RAF抑制剂与AURORA激酶抑制剂的组合的制作方法

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本公开涉及用于治疗癌症的方法。具体地说，本公开提供用于通过施用raf抑制剂与aurora激酶抑制剂的组合治疗癌症的方法。

在2012年，世界各地估计存在1410万例癌症病例。到2035年，这一数字预计增加至2400万。癌症仍然是美国第二大常见死因，占死亡人数的接近四分之一。在2014年，在美国将存在预计1,665,540例诊断的新癌症病理和585,720例癌症死亡。虽然医学进步已经提高了癌症存活率，但对于新的和更有效的治疗存在持续需要。

癌症的特征在于不受控制的细胞繁殖。不受控制的细胞繁殖由控制细胞分裂、分化和凋亡细胞死亡的正常过程的失调引起。有丝分裂是细胞周期中的一个阶段，在所述阶段期间，一系列复杂事件确保染色体分离成两个子代细胞的保真度。有丝分裂进程主要通过蛋白水解和通过由有丝分裂激酶介导的磷酸化事件来进行调控。aurora激酶家族成员(例如，auroraa、aurorab)通过调节中心体分离、纺锤体动力学、纺锤体组装检查点、染色体配对/分离和胞质分裂来调控有丝分裂进程。aurora激酶的过度表达和/或扩增一直与几种肿瘤类型(包括结肠和乳腺的肿瘤)的瘤形成有关。此外，肿瘤细胞中的aurora激酶抑制导致有丝分裂停滞和细胞凋亡，从而表明这些激酶是癌症治疗的重要靶标。

蛋白激酶在细胞繁殖过程中也起关键作用。此类激酶的部分非限制性列表包括ab1、atk、bcr–ab1、blk、brk、btk、c–kit、c–met、c–src、cdk1、cdk2、cdk4、cdk6、craf1、csf1r、csk、egfr、erbb2、erbb3、erbb4、erk、fak、fes、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、fgfr5、fgr、flk4、flt–1、fps、frk、fyn、hck、igf–1r、ins–r、jak、kdr、lck、lyn、mek、p38、pdgfr、pik、pkc、pyk2、ros、tie1、tie2、trk、yes和zap70。在哺乳动物生物学中，此类蛋白激酶包含有丝分裂原活化蛋白激酶(mapk)信号传导途径。

mapk信号传导途径由激酶级联组成，所述激酶级联将细胞外信号中继至细胞核以调控基因表达和关键细胞功能。由ras/raf/mek/erk信号传导途径控制的基因表达调控基本细胞过程，包括增殖、分化、细胞凋亡和血管生成。ras/raf/mek/erk信号传导的这些不同作用在各种类型的癌症中异常活化。此途径内的基因突变可能产生组成型活性蛋白，从而导致增加的细胞增殖和对细胞凋亡的抗性。

raf(丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶)由基因家族编码，所述基因家族由提供三个raf同种型成员(b-raf、c-raf(raf-1)和a-raf)的三种基因组成。这些蛋白质中的每一种在羧基末端共享高度保守的氨基末端调控区和催化结构域。虽然每种同种型均在ras/raf/mek/erk途径中起作用，但b-raf已被证明是mek的主要活化剂。b-raf由ras:gtp募集至b-raf变得活化的细胞内细胞膜。进而，b-raf负责活化mek1/2，并且mek1/2活化erk1/erk2。b-raf基因的突变允许b-raf独立于上游信号进行信号传导。结果，突变的b-raf蛋白(如v600e)引起mek和erk的过度下游信号传导。这导致过度细胞增殖和存活以及瘤形成。通过突变的b-raf过度活化信号传导级联已经牵涉于多种恶性肿瘤中。事实上，b-raf特异性抑制剂(如威罗菲尼)显示对于治疗表达突变型b-rafv600e的黑色素瘤的希望，然而抗性疾病的出现受到越来越多的关注。

因此，如果能够开发更有效的治疗方案则将是有益的。与raf抑制剂活性剂的组合可能有助于治疗癌症并且甚至可能潜在克服对特定抗癌剂的抗性，所述raf抑制剂活性剂抑制除b-rafv600e突变外的更多raf蛋白同种型。具体地说，raf抑制剂与aurora激酶抑制剂的组合可能是特别有效的。raf抑制剂与aurora激酶抑制剂的组合可具有相加或甚至协同的治疗作用。因此，需要新的癌症治疗方案，包括组合疗法。

发明概要

本公开涉及治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用raf激酶抑制剂或其药学上可接受的盐；和aurora激酶抑制剂或其药学上可接受的盐；所述raf激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的量是使得其组合在所述癌症的治疗中是治疗上有效的。在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤癌症。在一些实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是b-raf突变阳性癌症。在一些实施方案中，癌症是nras突变阳性癌症。在一些实施方案中，癌症选自皮肤癌、眼癌、胃肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、中枢神经系统癌症、喉癌、子宫颈癌、淋巴系统癌症、泌尿生殖道癌症、骨癌、胆道癌、子宫内膜癌、肝癌以及结肠癌。在一些实施方案中，raf激酶抑制剂是化合物a或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，aurora激酶抑制剂是阿立塞替(alisertib)或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，aurora激酶抑制剂是阿立塞替钠。

本公开涉及治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用化合物a或其药学上可接受的盐；和阿立塞替或其药学上可接受的盐；所述化合物a和阿立塞替或其药学上可接受的盐的量是使得其组合在所述癌症的治疗中是治疗上有效的。在一些实施方案中，化合物a或其药学上可接受的盐以每剂量达600mg的量每周一次(qw)施用，在每次施用之间具有6天休息期；并且阿立塞替或其药学上可接受的盐在28天周期的第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天、第15天、第17天、第19天、第22天、第24天和第26天以每天两次给予的每剂量约30mg至约50mg的量施用。

附图简述

图1是示出在sk-mel-2黑色素瘤异种移植模型(nras突变体)中，对于单独和与阿立塞替组合施用的12.5mg/kgqd的化合物a，随时间推移的平均肿瘤体积的图。

图2是示出在sk-mel-2黑色素瘤异种移植模型(nras突变体)中，对于单独和与阿立塞替组合施用的50.0mg/kgbiw的化合物a，随时间推移的平均肿瘤体积的图。

图3是示出在a375黑色素瘤异种移植模型(b-raf突变体)中，对于单独和与阿立塞替组合施用的12.5mg/kgqd的化合物a，随时间推移的平均肿瘤体积的图。

图4是示出在a375黑色素瘤异种移植模型(b-raf突变体)中，对于单独和与阿立塞替组合施用的50mg/kgbiw的化合物a，随时间推移的平均肿瘤体积的图。

发明描述

本公开提供用于治疗癌症的新的组合疗法。具体地说，本公开提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用：(i)第一组合物，其包含raf抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性剂；和(ii)第二组合物，其包含aurora激酶抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性剂；所述活性剂的量是使得其组合在癌症的治疗中是治疗上有效的。

除非另外指明，否则本文使用的术语应以下定义的含义。

如本文所用，术语“raf激酶”是指丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶家族中的任一种。所述家族由三个同种型成员(b-raf、c-raf(raf-1)和a-raf)组成。raf蛋白激酶参与由激酶级联组成的mapk信号传导途径，所述激酶级联将细胞外信号中继至细胞核以调控基因表达和关键细胞功能。除非上下文另外指明，否则术语“raf激酶”是指来自任何物种的任何raf激酶蛋白质，包括但不限于此。一方面，raf激酶是人raf激酶。

术语“raf抑制剂”或“raf的抑制剂”用于表示能够与丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶raf的一个或多个同种型成员(b-raf、c-raf(raf-1)和/或a-raf)(包括突变体形式)相互作用的化合物。raf突变体形式包括b-rafv600e、b-rafv600d、b-rafv600k、b-rafv600e+t5291和/或b-rafv600e+g468a。

在一些实施方案中，raf激酶被抑制至少约50％、至少约75％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％。在一些实施方案中，使raf激酶活性降低50％所需的raf激酶抑制剂的浓度是小于约1□m、小于约500nm、小于约100nm、小于约50nm、小于约25nm、小于约10nm、小于约5nm或小于约1nm。

在一些实施方案中，这种抑制对一种或多种raf同种型有选择性，即raf抑制剂对b-raf(野生型)、突变型b-raf、a-raf和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf(野生型)、b-rafv600e、a-raf和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf(野生型)、b-rafv600e、a-raf和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf(野生型)、b-rafv600d、a-raf和c-raf有选择性。

在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf(野生型)、b-rafv600k和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf(野生型)、b-rafv600e和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf(野生型)、b-rafv600d和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf(野生型)、b-rafv600k和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对突变型b-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对突变型b-rafv600e有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对突变型b-rafv600d有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对突变型b-rafv600k有选择性。

术语“泛-raf抑制剂”是不止抑制raf蛋白的b-raf同种型的raf抑制剂。

如本文所用，术语“aurora激酶”是指参与有丝分裂进程的相关丝氨酸/苏氨酸激酶家族中的任一种。在细胞分裂中起作用的各种细胞蛋白质是aurora激酶磷酸化的底物，包括但不限于组蛋白h3、p53、cenp-a、肌球蛋白ii调控轻链、蛋白磷酸酶-1、tpx-2、incenp、存活素、拓扑异构酶iiα、波形蛋白、mbd-3、mgcracgap、结蛋白、ajuba、xieg5(在非洲爪蟾中)、ndc10p(在芽殖酵母中)以及d-tacc(在果蝇中)。aurora激酶本身也是自磷酸化的底物，例如在thr288。除非上下文另外指明，否则术语“aurora激酶”是指来自任何物种的任何aurora激酶蛋白，包括但不限于auroraa、aurorab和aurorac。一方面，aurora激酶是auroraa或b。一方面，aurora激酶是人aurora激酶。

术语“aurora激酶抑制剂”或“aurora激酶的抑制剂”用于表示能够与aurora激酶相互作用并抑制其酶活性的化合物。抑制aurora激酶酶活性意味着降低aurora激酶磷酸化底物肽或蛋白质的能力。在一些实施方案中，aurora激酶活性的这种降低是至少约50％、至少约75％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些实施方案中，降低aurora激酶酶活性所需的aurora激酶抑制剂的浓度是小于约1μm、小于约500nm、小于约100nm或小于约50nm。

在一些实施方案中，这种抑制是选择性的，即aurora激酶抑制剂在低于产生另一种不相关的生物效应(例如降低不同激酶的酶活性)所需的抑制剂的浓度的浓度下降低aurora激酶磷酸化底物肽或蛋白质的能力。在一些实施方案中，aurora激酶抑制剂还降低另一种激酶的酶活性。在一些实施方案中，aurora激酶抑制剂降低牵涉于癌症中的另一种激酶的酶活性。

本文使用术语“约”意指大致地、在...范围内、粗略地或在...左右。当结合数值范围来使用术语“约”时，它通过扩展到在所列举数值以上和以下的界限来改变所述范围。通常，本文使用术语“约”来使一个数值改变到所指出的值以上和以下的10％偏差值。

如本文所用，术语“包含”是指“包括，但不限于”。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”意在包括受试者所患的癌症的全部干预措施，如施用所述组合以缓解、减缓、终止或逆转所述癌症的一种或多种症状并且延迟所述癌症的进展，即使所述癌症实际上未被消除。治疗可包括例如症状的严重程度、症状的数量或复发频率的降低，例如抑制肿瘤生长、阻滞肿瘤生长或已经存在的肿瘤的消退。

如本文中用于指组合疗法的术语“治疗有效量”是指一起服用以使得组合作用引发所需的生物或药物反应(即，破坏靶癌细胞或减缓或阻滞受试者的癌症进展)的药剂的组合的量。例如，如本文中用于指组合疗法的“治疗有效量”将是当在治疗周期期间的相同或不同日期一起施用(顺序或同时)时具有有益的组合作用的raf抑制剂的量和aurora激酶抑制剂的量。在一些实施方案中，组合作用是相加的。在一些实施方案中，组合作用是协同的。此外，本领域的技术人员将认识到，在具有治疗有效量的组合疗法的情况下，如在上述实例中，raf抑制剂的量和/或aurora激酶抑制剂的量单独地可以是或可以不是治疗有效的。

关于药剂对细胞的作用的“细胞毒性作用”是指杀死细胞。“细胞生长抑制作用”是指抑制细胞增殖。“细胞毒性剂”是指对细胞具有细胞毒性或细胞生长抑制作用、从而分别消减细胞群体内的细胞或抑制细胞群体内的细胞的生长的药剂。

如本文所用的术语“受试者”是指哺乳动物，并且“哺乳动物”包括但不限于人。在一些实施方案中，在根据本公开的方法开始治疗之前，已经用药剂(例如，raf抑制剂或aurora激酶抑制剂)治疗了受试者。在一些实施方案中，受试者处于发展或经历癌症复发的风险中。

除非另外说明，否则本文所描绘的结构意在包括不同之处仅在于存在一个或多个同位素富集的原子的化合物。例如，具有本发明的结构(除了氢原子被氘或氚置换或碳原子被富含13c或14c的碳置换外)的化合物在本公开的范围内。

将对本领域的技术人员显而易见的是，本文描述的某些化合物可以互变异构体形式存在，所述化合物的所有此类互变异构体形式在本公开的范围内。除非另外说明，否则本文所描绘的结构还意在包括所述结构的所有立体化学形式；即，每个不对称中心的r和s构型。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体和非对映异构体混合物在本公开的范围内。

可在本公开的方法中使用能够抑制raf激酶的活性的化合物。在一些实施方案中，raf抑制剂抑制b-raf、突变型b-raf、a-raf和c-raf。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf、b-rafv600e、a-raf和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf、b-rafv600e、a-raf和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf、b-rafv600d、a-raf和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf、b-rafv600k和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf、b-rafv600e和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf、b-rafv600d和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对b-raf、b-rafv600k和c-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对突变型b-raf有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对突变型b-rafv600e有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对突变型b-rafv600d有选择性。在一些实施方案中，raf抑制剂对突变型b-rafv600k有选择性。

具体地说，raf抑制剂包括本文所述的化合物，以及在例如wo2006/065703、wo2010/064722、wo2011/117381、wo2011/090738、wo2011/161216、wo2011/097526、wo2011/025927、wo2011/023773、wo2011/147764、wo2011/079133和wo2011/063159中公开的化合物。raf抑制剂包括威罗菲尼、达拉菲尼和encoratinib。这些化合物中任一种的溶剂化形式和水合形式也适用于本公开的方法中。所述化合物中任一种的药学上可接受的盐以及此类盐的溶剂化形式和水合形式也适用于本公开的方法中。这些raf抑制剂可以有机合成领域中的技术人员所熟知的多种方式制备，包括但不限于上述参考文献中详细描述的合成方法。

在一些实施方案中，raf抑制剂是小分子量化合物。在一些实施方案中，raf抑制剂是泛-raf抑制剂。具体地说，泛-raf抑制剂包括化合物a，以及例如在wo2009/006389、wo2006/06570和us2013/0252977(dp-4978)中公开的化合物。

可在体外或体内测定raf抑制剂结合和/或抑制raf激酶的能力。体外测定包括测量raf激酶对mek的磷酸化作为定量化合物抑制raf激酶的酶活性的能力的方法的生物化学fret测定。还可以测定所述化合物影响由raf激酶活性介导的细胞或生理功能的能力。例如，体外测定定量癌细胞中磷-erk的量。这些活性中的每一种的测定是本领域中已知的。

在一些实施方案中，raf抑制剂是(r)-2-(1-(6-氨基-5-氯嘧啶-4-甲酰胺)乙基)-n-(5-氯-4-(三氟甲基)吡啶-2-基)噻唑-5-甲酰胺(化合物a)或其药学上可接受的盐：

(化合物a)。化合物a描述于wo2009/006389中。

可在本公开的方法中使用能够抑制aurora激酶的酶活性的化合物。具体地说，aurora激酶抑制剂包括本文所述的化合物，以及在例如，wo05/111039、us2005/0256102、us2007/0185087、wo08/021038、us2008/0045501、wo08/063525、us2008/0167292、wo07/113212、ep1644376、us2005/0032839、wo05/005427、wo06/070192、wo06/070198、wo06/070202、wo06/070195、wo06/003440、wo05/002576、wo05/002552、wo04/071507、wo04/058781、wo06/055528、wo06/055561、wo05/118544、wo05/013996、wo06/036266、us2006/0160874、us2007/0142368、wo04/043953、wo07/132220、wo07/132221、wo07/132228、wo04/00833和wo07/056164中公开的化合物。这些化合物中任一种的溶剂化形式和水合形式也适用于本公开的方法中。所述化合物中任一种的药学上可接受的盐以及此类盐的溶剂化形式和水合形式也适用于本公开的方法中。这些aurora激酶抑制剂可以有机合成领域中的技术人员所熟知的多种方式制备，包括但不限于上述参考文献中详细描述的合成方法。

在一些实施方案中，选择性auroraa激酶抑制剂是小分子量化合物。具体地说，auroraa激酶的选择性抑制剂包括本文所述的化合物，以及在例如us2008/0045501、us7,572,784、wo05/111039、wo08/021038、us7,718,648、wo08/063525、us2008/0167292、us8,026,246、wo10/134965、us2010/0310651、wo11/014248、us2011/0039826和us2011/0245234中公开的化合物，其各自特此以引用的方式整体并入，4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸钠，kw-2449(kyowa)、enmd-2076(entremed)以及mk-5108(vertex/merck)。

可在体外或体内测定auroraa激酶抑制剂选择性地结合和/或抑制auroraa激酶的能力。体外测定包括用于确定auroraa激酶磷酸化底物蛋白或肽的能力的选择性抑制的测定。替代体外测定定量所述化合物选择性地结合auroraa激酶的能力。选择性抑制剂结合可通过在结合之前放射性标记抑制剂、分离抑制剂/auroraa激酶复合物并测定所结合的放射性标记的量来测量。或者，选择性抑制剂结合可通过进行竞争实验来测定，其中将新的抑制剂与和已知放射性配体结合的auroraa激酶一起孵育。还可以测定所述化合物影响由auroraa激酶活性介导的细胞或生理功能的能力。为了评定对auroraa激酶的超过对aurorab激酶的选择性，还可使用与以上针对auroraa激酶所描述的那些测定类似的测定，在体外和体内测定抑制剂选择性地结合和/或抑制aurorab激酶的能力。可通过phish3的免疫荧光检测，在不存在aurorab激酶抑制的情况下在体外和体内测定抑制剂抑制auroraa激酶的能力。(proc.natl.acad.sci.(2007)104，4106)。这些活性中的每一种的测定是本领域中已知的。

在一些实施方案中，auroraa激酶抑制剂是式(i)的4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸((阿立塞替(mln8237))，或其药学上可接受的盐：

在一些实施方案中，式(i)的药学上可接受的盐是式(ii)的4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸钠，或其结晶形式：

在一些实施方案中，式(ii)的化合物是4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸钠。在一些实施方案中，式(ii)的化合物是4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸钠一水合物。在一些实施方案中，式(ii)的化合物是4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸钠多晶型物形式2，如us2008/0167292、us8,026,246和us2011/0245234中所描述，其各自特此以引用的方式整体并入。

在一些实施方案中，与非接触细胞的生长相比，与raf抑制剂和aurora激酶抑制剂接触的细胞的生长被延迟至少约50％。在一些实施方案中，与非接触细胞相比，接触细胞的细胞增殖被抑制至少约75％、至少约90％或至少约95％。在一些实施方案中，短语“抑制细胞增殖”包括与非接触细胞相比，接触细胞的数目减少。因此，抑制接触细胞中的细胞增殖的raf抑制剂和aurora激酶抑制剂可诱导所述接触细胞经历生长迟缓、经历生长停滞、经历程序性细胞死亡(即，细胞凋亡)或经历坏死性细胞死亡。

另一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含i)raf抑制剂和ii)aurora激酶抑制剂。本公开提供用于治疗癌症的新的组合疗法。具体地说，本公开提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用：(i)第一组合物，其包含raf抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性剂；和(ii)第二组合物，其包含aurora激酶抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性剂；所述活性剂的量是使得其组合在癌症的治疗中是治疗上有效的。

在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤癌症。在一些实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症复发性的。一方面，复发性癌症是在不可检测到癌症的一段时间之后复发的癌症。

在一些实施方案中，癌症是难治性的。一方面，难治性癌症对癌症治疗无反应；它也被称为抗性癌症。在一些实施方案中，肿瘤是不可切除的。一方面，不可切除的肿瘤不能通过外科手术移除。在一些实施方案中，癌症先前尚未进行治疗。在一些实施方案中，癌症是局部晚期的。一方面，“局部晚期”是指比较广泛但仍局限在一个区域的癌症。在一些情况下，“局部晚期”可以指尚未扩散但已侵入附近器官或组织而使其难以用单独外科手术移除的小肿瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性的。一方面，转移性癌症是从其开始的身体部位(主要部位)扩散到身体其他部位的癌症。

在一些实施方案中，癌症是braf突变阳性癌症。如本文所用，“braf”或“b-raf”是指b-raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶，与指定为nm_004333，seqidno:1(开放阅读框是seqidno:2，seqidno:1的核苷酸62至2362)的mrna序列相关的基因，所述mrna序列编码genpept登录号np_004324，seqidno:3)。b-raf的其他名称包括rafb1和努南综合征7(ns7)。b-raf充当丝氨酸/苏氨酸激酶，在调控map激酶/erk信号传导路径中起作用且可在染色体7q上发现。

在一些实施方案中，癌症是b-raf突变阳性癌症。在一些实施方案中，b-raf突变包括但不限于v600e、v600d或v600k突变。在一些实施方案中，b-raf突变是v600e。在一些实施方案中，b-raf突变是v600d。在一些实施方案中，b-raf突变是v600k。在一些实施方案中，b-raf突变是v600e+t5291。在一些实施方案中，b-raf突变是v600e+g468a。“v600e突变”是指在氨基酸位置600处用谷氨酸取代缬氨酸。t529i是苏氨酸至异亮氨酸b-raf守门员突变，并且g468a是外显子11中g1403c处的b-raf二级突变。“v600k突变”是指在氨基酸位置600处用赖氨酸取代缬氨酸。“v600d突变”是指在氨基酸位置600处用天冬氨酸取代缬氨酸。v600k突变导致b-raf中位置600处从缬氨酸(v)至赖氨酸(k)的氨基酸取代。v600k突变导致b-raf中位置600处从缬氨酸(v)至赖氨酸(k)的氨基酸取代。

在一些实施方案中，癌症是nras突变阳性癌症。如本文所用，“nras”或“n-ras”是指成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)致癌基因同源物，与指定为genbank登录号nm_002524，seqidno:4(开放阅读框是seqidno:5，seqidno:7的核苷酸255至824)的mrna序列相关的基因，所述mrna序列编码genpept登录号np_002515，seqidno:6)。n-ras的其他名称包括iv型自身免疫性淋巴细胞增生综合征(alps4)、nras1和努南综合征6(ns6)。n-ras充当具有gtp酶活性的致癌基因且可在染色体1p上发现。n-ras与细胞膜和各种效应蛋白(如raf和rhoa)相互作用，所述效应蛋白通过细胞骨架和对细胞粘附的作用执行其信号传导功能(fotiadou等人(2007)mol.cel.biol.27:6742-6755)。

在一些实施方案中，癌症是nras突变阳性癌症。一方面，nras突变是q61r突变。

本公开提供一种治疗患有癌症的受试者的方法。在一些实施方案中，癌症选自皮肤癌、眼癌、胃肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、中枢神经系统癌症、喉癌、子宫颈癌、淋巴系统癌症、泌尿生殖道癌症、骨癌、胆道癌、子宫内膜癌、肝癌、肺癌、前列腺癌以及结肠癌。在一些实施方案中，癌症不是非小细胞肺癌(nsclc)。在一些实施方案中，癌症选自皮肤癌、眼癌、胃肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑癌、喉癌、子宫颈癌、淋巴系统癌症、泌尿生殖道癌症、骨癌、胆道癌、子宫内膜癌、肝癌、肺癌、前列腺癌以及结肠癌。

在一些实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤选自急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)和骨髓增生异常综合征。

在一些实施方案中，癌症选自甲状腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、急性骨髓性白血病(aml)和结肠癌。在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤或结肠癌。

在一些实施方案中，癌症是皮肤癌。在一些实施方案中，皮肤癌是黑色素瘤。在一些实施方案中，黑色素瘤是b-raf突变型黑色素瘤。在一些实施方案中，黑色素瘤是nras突变型黑色素瘤。

在一些实施方案中，癌症是胃肠癌。如本文所用，“胃肠癌”包括食道癌、胃癌(也称胃癌)、胆道系统癌、胰腺癌、小肠癌、大肠癌、直肠癌和肛门癌)。在一些实施方案中，胃肠癌是食道腺癌、胃食管结合部腺癌或胃腺癌。在一些实施方案中，胃肠癌是胃癌。在一些实施方案中，癌症是结肠癌。结肠癌也被称为结肠直肠(crc)癌、肠癌或直肠癌。

在一些实施方案中，癌症是中枢神经系统癌症。在一些实施方案中，中枢神经系统癌症是脑癌。

在一些实施方案中，甲状腺癌是甲状腺癌。

在一些实施方案中，泌尿生殖道癌症是膀胱癌。

raf抑制剂和aurora激酶抑制剂以使得它们在癌症治疗中提供协同作用的这样一种方式施用。施用可通过任何合适的方式，条件是所述施用提供所需的治疗作用，即协同作用。在一些实施方案中，raf抑制剂和aurora激酶抑制剂在同一治疗周期期间施用，例如，在一个治疗周期期间，例如三或四周时间段，将raf激酶抑制剂和aurora激酶抑制剂两者均施用至受试者。

在一些实施方案中，将raf抑制剂和aurora激酶抑制剂循环施用至受试者。循环治疗涉及施用第一药剂(例如，第一预防或治疗剂)一段时间，随后施用第二药剂和/或第三药剂(例如，第二和/或第三预防或治疗剂)一段时间，并且重复这种顺序施用。循环治疗可减少对一种或多种疗法的抗性的发展、避免或减少所述疗法之一的副作用和/或提高治疗的功效。

在一些实施方案中，施用药剂的治疗期间之后是特定时间持续时间的非治疗期，在此期间不向受试者施用治疗剂。所述非治疗期之后可以是相同或不同频率的一系列后续治疗期和非治疗期持续相同或不同的时间长度。在一些实施方案中，治疗期和非治疗期是交替的。应理解，循环治疗中的治疗期可持续直到受试者实现完全应答或部分应答，此时可停止治疗。或者，循环治疗中的治疗期可持续直到受试者实现完全应答或部分应答，此时治疗期可持续特定数量的循环。在一些实施方案中，治疗期的长度可以是特定数量的循环，而不管受试者应答。在一些其他实施方案中，治疗期的长度可持续直到受试者复发。

raf抑制剂的量或合适剂量取决于许多因素，包括待治疗病状的严重程度的性质、特定抑制剂、施用途径以及个体受试者的年龄、体重、一般健康状况和应答。在一些实施方案中，合适的剂量水平是实现b-raf、c-raf、a-raf和/或b-rafv600e的抑制的剂量水平。在一些实施方案中，合适的剂量水平是实现b-raf、c-raf和/或b-rafv600e的抑制的剂量水平。在一些实施方案中，合适的剂量水平是如通过肿瘤消退、或疾病进展、无进展存活或总体存活的其他标准测量而测量的实现治疗应答的剂量水平。在一些实施方案中，合适的剂量水平是实现这种治疗应答并且还使与施用治疗剂相关的任何副作用最小化的剂量水平。

raf激酶抑制剂的合适每日剂量通常可以单次或分次或多次剂量在作为单一药剂的最大耐受剂量的约10％至约100％的范围内。在一些实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约15％至约100％。在一些实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约25％至约90％。在一些其他实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约30％至约80％。在一些其他实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约40％至约75％。在一些其他实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约45％至约60％。在一些实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约105％或约110％。

应理解，可在白天或晚上的任何时间服用合适剂量的raf抑制剂。在一些实施方案中，在早晨服用合适剂量的raf抑制剂的选择性抑制剂。在一些其他实施方案中，在晚上服用合适剂量的raf抑制剂。在一些其他实施方案中，在早晨和晚上均服用合适剂量的raf抑制剂。应理解，可与或不与食物一起服用合适剂量的raf抑制剂。在一些实施方案中，与膳食一起服用合适剂量的raf抑制剂。在一些实施方案中，在禁食时服用合适剂量的raf抑制剂。

本公开提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用：(i)第一组合物，其包含化合物a或其药学上可接受的盐作为活性剂；和(ii)第二组合物，其包含阿立塞替或其药学上可接受的盐作为活性剂；所述活性剂的量是使得其组合在癌症的治疗中是治疗上有效的。在一些实施方案中，每周一次(qw)施用化合物a，在每次施用之间具有6天休息期。raf抑制剂(例如化合物a)的合适每周剂量通常可以单次或分次或多次剂量在每周一次(qw)达约1500mg的范围内。qw意味着每次施用之间具有6天休息期的给药。在一些实施方案中，化合物a作为单剂量施用。在一些实施方案中，化合物a以分次剂量施用。在一些实施方案中，化合物a作为在同一天的分次剂量施用。在一些实施方案中，化合物a以多个剂量施用。化合物a的合适每周剂量是每周一次每剂量达约1000mg，在每次施用之间具有6天休息期。化合物a的其他合适的每周剂量通常可以单次或分次或多次剂量在每周一次每剂量约200mg至约1000mg的范围内。在一些实施方案中，化合物a的合适每周剂量是每剂量达600mg。化合物a的其他合适的每周剂量通常可以单次或分次或多次剂量在约400mg至约1000mg的范围内。在一些实施方案中，合适的每周剂量是每周一次每剂量约400mg至约900mg。在一些实施方案中，合适的每周剂量是每周一次每剂量约500mg至约900mg。在一些其他实施方案中，合适的每周剂量是每周一次每剂量约400mg至约600mg。在一些其他实施方案中，合适的每周剂量是每周一次每剂量约200mg至约500mg。在一些其他实施方案中，合适的每周剂量是每周一次每剂量约200mg至约300mg。在一些实施方案中，合适的每周剂量是每周一次每剂量约200mg、300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg或约900mg。

在一些实施方案中，化合物a以每剂量达约200mg施用。raf抑制剂(例如化合物a)的合适每周剂量通常可以单次或分次或多次剂量在每剂量达约200mg的范围内。在一些实施方案中，化合物a作为单剂量施用。在一些实施方案中，化合物a以分次剂量施用。在一些实施方案中，化合物a以多个剂量施用。化合物a的其他合适剂量通常可以单次或分次或多次剂量在每剂量约50mg至约200mg的范围内。化合物a的其他合适剂量通常可以单次或分次或多次剂量在每剂量约75mg至约200mg的范围内。在一些实施方案中，合适的剂量是每剂量约100mg至约200mg。在一些其他实施方案中，合适的剂量是每天两次约150mg至约200mg。在一些实施方案中，合适的剂量是每剂量约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约105mg、约110mg、约115mg、约120mg、约125mg、约130mg、约135mg、约140mg、约145mg、约150mg、约155mg、约160mg、约165mg、约170mg、约175mg、约180mg、约185mg、约190mg、约195mg或约200mg。在一些实施方案中，化合物a的合适剂量是每剂量约100mg至约200mg。

施用至受试者的raf抑制剂的剂量还将取决于施用频率。在一些实施方案中，每周一次(qw)施用化合物a，在每次施用之间具有6天休息期。在一些实施方案中，每天施用化合物a。在一些实施方案中，每隔一天施用化合物a。在一些实施方案中，化合物a按28天周期施用，其中化合物a在28天周期的第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天、第15天、第17天、第19天、第22天、第24天和第26天施用。

对于本领域的技术人员将显而易见的是，提供所需治疗作用的其他raf抑制剂剂量或施用频率适用于本公开。

auroraa激酶的选择性抑制剂的量或合适剂量取决于许多因素，包括待治疗病状的严重程度的性质、特定抑制剂、施用途径以及个体受试者的年龄、体重、一般健康状况和应答。在一些实施方案中，合适的剂量水平是如通过增加的皮肤有丝分裂指数、或肿瘤有丝分裂细胞中减少的染色体配对和纺锤体双极性、或癌症患者中有效暴露的其他标准测量而测量的实现有效暴露的剂量水平。在一些实施方案中，合适的剂量水平是如通过肿瘤消退、或疾病进展、无进展存活或总体存活的其他标准测量而测量的实现治疗应答的剂量水平。在一些实施方案中，合适的剂量水平是实现这种治疗应答并且还使与施用治疗剂相关的任何副作用最小化的剂量水平。

auroraa激酶的选择性抑制剂的合适每日剂量通常可以单次或分次或多次剂量在作为单一药剂的最大耐受剂量的约10％至约100％的范围内。在一些实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约15％至约100％。在一些实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约25％至约90％。在一些其他实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约30％至约80％。在一些其他实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约40％至约75％。在一些其他实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约45％至约60％。在一些实施方案中，合适的剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约105％或约110％。

应理解，可在白天或晚上的任何时间服用合适剂量的auroraa激酶的选择性抑制剂。在一些实施方案中，在早晨服用合适剂量的auroraa激酶的选择性抑制剂。在一些其他实施方案中，在晚上服用合适剂量的auroraa激酶的选择性抑制剂。在一些其他实施方案中，在早晨和晚上均服用合适剂量的auroraa激酶的选择性抑制剂。应理解，可与或不与食物一起服用合适剂量的auroraa激酶的选择性抑制剂。在一些实施方案中，与膳食一起服用合适剂量的auroraa激酶的选择性抑制剂。在一些实施方案中，在禁食时服用合适剂量的auroraa激酶的选择性抑制剂。

阿立塞替的合适每日剂量通常可以单次或分次或多次剂量在约20mg至约120mg/天的范围内。阿立塞替的其他合适的每日剂量通常可以单次或分次或多次剂量在约30mg至约90mg/天的范围内。阿立塞替的其他合适的每日剂量通常可以单次或分次或多次剂量在约40mg至约80mg/天的范围内。在一些实施方案中，合适的剂量是每天两次给予的每剂量约10mg至约50mg。在一些实施方案中，合适的剂量是每天两次给予的每剂量约30mg至约50mg。在一些其他实施方案中，合适的剂量是每天两次给予的每剂量约40mg至约50mg。在一些其他实施方案中，合适的剂量是每天两次给予的每剂量约30mg至约40mg。在一些其他实施方案中，合适的剂量是每天两次给予的每剂量约25mg至约40mg。在一些实施方案中，合适的剂量是约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约105mg、约110mg、约115mg或约120mg/天。在某些其他实施方案中，合适的剂量是每天两次给予的每剂量约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg或约60mg。在一些实施方案中，阿立塞替的合适剂量是每天两次给予的每剂量约40mg。在一些实施方案中，阿立塞替的合适剂量是每天两次给予的每剂量约30mg。在一些实施方案中，阿立塞替的合适剂量是每天两次给予的每剂量约35mg。在一些实施方案中，阿立塞替的合适剂量是每天两次给予的每剂量约50mg。

在一些实施方案中，其中施用第一量的auroraa激酶的选择性抑制剂的第一治疗期之后可以是另一个治疗期，其中施用相同或不同量的auroraa激酶的相同或不同的选择性抑制剂。第二个治疗期之后可以是其他治疗期。在治疗期和非治疗期期间，可向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。

在一些实施方案中，对于4周周期(例如28天)中的3周，aurora激酶抑制剂3天施用且4天休息。在一些实施方案中，aurora激酶抑制剂按28天周期施用，其中auroraa激酶抑制剂在28天周期的第1天、第2天、第3天、第8天、第9天、第10天、第15天、第16天和第17天施用。在一些实施方案中，aurora激酶抑制剂按28天周期每日两次施用，其中auroraa激酶抑制剂在28天周期的第1天、第2天、第3天、第8天、第9天、第10天、第15天、第16天和第17天施用。在一些实施方案中，阿立塞替按28天周期每日两次施用，其中auroraa激酶抑制剂在28天周期的第1天、第2天、第3天、第8天、第9天、第10天、第15天、第16天和第17天施用。

raf抑制剂和aurora激酶抑制剂的施用可在相同或不同的日期，条件是施用提供所需的治疗作用。在本公开的一些实施方案中，raf抑制剂和auroraa激酶抑制剂的施用将在相同日期。在本公开的一些实施方案中，raf抑制剂和auroraa激酶抑制剂的施用将在相同和/或不同的日期，例如，化合物a在28天周期的第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天、第15天、第17天、第19天、第22天、第24天和第26天施用，并且阿立塞替在28天周期的第1天、第2天、第3天、第8天、第9天、第10天、第15天、第16天和第17天施用。本公开涵盖替代治疗周期，只要它们产生所需的结果即可。

auroraa激酶抑制剂可以单一剂型或作为单独的剂型与raf抑制剂一起施用。当作为单独剂型施用时，raf抑制剂可在施用本公开的auroraa激酶抑制剂之前、同时或之后施用。

在一些实施方案中，施用有益量的治疗剂涵盖在28天治疗周期期间在第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天、第15天、第17天、第19天、第22天、第24天和第26天以每剂量约100mg至约200mg(化合物a的测量的量)施用化合物a与在28天治疗周期期间在第1天、第2天、第3天、第8天、第9天、第10天、第15天、第16天和第17天以每天两次给予的每剂量约30至约50mg(作为阿立塞替的量测量的)的量施用阿立塞替或其药学上可接受的盐的组合。在一些实施方案中，有益量的治疗剂是协同量。在一些实施方案中，有益量的治疗剂是相加量。

在一些实施方案中，用于治疗患有癌症的受试者的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的一定量的化合物a和一定量的阿立塞替或其药学上可接受的盐的组合。这些癌症受试者包括但不限于具有b-raf突变的黑色素瘤受试者、威罗菲尼或其他b-raf抑制剂失败的黑色素瘤受试者、具有n-ras突变b-raf野生型的黑色素瘤患者、具有b-rafv600e突变b-raf野生型的结肠直肠癌受试者、具有b-rafv600e突变b-raf野生型的卵巢癌受试者、具有b-rafv600e突变b-raf野生型的肺癌患者、具有n-ras突变b-raf野生型的aml受试者、具有n-ras突变b-raf野生型的肝癌受试者、具有b-rafv600e或n-ras突变b-raf野生型的甲状腺癌受试者、具有b-raf野生型的胰腺癌受试者、具有b-raf野生型的胆道癌受试者。

本公开提供一种用于延长患有癌症的受试者中对治疗的应答的持续时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用：(i)第一组合物，其包含raf抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性剂；和(ii)第二组合物，其包含aurora激酶抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性剂；所述活性剂的量是使得其组合对于延长应答的持续时间而言是有效的。

raf抑制剂可通过本领域的技术人员已知的任何方法施用。例如，raf抑制剂可以第一组合物的形式施用，在一些实施方案中以raf抑制剂和药学上可接受的载体的药物组合物(如本文所述的那些)的形式施用。在一些实施方案中，第一组合物是如在2014年3月26日提交的美国临时申请61/970,595和wo2015/148828中所描述的固体分散体挤出物。在一些实施方案中，第一组合物是包含乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的固体分散体挤出物。在一些实施方案中，共聚物是共聚维酮，例如va64。在一些实施方案中，第一组合物是非晶形的。

auroraa激酶的选择性抑制剂可通过本领域的技术人员已知的任何方法施用。例如，auroraa激酶的选择性抑制剂可以第二组合物的形式施用，在一些实施方案中作为auroraa激酶的选择性抑制剂和药学上可接受的载体的药物组合物(如本文所述的那些)施用。一方面，药物组合物适合于口服施用。在一些实施方案中，药物组合物是用于口服施用的片剂，例如肠溶包衣片剂。此类片剂描述于us2010/0310651中，其特此以引用的方式整体并入。在一些其他实施方案中，药物组合物是用于口服施用的液体剂型。此类液体剂型描述于us2011/0039826中，其特此以引用的方式并入。在一些实施方案中，这些组合物任选地还包含一种或多种另外的治疗剂。

如果在这些组合物中使用raf抑制剂或aurora激酶抑制剂的药学上可接受的盐，则所述盐优选地衍生自无机或有机酸或碱。对于合适的盐的综述，参见例如，berge等人，j.pharm.sci.66:1-19(1977)和remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第20版，a.gennaro编著，lippincottwilliams&wilkins，2000。

合适的酸加成盐的非限制性实例包括以下：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(lucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基-丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐以及十一酸盐。

合适的碱加成盐包括但不限于，铵盐；碱金属盐，如钠盐和钾盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐；与有机碱如二环己基胺、n-甲基-d-葡糖胺、叔丁胺、乙二胺、乙醇胺和胆碱的盐；以及与氨基酸如精氨酸、赖氨酸等的盐。

此外，含有氮的碱性基团可用此类试剂季铵化：如低级烷基卤化物，如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物以及碘化物；二烷基硫酸酯，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯；长链卤化物，如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，如苄基和苯乙基溴化物；以及其他。因此获得水或油可溶性或可分散性产物。

术语“药学上可接受的载体”在本文中用于指与受体受试者相容的材料。一方面，受试者是哺乳动物。一方面，受试者是人。一方面，所述材料适合于将活性剂递送至靶位点而不终止所述活性剂的活性。与载体相关的毒性或不利作用(如果有的话)优选地与活性剂的预期用途的合理风险/益处比相称。

术语“载体”、“佐剂”或“媒介物”可互换使用并且包括任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适合于所需的具体剂型。remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第20版，a.gennaro编著，lippincottwilliams&wilkins，2000公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体和用于其制备的已知技术。除了如通过产生任何所不希望的生物效应或另外以有害的方式与药物组合物的任何其他组分相互作用而与本公开的化合物不相容的任何常规的载体介质以外，所述载体的用途将涵盖在本公开的范围内。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质(如磷酸氢二钠、磷酸氢钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、氢氧化镁和氢氧化铝)、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、无热原水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠和锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、羊毛脂、糖(如乳糖、葡萄糖、蔗糖)、淀粉(如玉米淀粉和马铃薯淀粉)、纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素)、粉状黄蓍胶、麦芽、明胶、滑石、赋形剂(如可可脂和栓剂蜡)、油(如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、二醇类(如丙二醇和聚乙二醇)、酯(如油酸乙酯和月桂酸乙酯)、琼脂、藻酸、等渗盐水、林格氏溶液、醇(如乙醇、异丙醇、十六烷醇和甘油)、环糊精、润滑剂(如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)、石油烃(如矿物油和凡士林)。根据配方师的判断，着色剂、释放剂、包覆剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂以及抗氧化剂也可存在于组合物中。

本公开的药物组合物可通过本领域中熟知的方法如常规粒化、混合、溶解、胶囊化、冻干或乳化工艺等来生产。组合物可以多种形式产生，包括颗粒、沉淀、或微粒、粉末，包括冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥粉末、非晶粉末、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射液、乳液、酏剂、混悬液或溶液。制剂可任选地包含溶剂、稀释剂和其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、ph调节剂、等渗剂、增稠或乳化剂、稳定剂和防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适合于所需的具体剂型。

在一些实施方案中，本公开的组合物被配制用于向哺乳动物药物施用。一方面，用于向人药物施用。本公开的此类药物组合物可通过口服、胃肠外、吸入喷雾、局部、直肠、鼻、口腔、阴道或经由植入式储药器的方式施用。如本文所用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。优选地，口服、静脉内或皮下施用所述组合物。本公开的制剂可被设计为短效、快速释放或长效。此外，化合物可以局部而非全身的方式施用，如在肿瘤部位施用(例如通过注射)。

用于口服施用的液体剂型包括但不限于，药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬液、糖浆以及酏剂。除活性化合物外，液体剂型可含有通常在本领域中使用的惰性稀释剂，例如像水或其他溶剂、溶解剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、环糊精、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇以及山梨醇酐的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂。

可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性混悬液可根据已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在胃肠外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、混悬液或乳剂，例如，作为1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液(u.s.p.)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。出于这一目的，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或二甘油酯。此外，脂肪酸如油酸用于制备可注射制剂。可注射制剂可例如通过经由细菌滞留过滤器过滤，或通过并入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。配制用于胃肠外施用的组合物可通过快速浓注或通过定时推入注射，或者可通过连续输注来施用。

为了延长本公开的化合物的作用，通常可期望减缓对来自皮下注射或肌内注射的化合物的吸收。这可通过使用水溶性差的结晶或非晶材料的液体混悬液来实现。化合物的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率进而可取决于晶体大小和晶形。或者，胃肠外施用的化合物形式的延迟吸收通过将化合物溶解或悬浮于油性媒介物中来实现。可注射储库式形式通过在可生物降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成化合物的微胶囊基质来形成。取决于化合物与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质，可控制化合物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库式可注射制剂也可通过在可与身体组织相容的脂质体或微乳液中包封化合物来制备。

用于直肠或阴道施用的组合物优选地是可通过使公开的化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体混合而制备的栓剂，所述赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡，它们在环境温度下为固体但在体温下为液体，并且因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。

用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物与至少一种药学上可接受的惰性赋形剂或载体(如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂，例如像羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)湿润剂，如甘油；d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶解阻滞剂，如石蜡；f)吸收促进剂，如季铵化合物；g)润湿剂，例如像十六醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸附剂，如高岭土和膨润土；以及i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂，如磷酸盐或碳酸盐。

相似类型的固体组合物也可使用此类赋形剂如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等来用作软质和硬质填充的明胶胶囊中的填充剂。片剂、糖锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可使用包衣和包壳如肠溶衣和制药领域中熟知的其他包衣来制备。它们可任选地含有乳浊剂并且也可具有仅在或优选在肠道的某一部分，任选地以延迟的方式释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。相似类型的固体组合物也可使用此类赋形剂如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等来用作软质和硬质填充的明胶胶囊中的填充剂。

所述活性化合物还可以是具有如上所述的一种或多种赋形剂的微囊化形式。片剂、糖锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可使用包衣和包壳如肠溶衣、释放控制包衣和制药领域中熟知的其他包衣来制备。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉混合。按照一般的惯例，此类剂型还可包含除惰性稀释剂以外的其他物质，例如，压片润滑剂和其他压片助剂，如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。它们可任选地含有乳浊剂并且也可具有仅在或优选在肠道的某一部分，任选地以延迟的方式释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

本公开的化合物的局部或经皮施用的剂型包括：软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。在无菌条件下，将活性组分与药学上可接受的载体以及任何所需的防腐剂或可能需要的缓冲剂混合。眼用制剂、滴耳剂和滴眼剂也涵盖在本公开的范围内。另外，本公开涵盖经皮贴剂的用途，所述经皮贴剂具有提供将化合物受控制地递送至身体的额外优点。此类剂型可通过将化合物溶解或分散于适当的介质中来制备。吸收促进剂也可用于增加化合物穿过皮肤的通量。速率可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。

用于本公开的方法中的组合物可以单位剂型配制，以便于施用和剂量的均匀性。如本文所用的表达“单位剂型”是指适合于所治疗受试者的物理上离散的药剂单元。然而，应理解，本公开的化合物和组合物的总每日用量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。用于胃肠外施用的单位剂型可在安瓿或多剂量容器中。

本公开包括一种试剂盒，其包括：(i)第一组合物，其包含raf抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性剂；和(ii)第二组合物，其包含aurora激酶抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性剂；以及用于施用所述第一组合物与所述第二组合物的组合的说明书。

本公开包括一种试剂盒，其包括：当用于治疗受试者的癌症时(i)第一组合物，其包含raf抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性剂；和(ii)第二组合物，其包含aurora激酶抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性剂；以及用于施用所述第一组合物与所述第二组合物的组合的说明书。

威罗菲尼(roche)被美国食品与药品管理局(fda)批准用于治疗具有b-rafv600e突变的黑色素瘤患者。最近，达拉菲尼(b-raf抑制剂)和曲美替尼(mek抑制剂)被批准用于具有b-rafv600e阳性黑色素瘤的患者。与3期研究中的化学疗法相比，两种药物均显著提高中位无进展存活期。然而，与威罗菲尼的情况一样，这些应答被认为是短暂的(lancet(2012；380:358-365)，nengljmed2012；367:107-114)。与许多其他靶向疗法类似，对b-raf抑制的获得性抗性对这一患者群体的长期存活益处提出了治疗性挑战。

为了提高b-raf抑制剂的益处，研究继续以鉴定使表达突变型b-raf的黑素瘤细胞对威罗菲尼有抗性的机制。最近的研究表明，mapk途径的再活化是对b-raf抑制的抗性机制。抗性机制主要涉及通过旁路机制再活化erk信号传导，所述旁路机制是ras/raf依赖性的，如n-ras活化(nazarian等人，nature.2010，468：973-7)、h-ras活化(su等人，newenglandjournalofmedicine.2012，366：207-215)或c-raf上调(johannessen等人，nature.2010，468：968-72；montagut等人，cancerres.2008，68：4853-61)、b-rafv600e的异常剪接变体(poulikakos等人，nature.2011，480：387-390)，或ras/raf无关的(tpl2/cot过度表达)johannessen等人，nature.2010，468：968-72。因此，多种机制可减弱b-raf突变型癌症中b-raf抑制对mapk信号传导的影响。虽然可能引起对b-raf抑制的抗性的b-raf(t529i)的守门员突变尚未在临床上鉴定，但是这种突变已在实验上证明引起抗性，whittaker等人，scitranslmed.2010，2(35)：ra41。最近的研究还表明，通过rtk如igf-1r或pdgfrβ活化mapk-冗余信号传导途径可在对b-raf抑制的获得性抗性中起作用；nazarian等人，nature.2010，468：973-7；villanueva等人，cancercell.2010，18：683-95；shi等人，cancerres.2011，71：5067-74。显然，mapk再活化参与许多这些抗性机制。泛-raf抑制剂预期阻断mapk再活化。

另外，包括威罗菲尼及其紧密类似物n-[3-(5-氯-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺(plx4720；一种可商购的选择性b-raf抑制剂)的b-raf特异性抑制剂被证明通过与b-raf野生型背景中的其他raf同种型二聚化而诱导反常途径活化，hatzivassilioug,等人nature，2010，464：431-435；poulikakos等人，nature，2010，464：427-430；heidorn,等人，cell，2010，140：209-221。据信，威罗菲尼通过结合b-raf野生型并刺激b-raf-c-raf二聚化来活化raf/mek/erk途径。据信，通过b-raf特异性抑制的这种反常途径活化是在用威罗菲尼治疗的一些黑色素瘤患者中皮肤副作用(如鳞状细胞癌)的主要原因。由于其在这种遗传背景中的反常途径活化活性，威罗菲尼未被批准用于治疗具有b-raf野生型遗传背景的癌症患者。

化合物a是抑制包括b-raf、c-raf和b-rafv600e突变的raf蛋白质同种型的raf激酶抑制剂(参见实施例1)。由于其泛raf活性，化合物a通过上游信号传导如n-ras突变和k-ras突变(两者均具有b-raf野生型遗传背景)而是针对具有mapk途径活化的肿瘤细胞有活性的。因此，化合物a具有用于治疗具有b-raf突变(如黑色素瘤、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌和甲状腺癌)或n-ras突变、b-raf野生型(如黑色素瘤、aml、cml、all、cll、肝癌)的癌症患者的潜力，(schubbert等人，naturereviewscancer，2007，7：295；pylayeva-gupta等人，naturereviewscancer，2011，11：761)。化合物a还是针对发展对威罗菲尼的抗性的黑色素瘤肿瘤细胞有活性的。因此，据信化合物a与aurora激酶抑制剂的组合对于威罗菲尼或其他b-raf抑制剂失败的皮肤癌患者将是有效的。

本公开涉及用于确定是否用本文所述的药物组合物治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：

a)测量包含肿瘤细胞的受试者样品中与基因突变相关的至少一种或多种b-raf或n-ras标志物的至少一种特征；

b)鉴定在用所述药物组合物治疗后，在步骤a)中测量的至少一种特征对于结果是否是信息性的；以及

c)如果所述信息特征表明所述肿瘤细胞包含至少一种指示用所述药物组合物治疗的有利结果的具有b-raf和/或n-ras突变状态的标志物基因，则确定用所述药物组合物治疗所述受试者。

本公开涉及通过向患有癌症的受试者施用本文所述的药物组合物来治疗所述受试者的方法，所述方法包括：

a)测量包含肿瘤细胞的受试者样品中与基因突变相关的至少一种或多种b-raf或n-ras标志物的至少一种特征；

b)鉴定在用所述药物组合物治疗后，在步骤a)中测量的至少一种特征对于结果是否是信息性的；以及

c)如果所述信息特征表明所述肿瘤细胞包含至少一种指示用所述药物组合物治疗的有利结果的具有b-raf和/或n-ras突变状态的标志物基因，则确定用所述药物组合物治疗所述受试者。

本公开涉及用于确定被诊断患有癌症的受试者中通过药物组合物治疗的药理学有效性的增加的可能性的方法，所述方法包括：使来自所述受试者的癌症(肿瘤)样品的核酸样品经受b-raf和/或n-ras突变测试或pcr，其中在b-raf和/或n-ras基因中存在至少一种突变表明所述治疗的药理学有效性的可能性增加。

本公开涉及通过向患有癌症的受试者施用本文所述的药物组合物来治疗所述受试者的方法，所述方法包括：使来自所述受试者的癌症(肿瘤)样品的核酸样品经受b-raf和/或n-ras突变测试或pcr，其中在b-raf和/或n-ras基因中存在至少一种突变表明所述治疗的药理学有效性的可能性增加。

本公开涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：

i)从来自所述受试者的癌症样品获得核酸样品；

ii)使所述样品经受b-raf和/或n-ras突变测试或pcr，以及

鉴定b-raf和/或n-ras中至少一种突变的存在；以及

将有效量的本文所述的药物组合物施用至其样品中鉴定出b-raf和/或n-ras基因中存在至少一种突变的受试者。

在一些实施方案中，可通过测序核酸，例如dna、rna、cdna或与标志物基因(例如，基因型标志物基因，例如b-raf或n-ras)相关的蛋白质来鉴定标志物中的突变。本领域中存在若干测序方法来对核酸进行测序。核酸引物可被设计成结合至包含潜在突变位点的区域，或者可被设计成补充突变序列而不是野生型序列。引物对可被设计成包括包含标志物基因的潜在突变的区域。引物或引物对可用于测序对应于标志物基因的dna的一条或两条链。引物可与探针(例如核酸探针，例如杂交探针)结合使用以在测序之前扩增目标区域来加强用于检测标志物基因中的突变的序列量。可进行测序的区域的实例包括整个基因、基因的转录物以及基因或转录物的片段，例如外显子或非翻译区或包含突变位点的标志物的一部分中的一个或多个。用于引物选择和序列或组成分析的靶标的突变的实例可在收集突变信息的公共数据库中找到，如由美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)(bethesda，md)维护的基因型和表型数据库(dbgap)，以及由威康信托基金会桑格研究所(wellcometrustsangerinstitute)(cambridge，uk)维护的癌症体细胞突变目录(cosmic)数据库。

测序方法是本领域的技术人员已知的。方法的实例包括桑格法、sequenom^tm方法和下一代测序(ngs)方法。包括使用电泳(例如毛细管电泳以分离引物延伸的标记的dna片段)的桑格法可自动化用于高通量应用。引物延伸测序可在目标区域的pcr扩增后进行。软件可帮助序列碱基识别和突变鉴别。sequenom^tm测序分析(sandiego，ca)是将实际质量与特定目标片段的预期质量进行比较以鉴别突变的一种质谱方法。ngs技术(也称为“大规模并行测序”和“第二代测序”)通常提供比先前方法高得多的通量并且使用各种方法(综述于zhang等人(2011)j.genet.genomics38:95-109以及shendure和hanlee(2008)naturebiotech.26:1135-1145)。ngs方法可鉴别样品中标记物中的低频率突变。一些ngs方法(参见例如，gs-flx基因组测序仪(rocheappliedscience，branford，ct)、基因组分析仪(illumina，inc.sandiego，ca)、solid^tm分析仪(appliedbiosystems，carlsbad，ca)、polonatorg.007(doversystems，salem，nh)、heliscope^tm(helicosbiosciencescorp.，cambridge，ma))在流动池中空间上分离的pcr产物进行或不进行克隆扩增的情况下使用循环阵列测序以及各种方案来检测通过测序酶(例如聚合酶或连接酶)并入的标记的修饰的核苷酸。在一种ngs方法中，引物对可用于pcr反应中以扩增目标区域。扩增区域可连接成级联产物。克隆文库在流动池中从pcr或连接的产物产生并且进行进一步扩增(“桥”或“聚簇”pcr)以用于单末端测序，因为聚合酶添加标记的可逆封端碱基，所述碱基取决于标记的碱基的身份在四个通道中的一个中成像且然后对于下一个循环移除。软件可帮助与基因组序列的比较来鉴别突变。另一种ngs方法是外显子测序，其重点在于测序基因组中所有基因的外显子。与其他ngs方法一样，可通过捕获方法或扩增方法富集外显子。

在一些实施方案中，可使用本领域中已知的方法在生物样品中通过原位和体外形式分析dna，例如对应于野生型或突变标志物的基因组dna。dna可直接从样品中分离或在分离另一种细胞组分(例如，rna或蛋白质)后分离。试剂盒可供用于dna分离，例如dnamicro试剂盒(qiagen，valencia，ca)。也可使用此类试剂盒扩增dna。

在另一个实施方案中，可使用本领域中已知的方法在生物样品中通过原位和体外形式分析对应于标志物的mrna。许多表达检测方法使用分离的rna。对于体外方法，不针对分离mrna选择的任何rna分离技术可用于纯化来自肿瘤细胞的rna(参见例如，ausubel等人，编著，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork1987-1999)。此外，可使用本领域的技术人员熟知的技术，例如像chomczynski(1989，美国专利号4,843,155)的单步rna分离方法容易地加工大量组织样品。可使用标准程序(参见例如，chomczynski和sacchi(1987)anal.biochem.162:156-159)、溶液(例如，trizol，tri(molecularresearchcenter，inc.，cincinnati，oh；参见美国专利号5,346,994)或试剂盒(例如，group分离试剂盒(valencia，ca)或leukolock^tm总rna分离系统，ambiondivisionofappliedbiosystems，austin，tx)来分离rna。

可采用另外步骤来从rna样品中除去dna。细胞溶解可用非离子洗涤剂完成，然后进行微量离心以除去细胞核且因此除去大部分细胞dna。随后可从细胞核分离dna以用于dna分析。在一个实施方案中，使用硫氰酸胍溶解、随后cscl离心以分离rna与dna来从各种目标类型的细胞提取rna(chirgwin等人(1979)biochemistry18:5294-99)。通过用oligo-dt纤维素选择来选择poly(a)+rna(参见sambrook等人(1989)molecularcloning--alaboratorymanual(第2版)，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.)。或者，可通过例如用热苯酚或苯酚/氯仿/异戊醇有机萃取来完成rna与dna的分离。如果需要，可将rna酶抑制剂添加至溶解缓冲液。同样，对于某些细胞类型，可能需要向所述方案添加蛋白质变性/消化步骤。对于许多应用，希望相对于其他细胞rna(如转移rna(trna)和核糖体rna(rrna))富集mrna。大多数mrna在其3'端含有poly(a)尾。这允许它们通过亲和色谱法富集，例如使用偶联至固体支持体如纤维素或sephadex.r^tm.介质的oligo(dt)或poly(u)(参见ausubel等人(1994)currentprotocolsinmolecularbiology，第2卷，currentprotocolspublishing，newyork)。一旦结合，使用2mmedta/0.1％sds从亲和柱洗脱poly(a)+mrna。

可通过用于检测或测量(例如)核酸(例如，rna、mrna、基因组dna或cdna)和/或翻译的蛋白质的(例如)一种标志物或多种标志物的特征的各种熟知的方法中的任一种来评定例如在从测试受试者获得样品(例如，肿瘤活检)之后样品中的标志物的特征。此类方法的非限制性实例包括用于检测分泌的蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法，蛋白质纯化方法，蛋白质功能或活性测定，核酸杂交方法(任选地包括“错配裂解”步骤(myers，等人(1985)science230:1242)来消化错配的(即突变体或变体)区域以及分离和鉴别来自所得消化片段的突变体或变体)，核酸逆转录方法以及核酸扩增方法和扩增产物的分析。这些方法包括基因阵列/芯片技术、rt-pcr、基因表达测定(appliedbiosystems，fostercity，ca)(例如，在glp批准的实验室条件下)、原位杂交、免疫组织化学、免疫印迹、fish(荧光原位杂交)、facs分析、rna印迹、dna印迹、dna分析珠粒芯片(illumina，inc.，sandiego，ca)、定量pcr、细菌人工染色体阵列、单核苷酸多态性(snp)阵列(affymetrix，santaclara，ca)或细胞遗传学分析。

用于检测两种核酸之间的至少一个核苷酸的差异的技术的实例包括但不限于选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸。例如，可制备寡核苷酸探针，其中将已知的多态性核苷酸置于中心位置(等位基因或突变体特异性探针)，且然后在仅发现完美匹配的情况下允许杂交的条件下与靶dna杂交(saiki等人(1986)nature324:163)；saiki等人(1989)proc.natlacad.sciusa86:6230；以及wallace等人(1979)nucl.acidsres.6:3543)。这种等位基因特异性寡核苷酸杂交技术可用于同时检测n-ras的不同多态性或突变区域中的若干核苷酸变化。例如，将具有特定等位基因变体或突变体的核苷酸序列的寡核苷酸连接至固体支持体(例如杂交膜)上，且然后将所述支持体(例如膜)与标记的样品核酸杂交。因此，杂交信号的分析可揭示样品核酸的核苷酸的身份。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。尽管可在本公开的实践或测试中使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但本文描述优选的方法、装置和材料。本文提及的所有出版物出于描述和公开在出版物中报道的可与本公开结合使用的材料和方法的目的以引用的方式整体并入本文。

实施例

定义

实施例1：使用纯化的raf激酶同种型进行的激酶抑制测定

使用如在wo2009/006389中描述的生物化学荧光共振能量转移(fret)测定来测定化合物a的激酶活性。化合物a对突变体b-rafv600e、野生型b-raf和野生型c-raf激酶的半数最大抑制浓度(ic50)值在以下表1中示出。化合物a与b-raf激酶的无活性的dfg-向外构象结合。

表1.

实施例2：在nras突变的sk-mel-2人黑色素瘤异种移植模型中的体内肿瘤功效

将8周龄的雌性无胸腺ncr-nu/nu小鼠在右侧腹区域中用30-40mg肿瘤片段皮下接种，在体内传代中增殖。用游标卡尺监测肿瘤生长，并使用公式(0.5×[长度×宽度²])计算肿瘤体积。当平均肿瘤体积(mtv)达到大约167mm³(100-245mm³的)时，将动物随机分为12个处理组(n＝8只/组)。在肿瘤接种12天后开始向动物给予媒介物或测试化合物。处理的第一天被指定为第0天。

测试化合物

将化合物a配制在peg400中，并将所得悬浮液在温水浴中超声处理直到获得澄清溶液。对于较低剂量，将10mg/ml溶液用100％peg400稀释。

将阿立塞替钠配制在wfi中20％hpbcd的一半体积中，且然后用wfi中的2％碳酸氢钠稀释至最终体积(wfi中10％hpbcd/1％nahco3)。

将2种媒介物100％peg400(媒介物1)和wfi中的10％hpbcd/1％nahco3(媒介物2)同时施用(0.05ml/10gbw)至媒介物组中的小鼠。

肿瘤测量：

在处理的第一天开始每周两次测量肿瘤大小和体重。当动物的肿瘤达到大约2000mm3时将动物终止，并且研究在处理开始后的第62天终止。

通过计算在处理开始后第20天的tgi％(媒介物组的mtv-处理组的mtv)/媒介物组的mtv来确定肿瘤生长的抑制。使用关于δauc的线性混合效应回归分析来进行处理组与媒介物之间肿瘤生长的统计学比较。

用于评估功效的另外终点是：非特异性死亡、完全肿瘤应答和无肿瘤存活者(tfs)的数量，所述无肿瘤存活者被定义为在研究终止(在处理开始后第62天)前数据收集的最后一天观察不到可测量的肿瘤。完全应答(cr)被定义为肿瘤质量下降至不可检测的大小(＜32mm3)。

统计分析

使用线性混合效应回归模型评定媒介物对照组与处理组之间随时间推移的肿瘤生长趋势的差异。这些模型考虑到在多个时间点测量每只动物。将一种模型拟合以用于所述比较，并且使用从所述模型预测的值来计算对照组和处理组的肿瘤体积对时间曲线下面积(auc)。统计上显著的p值表明两组(媒介物和处理)随时间推移的趋势是不同的。

在log10转化之前，将所有肿瘤体积具有的值加1。将这些值在处理组之间进行比较以评定随时间推移的趋势差异是否是统计上显著的。为了比较多对处理组，使用最大似然法将以下混合效应线性回归模型拟合为数据：

yijk-yi0k＝yi0k+处理i+天j+天j²+(处理*天)ij(处理*天2)ij+eijk(1)

其中yijk是第i次处理中第k个动物的第j个时间点的log10肿瘤值，yi0k是第i次处理中第k个动物的第0天(基线)log10肿瘤值，天j是以中位数为中心的时间点且(连同天2j)被视为连续变量，并且eijk是残余误差。空间幂律协方差矩阵用于说明随时间推移关于同一动物的重复测量值。如果不是统计上显著的，则将相互作用项以及天2j项去除。

使用似然比检验来评定一对给定处理组是否展示统计上显著的差异。将完整模型的-2对数似然值与无任何处理项的模型(简化模型)进行比较，并且使用卡方检验来检验值的差异。所述检验的自由度被计算为完整模型的自由度与简化模型的自由度之间的差异。

从上述模型中获取log肿瘤值(yijk-yi0k，其可被解释为log10(从第0天的倍数变化))的预测差异以计算每个处理组的平均auc值。然后将dauc值计算为：

这假定aucctl为正数。在aucctl为负数的情况下，将上述公式乘以-1。

对于协同作用分析，使用log肿瘤值的观察到的差异来计算每只动物的auc值。在处理组中的动物从研究中除去时的情况下，最后观察到的肿瘤值结转通过所有随后时间点。使用来自上述成对模型的预测值计算对照或媒介物组的auc。协同作用的量度定义如下：

协同作用得分＝(平均值(fraca)+平均值(fracb)-平均值(fracab))*100(6)

其中ak和bk是单独处理组中的第k个动物，且abk是组合处理组中的第k个动物。aucctl是对照组的模型预测auc，并且被视为无变异性的常数。协同作用得分的标准误差被计算为a组、b组和ab组之间的标准误差平方和的平方根。使用welch-satterthwaite方程估计自由度。进行假设检验以确定协同作用得分是否与0不同。通过将协同作用得分除以其标准误差来计算p值，并用上述计算的自由度针对t-分布(双尾)进行检验。

作用被分为四个不同的类别。如果协同作用得分小于0则其被认为是协同的，并且如果协同作用得分与0没有统计学差异则其被认为是相加的。如果协同作用得分大于零，但组合的平均auc低于两种单一药剂处理中的最低平均auc，则所述组合是次相加的。如果协同作用得分大于零，并且组合的平均auc大于单一试剂处理中的至少一种的平均auc，则所述组合是拮抗性的。

如果需要，区间分析涉及与另一处理组和时间间隔相比较的指定处理组和时间间隔。对于给定组、时间间隔和动物，通过以下估计每天的肿瘤生长速率

速度＝100*(10^δγ/δt-1)(7)

其中δy是目标区间内log10肿瘤体积的差异，并且□t是时间间隔的长度。如果一个或两个时间点缺失，则所述动物被忽略。然后将动物间的平均速率与使用具有不等方差的双侧未配对t检验进行比较。对于多次比较和所检查的终点，不存在预先规定的调整。所有p值<0.05被称为统计上显著的。协同分析：p>0.05＝相加；p<0.05且得分<0＝协同；p<0.05，得分>0且组合生长速率低于两个单一药剂生长速率＝次相加；p<0.05，得分>0且组合生长速率高于单一药剂生长速率中的至少一个＝拮抗。

结果

使用如在上述方法中所描述进行的小鼠异种移植模型来评定化合物a和阿立塞替的体内组合效应。此研究的细节在以下表2中示出。表2中针对阿立塞替列出的剂量是游离化合物的量。

表2.结果总结

组合分析的总结在表3中提供。当与媒介物组相比时，组合处理组中的每个在携带sk-mel-2人黑色素瘤异种移植物的小鼠中具有显著抗肿瘤活性(δauc，p<0.001)。

与化合物a(12.5mg/kgqd或50mg/kgbiw)和阿立塞替(20mg/kgqd；tgi分别＝80.1％或73.1％)组合处理抑制肿瘤生长超过单一药剂治疗，并且协同作用分析表明，当化合物a每日一次处理时化合物a和阿立塞替的相互作用是相加的，但当化合物a每周两次处理时化合物a和阿立塞替的相互作用是次相加的。每组的mtv在图1和2中以图形方式表示。

表3.组合分析

实施例3：在b-raf突变的人黑色素瘤异种移植模型中的体内肿瘤功效

将每只动物用3x106个a375肿瘤细胞(0.1ml中，与基质胶1:1)接种到右侧腹中用于肿瘤模型开发。每周两次监测体重和肿瘤生长。使用游标卡尺并应用公式v＝w2xl/2将肿瘤大小测量到最接近0.1mm，其中v＝体积，w＝宽度且l＝肿瘤异种移植物的长度。允许异种移植物生长直到它们在接种后11天达到大约195mm3的平均大小。将携带适当大小的异种移植物的小鼠随机分配到十二组中的一组，并开始用其指定的测试材料，媒介物(100％peg400和/或wfi中10％hpβcd+1％nahco3)和/或测试物品处理：化合物a(12.5或50mg/kg)、阿立塞替(10或20mg/kg)或化合物a/阿立塞替的组合处理。

测试化合物

将化合物a配制在100％peg400(媒介物1)中。制备化合物a并在室温(18℃至25℃)下储存。

将阿立塞替钠配制在注射用水(wfi)中的10％hpβcd加1％nahco3(媒介物2)中。制备阿立塞替并在室温(18℃至25℃)下储存。

媒介物处理组中的动物被给予媒介物1和媒介物2。

媒介物或化合物的剂量体积是5ml/kg体重。

肿瘤测量

从动物分组当天(例如，第0天)开始每周两次测量肿瘤大小和体重。当动物的肿瘤达到大约2000mm3时将动物终止，并且研究在处理开始后的第38天终止。

通过计算在处理开始后第21天的tgi％(媒介物组的mtv-处理组的mtv)/媒介物组的mtv]来确定肿瘤生长的抑制。使用关于δauc的线性混合效应回归分析来进行处理组与媒介物之间肿瘤生长的统计学比较。

统计分析

如实施例2中所描述来进行统计分析。

结果

使用如在上述方法中所描述进行的小鼠异种移植模型来评定化合物a和阿立塞替的体内组合效应。此研究的细节在以下表4中示出。针对阿立塞替列出的剂量是游离化合物的量。

化合物a(12.5mg/kg，qd)和阿立塞替的组合物作用是相加的，而化合物a(50mg/kg，biw)和阿立塞替的组合作用是协同的。

表4.结果总结

实施例4：用于测量标志物的方法

基于b-rafpcr的测定(供应商：qiagen；目录#：870801)

b-rafrgqpcr试剂盒v2结合两种技术和以检测实时pcr测定中的突变。这种测定检测b-rafv600突变v600e(gag)和v600e复合物(gaa)、v600d(gat)、v600k(aag)、v600r(agg)。所述试剂盒检测到v600e(gag)和v600e复合物(gaa)的存在，但不能区分它们。

arms

通过被设计用于匹配突变dna的等位基因特异性引物来选择性地扩增特异性突变序列。

scorpions

使用scorpions进行扩增检测。scorpions是与荧光标记的探针(即fam^tm或hex^tm)和淬灭剂共价连接的pcr引物。在pcr期间，当所述探针与扩增子结合时，荧光团和淬灭剂变得分离，从而导致荧光信号的增加。

步骤

b-rafrgqpcr试剂盒v2包括两步程序。在第一步骤中，进行对照测定以评定样品中的总可扩增的b-rafdna。在第二步骤中，进行突变测定和对照测定两者来确定突变dna的存在或不存在。

·对照测定

用fam标记的对照测定用于评定样品中的总可扩增的b-rafdna。对照测定扩增b-raf基因的外显子3的区域。引物和scorpion探针被设计为独立于任何已知的b-raf多态性而扩增。

·突变测定

每个突变测定包含fam标记的scorpion探针和用于区分野生型dna和特异性突变dna的arms引物。

数据分析：δct方法

scorpion实时测定使用检测在背景信号以上的荧光信号所需的pcr循环次数作为在反应开始时存在的靶分子的量度。检测到在背景荧光以上的信号的点被称为“循环阈值”(ct)。

样品δct值被计算为来自同一样品的突变测定ct与对照测定ct之间的差异。如果样品的δct小于所述测定的截断δct值，则将所述样品分类为突变阳性。在所述值以上，样品含有少于通过所述试剂盒能够检测到的突变百分比(超出测定限制)，或者样品是突变阴性。

当使用arms引物时，可能发生一些无效的引发，从而从不含突变的dna得到非常晚的背景ct。从背景扩增计算的所有δct值都大于截断δct值，并且样品被分类为突变阴性。

对于每个样品，如下计算值，从而确保突变ct值和对照ct值来自同一样品：

δct＝{样品突变ct}–{样品对照ct}

样品对照ct可在27-33之间的范围内

样品突变ct可在15-40之间的范围内

突变体识别的可接受的δct是<6或7

用于测量n-ras突变的方法与以上针对b-raf描述的那些相似。用于检测n-rasq61突变的qiagenn-ras测定包括：

q61k(181c>a)

q61r(182a>g)

序列表

<110>bozon,viviana

米伦纽姆医药公司

<120>药物制剂、其制备方法以及其使用方法

<130>mpi14-027p1nwo

<150>us62/096,020

<151>2014-12-23

<160>6

<170>用于windows4.0版的fastseq

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