构成。在本发明的一个有利的实施方案中，抗FGF-R4拮抗剂抗体结合属于TOF-R4受体 D2-D3域的表位。在一个甚至更有利的实施方案中，所述抗体结合FGF-R4受体的包含氨基酸144至 365的域中包括的表位。在一个甚至更有利的实施方案中，所述抗体结合FGF-R4受体D2域中包括的表位， 此表位对应于序列SEQ ID No. 70中描述的氨基酸145至M2。抗体(也称作免疫球蛋白)由通过二硫桥连接的两条相同的重链(“VH”)和两条相同的轻链(“VL”)构成。每条链含有恒定区和可变区。每个可变区包含三个称作“互补 决定区”(“CDR”)或“高变区”的区段，它们主要负责对抗原的表位的结合。术语“VH”指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab，或 F(ab)，片段的重链。术语“VL”指抗体的免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab，或 F(ab)’片段的轻链。术语“抗体片段”指所述抗体的任何部分Fab(抗原结合片段)，Fv，scFv(单链 Fv)，Fc(可结晶片段)。优选地，这些功能性片段会是Fv、SCFV、Fab、F(ab' )2、Fab'、 scFv-Fc或双抗体类型的片段，它们一般具有与衍生它们的嵌合或人源化单克隆抗体相同 的结合特异性。依照本发明，本发明的抗体片段可通过下述得自嵌合或人源化单克隆抗体， 诸如用酶消化，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶，和/或通过化学还原来切割二硫桥。术语“CDR区或 CDR” 意图指如 Kabat 等(Kabat 等，kquences of proteinsof immunological interest,第 5 版，U. S. Department of Health and HumanServices, NIH, 1991，及后来的版本)定义的免疫球蛋白重链和轻链高变区。有3个重链CDR和3个轻链 ⑶R。术语⑶R在本文中在适当时用于指这些区中的一个或多个或者甚至所有这些区，它们 含有负责抗体对它所识别的抗原或表位的亲和力结合的大多数氨基酸残基。可变域中最保 守的区称作FR( “框架”)区或序列。在本发明的另一个实施方案中，FGF-R4特异性拮抗剂是嵌合抗体。术语“嵌合抗体”指如下的抗体，其中恒定区或其部分发生改变、替换或交换，使得 可变区连接至不同物种的或属于另一抗体类或亚类的恒定区。术语“嵌合抗体”也指如下的抗体，其中可变区或其片段发生改变、替换或交换，使 得恒定区连接至不同物种的或属于另一抗体类或亚类的可变区。用于生成嵌合抗体的方法是本领域技术人员已知的。参见例如Morrison，1985， Science, 229 1202 ；Oi 等，1986，Bio Techniques, 4 214 ；Gillies 等，1989，J. Immunol. Methods, 125 :191-202 ；美国专利 No. 5，807，715 ；4，816，567 ；和 4，816，397。这些嵌合型式的抗体可包含VL和VH可变区与人起源的Ck和CH(IgGl)恒定域 的融合物，从而生成嵌合单克隆抗体。CH(IgGl)域也可以通过点突变来修饰，从而提高Fc片段对Fc γ RIIIa受体的 亲和力及由此提高抗体的效应器功能(Lazar等，2006，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 4005-4010 ；Stavenhagen 等，2007，Cancer Res.67 :8882-8890)。本发明包括人源化型式的抗体。术语“人源化抗体”指如下的抗体，其主要含有人免疫球蛋白序列。此术语一般指 通过掺入人序列或在人序列中找到的残基而经过修饰的非人免疫球蛋白。一般地，人源化抗体包含一个或通常两个如下的可变域，其中所有或部分⑶R区 对应于自非人亲本序列衍生的部分，且其中所有或部分FR区是自人免疫球蛋白序列衍生 的。然后，人源化抗体至少可以包含免疫球蛋白恒定区(Fe)的一部分，特别是所选择的人 免疫球蛋白模板的一部分。因此，目的是使抗体在人体中的免疫原性最小化。因此，有可能的是，一个或多个 CDR中的一个或两个氨基酸可以用对人宿主的免疫原性较低的氨基酸修饰，且不实质性降低抗体对FGF-R4的特异性结合功能。类似地，框架区的残基可以不是人的，而且它们有可 能是未修饰的，因为它们不促成抗体的免疫原性潜力。本领域技术人员知道数种人源化方法可用于修饰非人亲本抗体，从而得到对人的 免疫原性较低的抗体。不必要求与人抗体的整体序列相同。这是因为整体序列相同不必然 是免疫原性降低的预测指标，而且对有限数目的残基的修饰可导致人源化抗体在人体中具 有大大降低的免疫原性潜力(Molecularlmmunology，2007，44，1986-1998)。所述各种方法有例如CDR嫁接(ΕΡ0 0239400 ；WO 91/09967 ；及美国专利 No. 5，530，101 和 5，585，089)、表面重建(ΕΡ0 0592106 ；EPO 0519596 ；Padlan, 1991，Molec Imm 28 (4/5) :489-498 ；Studnicka 等，1994，Prot Eng 7(6) :805-814;及 Roguska 等， 1994，PNAS 91 :969-973)或链改组(美国专利 No. 5，565，332)等。本发明特别地涉及如下的人源化抗体，它的可变部分是依照下面的技术修饰的通过与蛋白质数据库比较来鉴定与抗FGF-R4小鼠抗体40-12的相应链最相似 的轻链和重链(H. M. Berman, J. ffestbrook, Z. Feng, G. Gilliland, Τ. N. Bhat, H. ffeissig, I. N. Shindyalov, P. Ε. Bourne, Nucleic Acids Research, 2000，28 :235-242)。序列比对 使用BLAST算法(J Mol Biol. 19900ct 215:403-410)。这些三维结构分别对应于PDB代 码INDM和1ETZ，它们用于构建可变域轻链和重链的同源性模型。随后使用MOE (Molecular Operating Environment,Chemical Computing Group,Quebec,Canada)软件中的标准规禾呈 将这些三维模型能量最小化。随后用Amber软件(D. A. Case，T. Ε. Cheatham, III，Τ. Darden, H. Gohlke, R. Luo, K. Μ. Merz, Jr. , Α. Onufriev, C. Simmerling, B. Wang 禾口 R. Woods, J. Computat. Chem. 2005,26 :1668-1688)对抗体的这些(能量)最小化三维模型实施分子 动力学(MD)模拟。这种模拟是在广义Born隐含溶剂中以温度500K、时程1.1纳秒用应 用于蛋白质骨架原子的调和约束(harmonic constraint)进行的(feillicchio和Levy，J Comput Chem 2004，25 :479-499)。如此，自这个第一次模拟提取10种不同构象，即模拟的 最后一纳秒期间每100皮秒一个三维构象。然后在广义Born隐含溶剂中以温度27°C不约 束蛋白质骨架地对这10种不同构象中每一个进行分子动力学模拟2. 3纳秒。使用SHAKE 算法(Barth等，J Comp Chem，1995，16 :1192-1209)来约束涉及氢原子的键，时间步为1飞 (10_15)秒，而且基于Langevin方程以恒定体积和恒定温度27°C运行模拟。对于10次分子 动力学模拟中每一次，然后将以每皮秒一次的频率提取的最后2000种构象用于对要人源 化的抗体的每个氨基酸定量原子位置相对于氨基酸的平均或medoid构象的偏差。使用MOE 软件的科学矢量语言(SVL)来编码下文描述的所有分析。氨基酸的medoid构象指自与平 均构象最接近的分子动力学衍生的构象，而平均构象是自氨基酸的所有构象的原子位置计 算得到的。用于检测medoid构象的距离是氨基酸的两种构象的原子之间的标量距离的均 方根(RMSD)。类似地，氨基酸的一种构象的原子位置相对于medoid构象的偏差通过计算模 拟的一种构象的氨基酸的原子与medoid构象的相同原子之间的标量距离的RMSD来定量。 随后，通过将给定氨基酸(i)的原子位置在所有10次分子动力学模拟上平均的RMSD(Fi) 与抗体的所有氨基酸的位置在所有10次分子动力学模拟上平均的RMSD(Fm)比较，决定氨 基酸的柔性是否足够被认为能够潜在与T田胞受体相互作用及触发免疫系统活化。如果氨 基酸i的柔性得分Zi (其定义为Zi = (Fi-Fm)/Fm)超过0. 15，那么它被认为是柔性的。如 此，除了抗原互补决定区(CDR)及其紧邻区，抗体可变域中的45个氨基酸被鉴定为柔性的。⑶R的紧邻区定义为α碳距离⑶R的α碳5埃(Λ)或更短的任何氨基酸。然后将抗体的60个最柔性的氨基酸在20纳秒(10x2ns)模拟期间的动作与人抗 体种系的49种同源性模型中每一种使用相同方案运行10次分子动力学模拟(10x2ns)得 到的相应氨基酸的动作比较。60个最柔性的氨基酸排除抗原互补决定区(CDR)及其紧邻 区。49种人抗体种系模型是通过系统组合7种最频繁的人轻链(vkl，vk2，vk3, vk4, ν λ 1， νλ 2,νλ 3)和7种最频繁的人重链(vhla，vhlb，vh2，vh3，vh4，vh5，vh6)而构建的(Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, Database issue D593-D597)。如下来定量要人源化的抗体与49种人种系模型的相似性，即借助分辨率为IA的 一种独特三维立体网格在10次分子动力学模拟的过程里对抗体的60个柔性氨基酸的特定 原子的位置采样。这叫作四维相似性。所使用的三维网格由445-740个点构成，而且使用 与PDB代码8FAB对应的人抗体的三维结构来初始化。8FAB结构还用于在三维网格中定位 要采样的抗体的所有构象。为此目的，将抗体的分子动力学的medoid构象叠加到8FAB结 构上。此叠加包括比对两种构象的惯性的力矩，接着优化两种构象的α碳原子之间的标量 距离。使用相同的方法将抗体的分子动力学的所有剩余构象叠加到medoid构象上。实施两种类型的采样，这为一对所比较的抗体产生两种相似性(静电相似性和 亲脂相似性)。然后将这两种相似性相加以获得总相似性。第一种采样(即静电采样) 考虑氨基酸侧链的所有原子。通过对氨基酸侧链的原子应用用原子部分电荷加权的三 维Gaussian函数f (χ)获得网格的一个点(χ)中的值，如Amber"力场(Ci印lak，J.等， J. Comp. Chem. 2001,22 :1048-1057)中记载的。将 f(x)函数应用于 3 个 Cartesian 坐标轴，
并对应于下面的公式
权利要求
1.FGF-R4受体拮抗剂，其特征在于它是特异性结合FGF-R4的抗体。
2.依照权利要求1的拮抗剂，其特征在于它结合FGF-R4受体的D2-D3域。
3.依照权利要求1和2任一项的抗体，其特征在于它结合FGF-R4受体的D2域。
4.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它具有通过表面等离振子共振 (Biacore)技术测定的小于1(Γ8Μ的关于FGF-R4受体的KD。
5.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它对人FGF-R4和对鼠FGF-R4都有 活性。
6.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且包含至少一个⑶R，该 CDR 具有与序列 SEQ ID No. 9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90， 93,94,95,98,99,100，103，104，105，108，109 或 110 之一相同的序列。
7.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且包含序列为序列SEQID No. 9，10，11，12，13 和 14 ；或 73，74，75，78，79 和 80 ；或 83，84，85，88，89 和 90 ；或 93，94， 95，98，99 和 100 ；或 103，104，105，108，109 和 110 的 CDR，其中所述 CDR 之一可以与至少一 种上述序列相比相差一个或两个氨基酸，前提是所述抗体保留其结合特异性。
8.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且它的重链可变区包含与 序列SEQ ID No. 5，76，86，96或106具有至少80%同一性的核苷酸序列。
9.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且它的轻链可变区包含与 序列SEQ ID No. 7，71，81，91或101具有至少80%同一性的核苷酸序列。
10.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且它的序列包含多肽序 列 SEQ ID No. 2 禾口 4 ；或 6 禾口 8 ；或 72 和 77 ；或 82 和 87 ；或 92 和 97 ；或 102 禾口 107。
11.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它诱导对受FGF-R4控制的细胞信 号传导途径的抑制。
12.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它诱导对血管发生的抑制。
13.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它诱导对肿瘤细胞增殖的抑制。
14.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它对FGF-R4的亲和力比它对其它 FGF受体的亲和力大10倍。
15.依照权利要求1-7任一项的拮抗剂，其特征在于它是人源化抗体。
16.依照权利要求1-7任一项的拮抗剂，其特征在于它是人抗体。
17.依照权利要求15的拮抗剂，其特征在于它包含与多肽序列SEQID No. 30或32之 一具有至少80%同一性的可变轻链。
18.依照权利要求15的拮抗剂，其特征在于它包含与序列SEQID No. 34，36或38之一 具有至少80%同一性的可变重链。
19.依照前述权利要求任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且它是偶联至细胞毒剂的。
20.依照前述权利要求任一项的拮抗剂在治疗与病理性血管发生有关的疾病中的用途。
21.依照前述权利要求任一项的拮抗剂在治疗肝癌瘤或任何其它类型肝癌中的用途。
22.依照前述权利要求任一项的拮抗剂在治疗胰腺癌中的用途。
23.包含依照权利要求1-19任一项的拮抗剂和赋形剂的药物组合物。
24.治疗与病理性血管发生有关的疾病的方法，其特征在于它包括给患者施用依照权 利要求1-19任一项的抗体。
25.治疗癌症的方法，其特征在于它包括给患者施用依照权利要求1-19任一项的抗体。
26.生成依照权利要求1-19任一项的抗体的细胞系。
27.生产依照权利要求1-19任一项的抗体的方法，其特征在于它包括培养依照权利要 求的沈的细胞系。
28.包含依照权利要求1-19任一项的拮抗剂的药物。
29.编码与序列SEQ ID No. 2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，30，32，34，36，38，72，73，74， 75，77，78，79，80，82，83，84，85，87，88，89，90，92，93，94，95，97，98，99，100，103，104，105， 107，108，109或110之一具有至少80%同一性的多肽的多核苷酸。
30.多核苷酸，其特征在于它的序列与序列SEQID No. 1，3，5，7，29，31，33，35，或37， 71,76,81,86,91,96,101 或 106 之一具有至少 80% 同一性。
31.包含依照权利要求四和30任一项的核酸的重组载体。
32.包含依照权利要求31的载体的宿主细胞。
全文摘要
本发明涉及FGF-R4受体特异性拮抗剂分子，其能够抑制所述受体的活性。所述拮抗剂特别是FGF-R4特异性抗体，其能够抑制所述受体的活性。本发明还涉及所述抗体的治疗用途，特别是在血管发生领域中及在某些类型的癌症的治疗中。
文档编号A61K39/395GK102149730SQ200980134842
公开日2011年8月10日 申请日期2009年7月7日 优先权日2008年7月8日
发明者伊丽莎白.里米, 塔里克.达布道比, 尼古拉斯.鲍林, 弗朗索瓦.博诺, 弗朗西斯.布兰奇, 文森特.米科尔, 比阿特丽斯.卡梅伦, 皮埃尔-弗朗索瓦.伯恩, 科伦廷.赫伯特 申请人:赛诺菲-安万特