一种抗菌肽ap-57及其制备方法和应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗菌肽AP-57及其制备方法和应用方法，抗菌肽AP-57，为多肽，含有57个氨基酸；制备方法包括以下步骤：将人源AP-57真核表达核酸序列优化为适用于大肠杆菌表达的核酸序列；将重组表达质粒转化至工程化大肠杆菌BL21感受态细胞；挑单克隆扩大培养与诱导表达；亲和层析；阳离子交换层析；最后质谱鉴定。本发明具有广谱抗病原微生物的功能，包括抗细菌，抗真菌，抗病毒，抗支原体，为具有多种生物学功能的新型人源抗菌肽；AP-57抗菌肽具有显著的抗细菌和抗真菌效果，具有非常显著的抗包膜病毒和支原体的效果，在抑制微生物生长，繁殖和散播，预防或治疗病原微生物感染方面具有很大的潜在应用价值。
【专利说明】-种抗菌肽AP-57及其制备方法和应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学和生物医学【技术领域】，尤其涉及一种抗菌肽AP-57及其制备 方法和应用方法。
【背景技术】
[0002] 微生物感染，包括细菌，真菌，病毒等，能够引发很多包括肝炎，肺炎，艾滋病，肺结 核等在内的非常严重的人类疾病。病原微生物引起的传染性流行病始终是导致人死亡的重 要病因之一。
[0003]抗生素发明以来，挽救了无数细菌感染患者的生命。然而大量抗生素的使用，不仅 会给患者带来很多副作用，也造成了大量耐药株的滋生。而且抗生素对于病毒性感染往往 难以起效。
[0004]抗菌肽是具有抗菌活性短肽的总称。1975年瑞典科学家G.Boman等人从惜古比天 蚕蛹中诱导分离得到一种杀菌肽，并将其命名为天蚕素（cecropin)。此后，人们相继从细 菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得多种具有抗菌活性 的多肽，如娃皮素（magainins)、蜂毒素（melittins)，防御素（defensins)等。由于这类活 性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为"antibacterialp印itides，ABP"，中文 译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分 真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，因而许多学者也将其称之为多肽抗 生素（PeptideAntibiotics)，以及抗微生物肤（Antimicrobialpeptides，AMP)。另外，也 有报道一些抗菌肽具有促进凝血，促进伤口愈合，抗炎，调节免疫方面的功能。这些内源性 的抗菌肽在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用。
[0005] 防御素（defensins)是分子量较小的（一般60个氨基酸以下，少数具有100多个 氨基酸）富含半胱氨酸的（一般含有6至8个保守的半胱氨酸残基，形成3至4对二硫键） 阳离子蛋白质，属于抗微生物肽的一类。广泛存在于植物，低等动物到哺乳动物在内的生物 类群中。到目前为止人类中共发现上百种防御素，每种防御素均含有6个半胱氨酸，每种防 御素都具有独特的表达和功能特征。根据结构及分布特征人源防御素分为a型和0型。 另外，近年来在恒河猴中发现了环状防御素0 -Defensin。防御素是生物长期与疾病斗争中 进化而来的，也是其自身防御体系的重要组成部分，也具有抗多种微生物，抗肿瘤，促进凝 血和伤口愈合，抗炎，调节免疫等功能。
[0006]在食品安全事件频发，耐药性、药残、抗生素滥用等棘手问题破待解决的当前，很 多科学家和企业家将抗菌肽视为最有希望的抗生素替代品。大部分抗菌肽具有穿透细胞 膜，造成有胞膜不完整而至胞浆外溢，从而杀伤目标微生物和细胞的作用。其直接破膜杀伤 的作用机制使得靶微生物不易产生耐药性。一些抗菌肽，如乳链菌肽早已被批准用于抗菌 的食品添加剂。因此，一种新的抗菌肽的发现具有较大的潜在应用开发价值。
[0007]现有技术一的技术方案
[0008]自然界各种生物中存在非常多种类的抗菌肽。人源抗菌肽至今已经发现了上百 种，其中含有二硫键的抗菌肽大部分划分为防御素。近十年来，非人源抗菌肽仍然不断被人 们发现和鉴定出来，但是新的人源抗菌肽的发现已经非常罕见。
[0009] 有关AP-57多肽，前人的研究报道揭示了一些其可能与免疫调节，结肠癌肿瘤细 胞增殖调节相关的功能，这些报道并不能推测和预见AP-57具备抗菌肽功效。
[0010] 现有技术一的缺点
[0011] 虽然人们已经从自然界多种生物中分离鉴定了非常多种类的抗菌肽，每种抗菌肽 都具有对抗微生物的基本特征，但是不同的抗菌肽又具备不同的抗菌谱和抗菌效果。可以 说每种抗菌肽都有自身独特的功效。特别是被发现和报道的人源抗菌肽种类却相对较少。 我们知道，其它物种来源的抗菌肽应用于人体很有可能会引发免疫排斥反应，因此异种来 源抗菌肽在人用药物开发上非常受限。
[0012] 检索近十年的文献我们知道，新的人源抗菌肽的发现和报道已经非常罕见。本发 明AP-57抗菌肽序列与现已有报道的抗菌肽在序列在同源性方面显著不同。因此本发明 AP-57抗菌肽具备非常大的潜在应用开发价值，特别是在人用抗微生物感染药物开发方面。
[0013] 现有技术二的技术方案
[0014] 现有含有二硫键的抗菌肽的生产多采用固相合成或酵母表达，使用方便快捷又经 济的大肠杆菌胞质表达还是比较困难，成功的报道并不多见。也有一些使用大肠杆菌表达 抗菌肽成功的报道，但其生产制备工艺并不能广谱适用于其它抗菌肽的制备。可以说不同 的抗菌肽，都具有不同的分子量，等电点，疏水性，空间结构等特征，因此就应该具有不同的 生产制备工艺。
[0015] 现有技术二的缺点
[0016] 多肽的固相合成适用于氨基酸数目少，二硫键少的目标多肽。对于氨基酸数目和 二硫键多的蛋白质，其生产和质控比较困难，生产成本也较高。
[0017] 酵母表达系统对于氨基酸数目和二硫键多的目的蛋白质比较适用。但是和大肠杆 菌表达系统相比，仍然存在明显的生产成本高的问题。
【发明内容】
[0018] 本发明实施例的目的在于提供一种抗菌肽AP-57及其制备方法和应用方法，旨在 解决现有的技术存在的人源抗菌肽种类相对较少，肽的固相合成适用于氨基酸数目少，二 硫键少的目标多肽，对于氨基酸数目和二硫键多的蛋白质，生产和质控比较困难，生产成本 较高的问题。
[0019] 本发明是这样实现的，一种抗菌肽AP-57,该抗菌肽AP-57,为多肽，对应C10orf99 基因表达产物去掉信号肽之后的成熟蛋白序列，含有57个氨基酸，序列为：
[0020] KRRPAKAWSGRRTRLCCHRVPSPNSTNLKGHHVRLCKPCKLEPEPRLWVVPGALPQV；
[0021] 理论分子量为：6. 52D;理论等电点为11. 28 ;为强阳离子双亲性抗菌肽。
[0022] 本发明的另一目的在于提供一种抗菌肽AP-57的制备方法，该抗菌肽AP-57的制 备方法包括以下步骤：
[0023] 步骤一，序列优化与载体构建：首先将人源AP-57真核表达核酸序列优化为适用 于大肠杆菌表达的核酸序列，并构建于基因工程化pET28a载体上。
[0024] 步骤二质粒转化和小量培养：将工程化大肠杆菌BL21感受态细胞在冰上融化，吸 取20-100ill置于1.5mlEP管中。加入1-2ill质粒，轻轻混匀，在冰上静置20-30min。然 后于42°C水浴中热激60-90s，随后立即冰浴2min。添加900ill未加抗生素的LB培养基 中，于37°C恒温摇床孵育lh。6000rpm离心3min，去上清液，100-200y1LB重悬菌液，吹打 混匀后涂布于加了抗生素的LB固体培养皿上，37°C倒置培养过夜。挑取阳性单菌落接种于 装有4mlLB液体培养基的试管中，37°C，220rpm振摇过夜，按1 : 1000的比例取上述菌液 转接于装有l〇〇mlLB液体培养基的摇瓶中，37°C，220rpm振摇培养至0D600达到0. 6。
[0025] 步骤三，扩大培养与诱导表达：再按1 : 1000的比例取上述菌液转接于装有 1000-2000mlLB液体培养基的摇瓶中，37 °C，220rpm振摇培养至0D600达到1. 0，添加 0. 5-lmmol/LIPTG，37°C诱导6h，收集菌体重悬于上样缓冲液中（50mMNaH2P04. 2H20,0. 5M NaCl，pH8. 0)，在高压均质机中破碎。然后于4°C，13000rpm条件下离心机30-40min，取上 清于0. 22iim滤器过滤后，用于后续纯化；
[0026] 步骤四，亲和层析：将步骤三中裂解上清上样至已装好亲和填料的层析柱，用3倍 柱体积的上样缓冲液淋洗后，用洗脱缓冲液（50mMNaH2P04. 2H20,0. 5MNaCl，500mM咪唑， PH8.0)洗脱，收集流出峰蛋白样品。
[0027] 步骤五，阳离子交换层析：将蛋白样品经过标准酶切后上样于已装好阳离子填料 的层析柱，用平衡缓冲液（20mMTris，pH8. 5)淋洗后，用洗脱缓冲液（2MNaCl，20mMTris， PH8.5)洗脱，收集流出峰蛋白，留样做SDS-PAGE电泳分析和质谱验证。经过离子交换层析 后能够得到高纯度的人AP-57。
[0028] 本发明的另一目的在于提供一种抗菌肽AP-57的应用方法，该抗菌肽AP-57具有 广谱抗病原微生物的功能，包括抗细菌，抗真菌，抗病毒，抗支原体；含有57个氨基酸的多 肽，命名为AP-57。
[0029] 本发明提供的抗菌肽AP-57及其制备方法和应用方法，通过大规模表达和活性检 测分析，发现通过大肠杆菌基因工程重组表达的一个多肽，具有类似防御素的功能；本发明 也提供了该多肽简单高效的制备方法，同时该多肽属于人源多肽，方便应用于人用药物的 开发，可以用来开发抗病原微生物的药物，具有很大的开发潜力。本发明具有多种生物学功 能的新型人源抗菌肽具有很大的潜在应用价值，AP-57抗菌肽具有显著的抗细菌和抗真菌 效果，具有非常明显的抗包膜病毒和支原体的效果，在抑制微生物生长，繁殖和散播，预防 或治疗病原微生物感染方面具有很大的潜在应用价值。此外本发明提供了AP-57简单高效 的生产制备技术方案，方便于AP-57抗菌肽应用于抗微生物感染药物的开发，具有较大的 应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1是本发明实施例提供的抗菌肽AP-57的制备方法流程图；
[0031] 图2是本发明实施例提供的AP-57同源性对比分析示意图；
[0032] 图3是本发明实施例提供的AP-57在大肠杆菌中可溶性诱导表达示意图；
[0033] 图4是本发明实施例提供的AP-57在大肠杆菌中不同IPTG浓度诱导表达分析示 意图；
[0034] 图5是本发明实施例提供的AP-57在大肠杆菌中不同诱导时间诱导AP-57表达分 析示意图；
[0035] 图6是本发明实施例提供的镍柱亲和层析纯化AP-57的SDS-PAGE电泳结果示意 图；
[0036] 图7是本发明实施例提供的阳离子层析纯化AP-57的SDS-PAGE电泳结果示意图； [0037]图8是本发明实施例提供的AP-57对大肠埃希菌（ATCC25922)运动能力的抑制 实验结果图；
[0038] 图9是本发明实施例提供的AP-57对金黄色葡萄球菌（ATCC25923)的抑菌实验 结果图；
[0039] 图10是本发明实施例提供的AP-57对放线菌（临床患者分离株）的抑菌实验结 果图；
[0040] 图11是本发明实施例提供的AP-57对黑曲霉（ATCC16404)的抑菌实验结果图；
[0041] 图12是本发明实施例提供的AP-57对支原体（临床患者分离株）的抑菌实验结 果图；
[0042] 图13是本发明实施例提供的AP-57对慢病毒（HEK293细胞包装）感染能力的抑 制实验结果图。
【具体实施方式】
[0043] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0044] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0045] 本发明实施例的抗菌肽AP-57,为多肽，对应C10orf99基因表达产物去掉信号肽 之后的成熟蛋白序列，含有57个氨基酸，序列为：
[0046] KRRPAKAWSGRRTRLCCHRVPSPNSTNLKGHHVRLCKPCKLEPEPRLWVVPGALPQV；
[0047] 理论分子量（MW)为：6.52D;理论等电点（pi)为11.28;为强阳离子双亲性抗菌 肽，该多肽具有广谱抗病原微生物的功能，包括抗细菌，抗真菌，抗病毒，抗支原体。
[0048] 新型抗菌肽，具有广谱抗微生物的功效，所述抗菌肽具有SEQIDN0 :1所示序列， 含有57个氨基酸。将其命名为4?-57(抗菌肽-57,4拉11^(^〇1^31口印^(1657)。4?-57多 肽具有广谱抗微生物的功效，本发明也提供了所述AP-57抗菌肽的制备方法。同时该多肽 属于人源多肽，方便应用于人用药物的开发，可以用来开发抗病原微生物的药物，具有很大 的开发潜力。
[0049] 如图1所示，本发明实施例的抗菌肽AP-57的制备方法包括以下步骤：
[0050]S101，序列优化与载体构建：首先将人源AP-57真核表达核酸序列优化为适用于 大肠杆菌表达的核酸序列，并构建于基因工程化pET28a载体上。
[0051] S102,质粒转化和小量培养：将质粒转化工程化大肠杆菌BL21感受态细胞，37°C 倒置培养过夜。挑取阳性单菌落接种于装有4mlLB液体培养基的试管中，37°C，220rpm振 摇过夜，按1 : 1000的比例取上述菌液转接于装有l〇〇mlLB液体培养基的摇瓶中，37°C， 220rpm振摇培养至0D600达到0. 6。
[0052]S103,扩大培养与诱导表达：再按1 : 1000的比例取上述菌液转接于装有 1000-2000mlLB液体培养基的摇瓶中，37°C，220rpm振摇培养至0D600达到1.0，添加 0. 5-lmmol/LIPTG，37°C诱导6h，收集菌体重悬于上样缓冲液中（50mMNaH2P04. 2H20,0. 5M NaCl，pH8. 0)，在高压均质机中破碎。然后于4°C，13000rpm条件下离心30-40min，取上清 于0. 22iim滤器过滤后，用于后续纯化；
[0053]S104,亲和层析：将步骤三裂解上清上样至已装好亲和填料的层析柱，用3倍柱体 积的上样缓冲液淋洗后，用洗脱缓冲液（50mMNaH2P04. 2H20,0. 5MNaCl，500mM咪唑，pH8. 0) 洗脱，收集流出峰蛋白样品。
[0054]S105,阳离子交换层析：将蛋白样品经过标准酶切后上样于已装好阳离子填料的 层析柱，用平衡缓冲液（20mMTris，pH8. 5)淋洗后，用洗脱缓冲液（2MNaCl，20mMTris， PH8.5)洗脱，收集流出峰蛋白，留样做SDS-PAGE电泳分析和质谱验证。经过离子交换层析 后能够得到高纯度的人AP-57。
[0055] 在步骤S101中：
[0056] 在编码AP-57的57个氨基酸的真核表达核酸序列中（SEQIDN0:3)，共有9个大 肠杆菌稀有密码子，将其全部替换为大肠杆菌喜好的密码子。同时将SEQIDN0 :3中的终 止密码子替换为大肠杆菌喜好的终止密码子TGA。最终优化后的序列为SEQIDN0 :5;详细 替换情况如表1 :
[0057] 表1:编码AP-57核酸序列的密码子优化
[0058]
【权利要求】
1. 一种抗菌肽AP-57的制备方法，其特征在于，该抗菌肽AP-57的制备方法包括以下步 骤： 步骤一，序列优化与载体构建：首先将人源AP-57真核表达核酸序列优化为适用于大 肠杆菌表达的核酸序列，并构建于基因工程化pET28a载体上； 步骤二，质粒转化和小量培养：将质粒转化工程化大肠杆菌BL21感受态细胞，37°C倒 置培养过夜。挑取阳性单菌落接种于装有4ml LB液体培养基的试管中，37°C，220rpm振摇 过夜，按1 : 1000的比例取菌液转接于装有l〇〇ml LB液体培养基的摇瓶中，37°C，220rpm 振摇培养至0D600达到0. 6 ; 步骤三，扩大培养与诱导表达：再按1 : 1000的比例取菌液转接于装有1000-2000ml LB液体培养基的摇瓶中，37°C，220rpm振摇培养至0D600达到1. 0,添加0. 5-lmmol/L IPTG， 37°C诱导6h，收集菌体重悬于上样缓冲液中，50mM NaH2P04 ? 2H20,0. 5M NaCl，pH8. 0,在高 压均质机中破碎，然后于4°C，13000rpm条件下离心30-40min，取上清于0. 22 ii m滤器过滤 后，用于后续纯化； 步骤四，亲和层析：将上清上样至已装好亲和填料的层析柱，用3倍柱体积的上样缓 冲液淋洗后，用洗脱缓冲液洗脱，洗脱缓冲液50mM NaH2P04 ? 2H20,0. 5M NaCl，500mM咪唑， pH8. 0,收集流出峰蛋白样品； 步骤五，阳离子交换层析：将蛋白样品经过标准酶切后上样于已装好阳离子填料的层 析柱，用平衡缓冲液，20mM Tris，pH8. 5淋洗后，用洗脱缓冲液2MNaCl，20mM Tris，pH8. 5洗 脱，收集流出峰蛋白，留样做SDS-PAGE电泳分析和质谱验证，经过离子交换层析后能够得 到高纯度的人AP-57。
2. 如权利要求1所述的抗菌肽AP-57的制备方法，其特征在于，在步骤一中，成熟 AP-57的核酸序列174bp : AAGAGGCGTCCTGCCAAGGCCTGGTCAGGCAGGAGAACCAGGCTCTGCTGCCACCGAGTCCCTAGCCCCAAC TCAACAAACCTGAAAGGACATCATGTGAGGCTCTGTAAACCATGCAAGCTTGAGCCAGAGCCCCGCCTTTGGGTGGT GCCTGGGGCACTCCCACAGGTGTAG。
3. 如权利要求1所述的抗菌肽AP-57的制备方法，其特征在于，在步骤一中，适用于大 肠杆菌表达的改造后的成熟AP-57的核酸序列174bp : AAGCGCCGTCCTGCCAAGGCCTGGTCAGGCCGCCGCACCCGCCTCTGCTGCCACCGCGTCCCTAGCCCTAAC TCAACAAACCTGAAAGGACATCATGTGCGCCTCTGTAAACCATGCAAGCTGGAGCCAGAGCCTCGCCTTTGGGTGGT GCCTGGGGCACTCCCACAGGTGTGA。
4. 一种抗菌肽AP-57,其特征在于，该抗菌肽AP-57,为多肽，对应C10orf99基因表达产 物去掉信号肽之后的成熟蛋白序列，含有57个氨基酸，序列为： KRRPAKAWSGRRTRLCCHRVPSPNSTNLKGHHVRLCKPCKLEPEPRLWVVPGALPQV ； 理论分子量为：6. 52D ;理论等电点为11. 28 ;为强阳离子双亲性抗菌肽。
5. -种抗菌肽AP-57的应用方法，其特征在于，该抗菌肽AP-57具有广谱抗病原微生物 的功能，包括抗细菌，抗真菌，抗病毒，抗支原体；含有57个氨基酸的多肽，命名为AP-57。
【文档编号】A61P31/10GK104387465SQ201410669781
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】仝爱平, 杨梅佳, 唐梅, 郭刚, 马先君, 杨丽佳, 周良学, 魏于全 申请人:四川大学