专利名称：一种干燥羊膜的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种羊膜的制备方法，尤其是涉及一种干燥羊膜的制备方法。
背景技术：
羊膜来源于胚胎，是一种透明、无神经、血管和淋巴管、低抗原性且具有韧性的组 织。该膜由上皮细胞层、基底膜、基质层、纤维母细胞层、海绵层组成，厚约0. 02 0. 05mm。 羊膜上皮层为单层立方上皮，细胞表面及侧面有很多微绒毛，有合成、分泌和沉积基底膜、 细胞外间质成份的能力，具有分化的潜能，并可以分泌多种生长因子；而羊膜基质含有丰富 的胶元纤维及多种形式的蛋白酶抑制剂；羊膜基底膜是人体最厚的基底膜(约0. 1 μ m)，含 有IV型胶原纤维网，层粘连蛋白和富含硫酸肝素的蛋白多糖，可以起屏障作用，减低了羊 膜的通透性。随着新生血管、炎症及伤口愈合等相关疾病的患者人数增多，羊膜的使用也越来 越多。羊膜的制备，尤其是羊膜活性成分的保存，也就成为目前研究的一个热点问题。目前 市面上采用的多为直接经过冷冻的干燥羊膜-生物冻干羊膜，它是将附有羊膜的纸片置于 冻干机，真空条件下用钴-60辐射烘干，并在室温下真空包装，室温下避光放置两个月，使 用前需置于含庆大霉素的生理盐水中浸泡:3min。该方法操作相对简单，成本较低，便于规模 化批量生产，可长期保存，运输方便，但需要用到特殊的设备，冻干羊膜组织结构及上皮比 较容易被破坏。目前还有一种干燥羊膜-海藻糖浸泡羊膜，它是将分离出的羊膜置于10% 海藻糖溶液中浸泡，然后冻干，真空包装，射线辐照灭菌后避光保存。该方法保存的羊膜在 形态学、生物学方面更接近于自然新鲜羊膜，但效果尚未得到更多证实。
发明内容
本发明提供一种干燥羊膜的制备方法，制得的干燥羊膜安全无污染、性能与新鲜 羊膜接近、生物活性高、胶原破坏少、易于手术操作、运输及保存方便，作为新鲜羊膜的替代 物，取材方便，实用性强，能被广大患者接受并应用于临床。本发明采用如下技术方案一种干燥羊膜的制备方法，包括如下步骤将反复漂洗的无病毒携带新鲜羊膜经 过严格消毒，低温下基质重建及修复，铺膜，干燥，钴60消毒后保存备用。如制备有色干燥羊膜，需包括以下步骤将反复漂洗的无病毒携带新鲜羊膜经过 严格消毒，低温下基质重建及修复，羊膜着色，铺膜，干燥，钴60消毒后保存备用。所述的消毒是将新鲜羊膜用含抗菌素的PBS浸泡后，浸泡时间为5-lOmin，PBS冲 洗3次X 5min。所述的抗菌素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素，100mg/L链霉素中 一种或两种以上的组合。所述的基质重建及修复是将新鲜羊膜浸泡于基质胶内，其中所需温度 为-20°C _4°C，时间为15min-30min，基质胶包括ECM胶，FN胶，Matrige胶，角叉菜胶，明胶， IV型胶原中的一种。采用本技术能使羊膜外面存在一层保护膜，使上皮和基质活性成份能得到大部分保存，细胞表型和基底膜完整，基质破坏极少。所述的羊膜着色的有色染料包括荧光素钠，虎红，台盼蓝，龙胆紫，结晶紫，丽丝胺 绿，酚红，美蓝，番红，甲基蓝及洋红中的一种，其中温度为16°c -37°c，染色时间30s-5min。 采用本技术能很好的帮助我们在手术应用中分辨羊膜的折叠处和皱褶及边缘。所述的铺膜包括硝酸纤维素膜，乙酸纤维素膜，微孔滤膜，盖玻片中的一种。采用 本技术能使羊膜充分展平，保持一定的拉伸度同时还可以辨别羊膜上皮面。所述的干燥技术处理为真空冻干，真空晾干，无水Cacl2真空干燥，自然晾干，吹 干，30-60°C温箱内烘干中的一种或一种以上的组合，干燥至羊膜材料的含水量在0. 1-5% 之间后取出。所述的羊膜材料消毒技术采用钴60消毒。我们采用本发明技术方案制作的羊膜材料，植入于兔皮下1个月，兔眼前房内和 兔角膜基质囊袋内平铺术后1月均显示其具有良好组织相容性，没有见明显的炎症反应和 排斥反应，同时将其用于羊膜结膜修补术后2周发现其羊膜基底膜尚完整，羊膜上有兔结 膜上皮长入，无明显的排斥反应和炎症反应，说明其能作为结膜上皮的细胞基底膜用于结
膜重建。与现有的羊膜材料相比，本发明具有以下优点(1)本发明制作流程简单、可靠， 且易于实施；(2)成本相对较低，易于推广；(3)可常温下保存，运输方便；(4)病原菌培养、 生物学性质检测及显微结构观察发现较长时间保存(12月)的羊膜材料无污染，将其应用 于人结膜修补术中，术后发现羊膜植片能存活2周-2月，并能促进结膜上皮在其表面生长， 远期效果理想；(4)本发明加入了基质胶，在羊膜外面存在一层保护膜，使上皮和基质活性 成份能得到大部分保存，细胞表型和基底膜完整，基质破坏极少，优于同时间保存的单纯冻 干羊膜；( 本发明加入了染色成分，能很好的帮助我们在手术应用中分辨羊膜的折叠处 和皱褶及边缘。(6)本发明不仅有利于优化羊膜特性，同时能为组织工程羊膜产业化提供重 要的技术支持。
图1为本发明制备方法制得的干燥羊膜(经过荧光素钠着色)保存12月的裂隙 灯照片(100X)。图2为本发明制备方法制得的干燥羊膜(经过龙胆紫着色)保存12月的裂隙灯 照片(100X)。图3为本发明制备方法制得的干燥羊膜保存12月的羊膜HE染色照片Q00X)。图4为经过单纯冻干保存12月的羊膜HE染色照片Q00X)。图5为本发明制备方法制得的干燥羊膜保存12月的羊膜Laminin 5染色照片
(200X)ο图6为经过单纯冻干保存12月的羊膜Laminin 5染色照片Q00X)。图7为本发明制备方法制得的干燥羊膜保存12月的羊膜Collagen IV染色照片
(200X)ο图8为经过单纯冻干保存12月的羊膜Collagen IV染色照片Q00X)。图9为本发明制备方法制得的干燥羊膜保存12月的羊膜β -catenin染色照片
图10为经过单纯冻干保存12月的羊膜β -catenin染色照片QOO X)。图11为本发明制备方法制得的干燥羊膜保存12月的羊膜MUC 16染色照片
(200X)ο图12为经过单纯冻干保存12月的羊膜MUC 16染色照片Q00X)。图13为本发明制备方法制得的干燥羊膜保存12月后兔角膜层间植入后1月的裂 隙灯照片。图14为本发明制备方法制得的干燥羊膜保存12月后兔角膜层间植入后1月的HE 照片。图15为本发明制备方法制得的干燥羊膜保存12月后兔前房内植入后1月的裂隙 灯照片。图16为本发明制备方法制得的干燥羊膜保存12月后兔前房内植入后1月的HE 照片。图17为本发明制备方法制得的干燥羊膜保存12月后兔羊膜-结膜修补术后2周 的裂隙灯照片。图18为本发明制备方法制得的干燥羊膜保存12月后兔羊膜-结膜修补术后2周 的手术区结膜K19染色照片。图19为本发明制备方法制得的干燥羊膜(基质胶为ECM胶)与常规冷冻干燥羊 膜保存12月后平均弹性模量对比情况。图20为本发明制备方法制得的干燥羊膜(基质胶为ECM胶)与常规冷冻干燥羊 膜材料保存12月后平均最大承受拉伸力对比情况。图21为本发明制备方法制得的干燥羊膜(基质胶为ECM胶)与常规冷冻干燥羊 膜材料保存12月后平均拉伸长度对比情况。
具体实施例方式实施例1本发明所述的制备方法，包括以下步骤供体取自经剖宫产术获取的胎膜，产妇术 前病毒学检验结果均为阴性；获得的胎膜在无菌洁净环境内，用无菌生理盐水洗净其表面 的血迹；术者双手戴无菌手套，将羊膜自绒毛膜轻轻分离出来，无菌BSS液冲洗干净，平铺 在无菌的玻璃平板上，用细胞刮子刮除其海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液等；将新鲜 羊膜用含5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素，100mg/L链霉素的PBS浸泡消毒3次X 5min ； 在-20°C -4°C温度下，然后将无菌羊膜浸泡于ECM胶内15min-30min ；在16°C _37°C通风橱 内滴入0. 25%无菌荧光素钠溶液0. 2ml于羊膜上染色5min，然后将染色后了羊膜平铺于硝 酸纤维膜上，在无菌通风橱内自然晾干，含水量约维持在0.5%左右时后取出，然后塑料包 装，钴60消毒，保存备用。实施例2本发明所述的制备方法，包括以下步骤供体取自经剖宫产术获取的胎膜，产妇术 前病毒学检验结果均为阴性；获得的胎膜在无菌洁净环境内，用无菌生理盐水洗净其表面 的血迹；术者双手戴无菌手套，将羊膜自绒毛膜轻轻分离出来，无菌BSS液冲洗干净，平铺在无菌的玻璃平板上，用细胞刮子刮除其海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液等；将新鲜 羊膜用含5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素，100mg/L链霉素的PBS浸泡消毒3次X 5min ； 在-20°C -4°C温度下，然后将无菌羊膜浸泡于FN胶内15min-30min ；在16°C _37°C通风橱 内滴入0. 无菌台盼蓝溶液0. 2ml于羊膜上染色5min，然后将染色后了羊膜平铺于硝酸 纤维膜上，在无菌通风橱内自然晾干，含水量约维持在0. 5%左右时后取出，然后塑料包装， 钴60消毒，保存备用。实施例3本发明所述的制备方法，包括以下步骤供体取自经剖宫产术获取的胎膜，产妇术 前病毒学检验结果均为阴性；获得的胎膜在无菌洁净环境内，用无菌生理盐水洗净其表面 的血迹；术者双手戴无菌手套，将羊膜自绒毛膜轻轻分离出来，无菌BSS液冲洗干净，平铺 在无菌的玻璃平板上，用细胞刮子刮除其海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液等。将新鲜 羊膜用含5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素，100mg/L链霉素的PBS浸泡消毒3次X 5min ； 在-20°C -4°C温度下，然后将无菌羊膜浸泡于Matrige胶内15min-30min ；在16°C _37°C通 风橱内滴入0. 5%无菌虎红溶液0. 2ml于羊膜上染色5min，然后将染色后了羊膜平铺于硝 酸纤维膜上，在无菌通风橱内自然晾干，含水量约维持在0.5%左右时后取出，然后塑料包 装，钴60消毒，保存备用。参见图1 12，使用目前常用的冷冻干燥羊膜材料，保存12月可维持羊膜部分活 性。美国等国目前临床用的液态保存羊膜，保存条件要求较高，应用前需保存6个月后再次 检测，这段保存期可容许工作人员对供体羊膜进行详细的检查，以排除恶性肿瘤、传染性疾 病，从而为临床提供健康、优质的羊膜片，但这种液体保存羊膜周期较长，运输不便，不易保 存。国内已经产品化的冷冻干燥羊膜，在冷冻干燥处理过程中大部分组织遭到破坏，导致 在维持羊膜活性方面及生物学方面存在缺陷，在临床手术中羊膜容易撕裂，严整影响手术 效果。本发明所述的羊膜材料的制作方便，成本较低，可常温下保存，运输方便，易于推广； 同时加入了染色成分(荧光素钠图1，结晶紫图2)，能很好的帮助我们分辨羊膜的折叠 处和皱褶及边缘。保存12月后经HE染色(图3)及各种荧光染色(Laminin 5染色图5， Collagen IV染色图7，β-catenin染色图9，MUC 16染色图11)检查证实其保存的 效果(保存时间、活性成分及基底膜)优于相应天数的冷冻干燥羊膜材料(HE染色图4， Laminin 5 染色图 6，Collagen IV 染色图 8，β-catenin 染色图 10，MUC 16 染色图 12)。图13，14是经过本发明所述羊膜材料在临床应用上的一个具体实施例。经过本发 明常温保存12月的羊膜应用于兔角膜层间植入后经过1个月的观察，羊膜片尚未完全溶 解，植片透明，无明显的排斥反应和炎症反应。图15，16是经过本发明所述羊膜材料在临床应用上的另一个具体实施例。经过本 发明常温保存12月的羊膜应用于兔前房内植入后经过1个月的观察，发现其羊膜部分溶 解，体积变小，但基底膜尚完整，植片变白，但无明显的排斥反应和炎症反应。图17，18是经过本发明所述羊膜材料在临床应用上的另一个具体实施例。经过本 发明常温保存12月的羊膜应用于兔羊膜-结膜修补术后2周的观察，发现其羊膜基底膜尚 完整，羊膜上有兔结膜上皮长入，无明显的排斥反应和炎症反应，说明其能作为结膜上皮的 细胞基底膜用于结膜重建。
实施例4以下所述为羊膜材料在临床应用上的一个具体实施例。目的对比经过各种预处理的商用羊膜和实验羊膜的拉伸强度和弹性特性。方法对经过一种预处理的羊膜和现有商用羊膜进行对比研究。组1为ECM胶后 冻干处理的羊膜(20例)，组2为常规冷冻干燥羊膜组(20例)。羊膜被切割成细条，装入 负荷传感器中，并逐步延伸直至断裂。记录并比较最终破裂时两种羊膜的弹性模量，位移， 最大耐受拉力。结果在弹性模量，位移，最大耐受拉力上，ECM胶组明显大于冷冻干燥羊膜组，两 组对比具有显著性差异(P < 0. 05)。结论ECM胶组处理的冻干羊膜保持着更好的弹性特点，他将提供了一个更易于 操纵的移植组织片用于眼表，神经及肌腱重建。图19，20，21是经过本发明所述羊膜材料在应用上的一个具体实施例。ECM胶处理 的冻干羊膜常温保存12月后，在弹性模量，最大耐受拉力上均明显好于常规冻干羊膜保存 12月组但在平均拉伸位移上差异无显著性意义。a 冷冻干燥羊膜组，b :ECM胶组.实施例5以下所述为羊膜材料在临床应用上的一个具体实施例。目的对比经过各种预处理的商用羊膜和实验羊膜的厚度变化。方法对经过一种预处理的羊膜和现有商用羊膜进行对比研究。组1为为ECM胶 后冻干处理的羊膜(20例)，组2为常规冷冻干燥羊膜组(20例)。羊膜被切割成方块，浸 泡于生理盐水中30min。然后用角膜测厚仪测量相应的羊膜厚度。记录并比较两种羊膜复 水前后的厚度。结果羊膜浸湿后几乎没有增加羊膜厚度。干燥羊膜平均厚度的是 19. 68士2. 75 μ m，而相应的湿润羊膜平均厚度为19. 84士 1.83μπι(ρ > 0. 05)，然而复水后 的ECM胶组64 士 2. 24 μ m)羊膜相比冷冻干燥羊膜组(19. 69 士 1.97μπι)更接近于新鲜 羊膜的厚度(20. 88 士 2. 33 μ m)，两组对比具有显著性差异(P < 0. 05)。结论ECM胶组处理的冻干羊膜保持着更好的厚度，他将提供一个更接近于生理 状况的移植组织片用于眼表，神经及肌腱重建。
权利要求
1.一种干燥羊膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤将反复漂洗的无病毒携带新 鲜羊膜经过严格消毒，低温下基质重建及修复，铺膜，干燥，钴60消毒后保存备用。
2.如权利要求1所述的一种干燥羊膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤将反复 漂洗的无病毒携带新鲜羊膜经过严格消毒，低温下基质重建及修复，羊膜着色，铺膜，干燥， 钴60消毒后保存备用。
3.如权利要求1、2所述的一种干燥羊膜的制备方法，其特征在于所述的消毒是将新 鲜羊膜用含抗菌素的PBS浸泡后，浸泡时间为5-lOmin，PBS冲洗3次X5min，所述的抗菌 素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素，100mg/L链霉素中一种或两种以上的组合。
4.如权利要求1、2所述的一种干燥羊膜的制备方法，其特征在于所述的基质重建及 修复是将新鲜羊膜浸泡于基质胶内，其中所需温度为-20°C _4°C，时间为15min-30min，基 质胶包括ECM胶，FN胶，Matrige胶，角叉菜胶，明胶，IV型胶原中的一种。
5.如权利要求1、2所述的一种干燥羊膜的制备方法，其特征在于所述的羊膜着色的 有色染料包括荧光素钠，虎红，台盼蓝，龙胆紫，结晶紫，丽丝胺绿，酚红，美蓝，番红，甲基蓝 及洋红中的一种，其中温度为16°C -37°C，染色时间30s-5min。
6.如权利要求1、2所述的一种干燥羊膜的制备方法，其特征在于所述的铺膜包括硝 酸纤维素膜，乙酸纤维素膜，微孔滤膜，盖玻片中的一种。
7.如权利要求1、2所述的一种干燥羊膜的制备方法，其特征在于所述的干燥技术处 理为真空冻干，真空晾干，无水Cacl2真空干燥，自然晾干，吹干，30-60°C温箱内烘干中的一 种或一种以上的组合，干燥至羊膜材料的含水量在0. 1-5%之间后取出。
8.如权利要求1、2所述的一种干燥羊膜的制备方法，其特征在于所述的羊膜材料消 毒技术采用钴60消毒。
全文摘要
一种干燥羊膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤将反复漂洗的无病毒携带新鲜羊膜经过严格消毒，低温下基质重建及修复，铺膜，干燥，钴60消毒后保存备用。具有制作流程简单、可靠，且易于实施；成本相对较低，易于推广；可常温下保存，运输方便，羊膜细胞表型和基底膜完整，羊膜基质破坏极少，优于同时间保存的单纯冻干羊膜等优点。
文档编号A61L27/36GK102133427SQ201010113960
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月21日 优先权日2010年1月21日
发明者周海华 申请人:周海华